CN110024696B

CN110024696B - 黄盖小脆柄菇及在制备天然抑菌剂中的应用

Info

Publication number: CN110024696B
Application number: CN201910174868.6A
Authority: CN
Inventors: 杨胜利; 潘芸; 张慧; 杨锡; 邵泽辉; 陈萍
Original assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Current assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Priority date: 2019-03-08
Filing date: 2019-03-08
Publication date: 2021-02-02
Anticipated expiration: 2039-03-08
Also published as: CN110024696A

Abstract

本发明公开了一种黄盖小脆柄菇Gb.PY‑F1及在制备抑菌剂中的应用，所述抑菌剂是黄盖小脆柄菇Gb.PY‑F1经发酵培养获得的发酵液超声破碎后抽滤，取滤液经微孔滤膜过滤后浓缩，再用乙酸乙酯萃取，浓缩至恒重，获得黄盖小脆柄菇Gb.PY‑F1发酵粗产物，粗产物再经硅胶柱层析，收集含目标组分的流出液，即为抑菌剂。该天然抑菌剂对金黄色葡萄球菌CMCC(B)26003的MIC＝0.7812mg/mL，抑菌剂主要成分含有芳环以及羧基结构。

Description

黄盖小脆柄菇及在制备天然抑菌剂中的应用

(一)技术领域

本发明涉及一种金黄色葡萄球菌抑菌剂，具体涉及一种黄盖小脆柄菇及在制备抗金黄色葡萄球菌药物的应用。

(二)背景技术

植物内生菌是指那些在其生活史的一定阶段或全部阶段生活于健康植物的各种组织和器官内部的真菌或细菌，包括内生真菌和内生细菌。近年来，国内陆续报道了从多种药用植物中已分离获得了产生多种药理活性物质的内生菌。银杏作为一种古老的药用植物，素有“活化石”之称，其具有抗肿瘤、抑菌等多种药理活性。目前，银杏等其他物种资源都非常匮乏，如果大量地采伐又涉及到生态和环境等领域的问题。因此，寻找一种可以高效低耗地开发利用天然药物的方法日益重要药用植物内生菌也因此成为研究热点。

(三)发明内容

本发明目的是提供一种黄盖小脆柄菇Gb.PY-F1及在制备天然抑菌剂中的应用。

本发明采用的技术方案是：

本发明提供一种黄盖小脆柄菇(Psathyrella candolleana)，Gb.PY-F1，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC M 2019125，保藏日期为2019年3月 6日，保藏地址：中国武汉武汉大学，邮编：430072。本发明所述黄盖小脆柄菇Gb.PY-F1，菌落呈黄白色放射状，干燥，产大量肉眼可见黄色色素，菌落老化后成浅黄棕色。

本发明还提供一种所述黄盖小脆柄菇Gb.PY-F1在制备天然抑菌剂中的应用，所述抑菌剂为金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)抑菌剂，优选金黄色葡萄球菌 CMCC(B)26003。

进一步，所述天然抑菌剂是黄盖小脆柄菇Gb.PY-F1经发酵培养获得的发酵液超声破碎后抽滤，取滤液经微孔滤膜过滤后浓缩(优选1/3体积)，再用乙酸乙酯萃取 (优选至乙酸乙酯相肉眼观察无明显颜色变化，合并乙酸乙酯萃取相)，有机相浓缩至恒重，获得黄盖小脆柄菇Gb.PY-F1发酵粗产物，粗产物再经硅胶柱层析，收集Rf 值为0.4的流出液，展开剂为石油醚：乙酸乙酯＝1：6(v/v)，即为天然抑菌剂。

进一步，所述超声破碎条件为：在405W条件下，每工作3s，间歇4s，进行300 次循环。

更进一步，所述天然抑菌剂按如下方法制备：(1)将黄盖小脆柄菇Gb.PY-F1接种于发酵培养基中，28℃，180r/min培养7d，获得发酵液；将发酵液超声破碎后抽滤，取滤液经微孔滤膜过滤后浓缩至原体积的1/3，用1倍体积乙酸乙酯萃取至乙酸乙酯相肉眼观察无明显颜色变化，合并乙酸乙酯萃取相，浓缩至恒重，获得黄盖小脆柄菇Gb.PY-F1发酵粗产物；所述发酵培养基组成：硝酸钠3g/L，磷酸氢二钾1g/L，硫酸镁(MgSO₄·7H₂O)0.5g/L，氯化钾0.5g/L，硫酸亚铁0.01g/L，蔗糖30g/L，溶剂为蒸馏水，pH7.0～7.2；利用高压蒸汽灭菌锅对其进行灭菌，条件为121℃，20分钟； (2)将黄盖小脆柄菇Gb.PY-F1发酵粗产物用微量乙酸乙酯溶解，加入硅胶(200～ 300目)，研磨均匀后，置于减压真空干燥器中干燥，即为吸附样品的硅胶，所述硅胶与发酵粗产物质量比为1.5：1；将吸附样品的硅胶上样于硅胶色谱柱(优选6cm*60cm) 中，装柱量3/4，采用体积比100-0:0-100(优选100:0、90:10、80:20、70:30、60:40、 50:50、40:60、30:70、20:80、10:90、0:100，v/v)的石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱，收集体积比30:70石油醚-乙酸乙酯的流出液，记为样品Gf.8；(3)样品Gf.8用少量乙酸乙酯溶解，加入硅胶，研磨均匀后，真空干燥，即为吸附样品Gf.8的硅胶，所述硅胶与样品Gf.8质量比为1.5：1，将吸附样品Gf.8的硅胶上样于新硅胶色谱柱中，再以乙酸乙酯-甲醇(v:v＝75:15)为流动相洗脱，收集第13个柱体积的流出液，记为组分Gf.8-13；(4)组分Gf.8-13用凝胶Sephadex LH-20以甲醇为洗脱剂进行柱分离，流速为1drop/s，薄层硅胶板跟踪检测，展开剂为：石油醚：乙酸乙酯＝1：6(v/v)，收集Rf值为0.4的组分，记为组分Gf.8-13a；(5)组分Gf.8-13a经甲醇溶解重结晶，晶体干燥得到白色固体，获得黄盖小脆柄菇Gb.PY-F1发酵产物，即为抑菌剂。

进一步，步骤(1)所述黄盖小脆柄菇Gb.PY-F1发酵前先进行活化，所述活化方法为：黄盖小脆柄菇Gb.PY-F1接种于PDA培养基中，置于28℃恒温培养箱中培养7 d；PDA培养基组成：马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L，琼脂15～20g/L，溶剂为蒸馏水，自然pH。

与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在：本发明提供一种新菌株-黄盖小脆柄菇Gb.PY-F1及在制备天然抑菌剂中的应用，本发明黄盖小脆柄菇Gb.PY-F1发酵产物对金黄色葡萄球菌CMCC(B)26003的MIC＝0.7812mg/mL。

(四)附图说明

图1为Gb.PY-F1系统发育树。

图2为黄盖小脆柄菇Gb.PY-F1发酵产物对金黄色球菌的抑菌能力，1：1.56mg/mL；2：0.78mg/mL；3：0.39mg/mL。

图3为实施例2中黄盖小脆柄菇Gb.PY-F1发酵产物的¹H-NMR图谱。

图4为实施例2中黄盖小脆柄菇Gb.PY-F1发酵产物的¹³C-NMR图谱。

图5为实施例2中黄盖小脆柄菇Gb.PY-F1发酵产物的MS图谱。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

本发明所述银杏(学名：Ginkgo biloba L.)，为银杏科、银杏属落叶乔木。银杏树的种子俗称白果，因此银杏又名白果树。

本发明所述超纯水是指电阻率达到18MΩ*cm(25℃)的水。水中除了水分子外，几乎没有什么杂质，更没有细菌、病毒、含氯二噁英等有机物，也没有人体所需的矿物质微量元素。

实施例1：黄盖小脆柄菇Gb.PY-F1的分离

1.植物样本采集：新鲜健康的银杏果采于江苏省无锡市惠山大道，银杏果用自来水清洗10分钟，然后用体积浓度75％乙醇水溶液漂洗一次。用质量浓度2％次氯酸钠水溶液浸泡10分钟后，用无菌水反复洗涤种子，再用体积浓度75％乙醇水溶液浸泡15分钟，然后用无菌水漂洗三次，合并漂洗液，用干燥的无菌吸收纸吸去表面水分，获得表面消毒后的银杏果。在超净工作台中，放置PDA培养基的无菌平板作为空白对照1，用于检查超净工作台的洁净程度；将漂洗液接种于PDA培养基的无菌平板作为空白对照2，用于漂洗液的检查；将表面消毒后的银杏果，置于PDA培养基的无菌平板中滚一圈后取出，作为空白对照3，用于植物组织印迹法筛选无菌的组织块。

2.黄盖小脆柄菇的筛选以及分离纯化：于无菌超净工作台，将步骤1中表面消毒后的银杏果从中间切成薄片，作为无菌组织，然后接种在PDA培养基中，在30℃倒置培养，待出现菌丝沿着组织切口向外生长时，与空白对照1、2以及3均进行比较，采用尖端菌丝挑选的方法，将不同形态的菌落划线接种于PDA培养基中，待长出单菌落后，将单菌落再次划线接种于无菌PDA培养基中，反复多次接种，直到菌落形态一致且只有一种内生真菌生长时说明纯化完成，得到1株真菌菌株，该菌株为菌落呈白色放射状，干燥，产大量肉眼可见黄色色素，菌落老化后成浅黄棕色，无肉眼可见孢子，菌落背面为深黄色，记为菌株Gb.PY-F1。

PDA培养基组成：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂15～20g，蒸馏水1000mL，自然pH。

3.总DNA的提取：将菌株Gb.PY-F1接种于PDA培养基中，于30℃恒温培养箱中倒置培养5d，采用真菌基因组DNA快速抽提试剂盒(购自生工生物工程(上海) 股份有限公司，产品编号：B518229)以及相关操作说明提取基因组DNA：①取50-100 mg新鲜真菌或20mg干燥子实体或菌丝，液氮中充分研磨成粉末后放入到1.5mL离心管中，依次加入400μL BufferDigestion和4μlβ-巯基乙醇，震荡混匀。65℃水浴 1h至细胞完全裂解。②加入200μlBuffer PF，充分颠倒混匀，-20℃冰箱放置5min。。③室温10000rpm离心5min，将上清液(500～550μl)转移到新的1.5ml离心管中。④加入等体积的异丙醇，颠倒5～8次使之充分混匀，室温放置2～3min。室温10000 rpm离心5min，弃上清。⑤加入1ml 75％乙醇，颠倒漂洗1～3min，10,000rpm离心 2min，弃上清。⑥重复步骤⑤一次。⑦开盖室温倒置5～10min至残留的乙醇完全挥发。⑧得到的DNA用50-100μl TE Buffer溶解。提取的DNA可立即进行下一步实验或-20℃保存。

4.菌株Gb.PY-F1的ITS序列扩增：采用真菌扩增通用引物ITS1 (5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGC-3’)和ITS4(5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’) 扩增内部转录区间序列，反应体系如下：

DNA模板1μL、上游引物1μL、下游引物1μL、PCRMix 12.5μL、ddH₂O 9.5μL。

PCR扩增程序：94℃预变性5min，94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min， 35个循环，72℃延伸10min，4℃低温保存。

5.PCR反应产物确认：取5μL PCR产物与1μL DAN Green染料混合后点样于 1.2％琼脂糖凝胶，110V条件下电泳15分钟，于凝胶成像系统中观察条带，如出现 500bp左右条带，则初步判断扩增成功。

6.PCR反应产物测序：将PCR产物送样生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序，菌株Gb.PY-F1的ITS序列见SEQ ID NO.1所示。

7.数据分析：用Blast比对将菌株Gb.PY-F1的序列与GenBank中的序列进行同源性比对，BLAST检索表明，菌株Gb.PY-F1的ITS序列与黄盖小脆柄菇(Psathyrellacandolleana)(GenBank登录号AB470877.1)的序列相似度为99％，绘制系统发育树见图1所示。由图1可知支持率为97％，根据基因亲缘性对比，确定菌株Gb.PY-F1 为小脆柄菇(Psathyrella)属，命名为黄盖小脆柄菇(Psathyrella candolleana)Gb.PY-F1，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC M 2019125，保藏日期为2019 年3月6日。

实施例2：黄盖小脆柄菇Gb.PY-F1发酵产物Gf.8-13的分离

1、菌株复苏活化：将保存在4℃冰箱中的黄盖小脆柄菇Gb.PY-F1接种于PDA 培养基中，置于28℃恒温培养箱中培养7d；

2、黄盖小脆柄菇Gb.PY-F1发酵产物的制备：在超净工作台中，用无菌打孔器将步骤1的Gb.PY-F1菌株沿着菌落边缘打直径为5mm的菌饼，接种于含200mL发酵培养基的500mL锥形瓶中，28℃，180r/min培养7d，以未接种菌饼的发酵培养基为空白对照。取发酵完成的发酵液，采用JY92-IIDN型超声波细胞粉碎机在405W条件下，每工作3s，间歇4s，进行300次循环对发酵液进超声破壁处理，然后抽滤得滤液，经孔径为0.45μm的微孔滤膜过滤后，微滤液利用旋转蒸发仪浓缩至原体积的1/3，获得浓缩液；再用1倍体积乙酸乙酯对浓缩液进行多次萃取，直至乙酸乙酯相肉眼观察无明显颜色变化，合并乙酸乙酯萃取相，再次利用旋转蒸发仪浓缩干燥至恒重，获得黄盖小脆柄菇Gb.PY-F1发酵粗产物(简称：Gb-1Ea)32.264g，于-20℃保存。

所述发酵培养基组成：硝酸钠3g/L，磷酸氢二钾1g/L，硫酸镁(MgSO₄·7H₂O) 0.5g/L，氯化钾0.5g/L，硫酸亚铁0.01g/L，蔗糖30g/L，溶剂为蒸馏水，pH7.0～7.2；利用高压蒸汽灭菌锅对其进行灭菌，条件为121℃，20分钟。

3、分离纯化Gb.PY-F1发酵粗产物Gf.8-13：(1)称取10克Gb-1Ea，用5-10mL 乙酸乙酯溶解，加入15克硅胶(200～300目)，研磨均匀后，置于减压真空干燥器中干燥，即为吸附样品的硅胶。将吸附样品的硅胶上样于硅胶色谱柱(6cm*60cm)中，装柱量3/4，采用石油醚-乙酸乙酯(100:0、90:10、80:20、70:30、60:40、50:50、40:60、 30:70、20:80、10:90、0:100，v/v)梯度洗脱，分别得到Gf.1～11个组分。将体积比 30:70石油醚-乙酸乙酯的流出液浓缩至干，记为样品Gf.8；(2)样品Gf.8用少量乙酸乙酯溶解，加入硅胶，研磨均匀后，真空干燥，即为吸附样品Gf.8的硅胶，所述硅胶与样品Gf.8质量比为1.5：1，将吸附样品Gf.8的硅胶上样于新硅胶色谱柱中，再以体积比75:15的乙酸乙酯-甲醇为流动相洗脱，收集第13个柱体积的流出液，记为样品Gf.8-13；(3)样品Gf.8-13用凝胶Sephadex LH-20以甲醇为洗脱剂进行柱分离，流速为1drop/s，每50mL收集一份，点样于薄层硅胶板进行层析，展开剂为石油醚：乙酸乙酯＝1：6(v/v)，具有相同Rf值的组分合并，得到Rf值分别为0.1、0.4以及0.9的3个组分，其中Rf值分别为0.1和0.9的2个组分在254nm波长下无吸收，Rf 值为0.4的1组分有吸收，将Rf值为0.4的组分记为组分Gf.8-13a；(5)组分Gf.8-13a 经甲醇溶解重结晶得到白色固体49.5mg，即为黄盖小脆柄菇Gb.PY-F1发酵产物(记为发酵产物Gf.8-13a)，溶于氘代氯仿中，进行核磁波普以及质谱分析，结果见于图 3-5，可知Gb.PY-F1发酵产物中主要成分含有芳环以及羧基结构。

实施例3：黄盖小脆柄菇Gb.PY-F1的发酵产物对金黄色葡萄球菌抑制能的测定将金黄色葡萄球菌(CMCC(B)26003，南京茂捷微生物科技有限公司)，在超净工作台中接种于含LB固体培养基的无菌平板中进行活化(37℃，24h)，将活化后的金黄色葡萄球菌CMCC(B)26003，取一环接种于含有LB液体培养基(50mL)的无菌锥形瓶(250mL)中进行培养(37℃，180r/min，24h)，用无菌水将菌液进行稀释使得菌悬液浓度为10⁶cfu/mL备用。

黄盖小脆柄菇Gb.PY-F1发酵产物对金黄色葡萄球菌的最低抑制浓度测定：称取实施例2获得的25mg黄盖小脆柄菇发酵产物Gf.8-13a，溶于1mL DMSO中，配置 25mg/mL的样品储备液。在超净工作台中，储备液经微孔滤膜(0.22μm)过滤后，用无菌水稀释得到不同浓度(6.25，3.125，1.5625，0.7812，0.3906，0.1953mg/mL) 的样品。在无菌条件下，将牛津杯放置在无菌平皿中后倒入无菌LB培养基；取另一瓶无菌LB培养基，待其温度冷却至45℃左右，以体积浓度1％的接种量将供试菌(金黄色葡萄球菌CMCC(B)26003)接种于其中，摇匀后，倒入已放置牛津杯且底层无菌 LB培养基已经凝固的培养皿中，待其冷却凝固用镊子将牛津杯取出后，在孔中加入 150μL不同浓度的样品，分别以DMSO和无菌超纯水为空白对照，以1.500mg/mL 卡那霉素水溶液为阳性对照，将平皿置于37℃恒温培养箱中培养1d，观察黄盖小脆柄菇Gb.PY-F1发酵产物对金黄色葡萄球菌CMCC(B)26003的抑制效果，各浓度样品透明抑菌圈的直径见表1所示，空白对照透明圈直径均小于等于8mm，阳性对照透明圈直径均值为17.2mm，当透明圈直径大于8mm则说明该菌株发酵液中含有抑菌活性成分，小于等于8mm则说明该浓度发酵液中没有抑菌效果，每组实验重复操作3 次，结果：MIC＝0.7812mg/mL。LB液体培养基组成：胰化蛋白胨10g，酵母提取物 5g，NaCl 10g，pH7.0，ddH₂O定容至1L。

表1

样品浓度mg/mL	透明圈平均直径mm
		6.25	24.8
3.125	23.5
		1.5625	19.8
0.7812	16.3
		0.3906	8
0.1953	8

序列表

<110> 浙江工业大学

<120> 黄盖小脆柄菇及在制备天然抑菌剂中的应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 679

<212> DNA

<213> 黄盖小脆柄菇(Psathyrella candolleana)

<400> 1

tgatatgctt aagttcagcg ggtagtccta cctgatttga ggtcaaattg gtcaagtaaa 60

ttgtccttgc ggacggttag aagcaagcat gagtccaatc cacggcgtag ataattatca 120

caccaataga cggaagctca atatgagctc gctaatgcat ttcaggagag cagaccagca 180

ctgaggcagc ctgcaaaacc cccacatcca agcctacacc tgtctcgtta caaaactggt 240

gaggttgaga atttaatgac actcaaacag gcatgctcct cggaatacca aggagcgcaa 300

ggtgcgttca aagattcgat gattcactga attctgcaat tcacattact tatcgcattt 360

cgctgcgttc ttcatcgatg cgagagccaa gagatccgtt gctgaaagtt gtatagtttt 420

ttataggcat gaaagcccat tgactacatt ctaaatcatt caaatggggt gtgtaaaaga 480

catagaacct ggaaattcaa agagagccgg cctagtcggc gcagcaatcc ttgcatccgc 540

tttgctgcca aagcgagggg tatccaggcc tacacatggt tcacaggtgg aaagatgata 600

tgaatgacgg gcgtgcacaa tgctcctagg agccagctac aaccaacgcc atagatattc 660

gataatgatc cttccgcag 679

Claims

1.一种黄盖小脆柄菇(Psathyrella candolleana)Gb.PY-F1，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC M 2019125，保藏日期为2019年3月6日，保藏地址：中国武汉武汉大学，邮编：430072。

2.一种权利要求1所述黄盖小脆柄菇Gb.PY-F1在制备天然抑菌剂中的应用，其特征在于所述天然抑菌剂为金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)CMCC(B)26003抑菌剂。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述天然抑菌剂是黄盖小脆柄菇Gb.PY-F1经发酵培养获得的发酵液超声破碎后抽滤，取滤液经微孔滤膜过滤后浓缩，再用乙酸乙酯萃取，有机相浓缩至恒重，获得黄盖小脆柄菇Gb.PY-F1发酵粗产物，粗产物再经硅胶柱层析，收集Rf值为0.4的流出液，即为抑菌剂。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述超声破碎条件为：在405W条件下，每工作3s，间歇4s，进行300次循环。

5.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述天然抑菌剂按如下方法制备：(1)将黄盖小脆柄菇Gb.PY-F1接种于发酵培养基中，28℃，180r/min培养7d，获得发酵液；将发酵液超声破碎后抽滤，取滤液经微孔滤膜过滤后浓缩至原体积的1/3，用1倍体积乙酸乙酯萃取至乙酸乙酯相肉眼观察无明显颜色变化，合并乙酸乙酯萃取相，浓缩至恒重，获得黄盖小脆柄菇Gb.PY-F1发酵粗产物；所述发酵培养基组成：硝酸钠3g/L，磷酸氢二钾1g/L，硫酸镁0.5g/L，氯化钾0.5g/L，硫酸亚铁0.01g/L，蔗糖30g/L，溶剂为蒸馏水，pH7.0～7.2；(2)将黄盖小脆柄菇Gb.PY-F1发酵粗产物用乙酸乙酯溶解，加入硅胶，研磨均匀后，真空干燥，即为吸附样品的硅胶；将吸附样品的硅胶上样于硅胶色谱柱中，采用体积比100-0:0-100的石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱，收集体积比30:70石油醚-乙酸乙酯的流出液，将其浓缩至干，记为样品Gf.8；(3)样品Gf.8用乙酸乙酯溶解，加入硅胶，研磨均匀后，真空干燥，即为吸附样品Gf.8的硅胶，将吸附样品Gf.8的硅胶上样于硅胶色谱柱中，再以体积比75:15的乙酸乙酯-甲醇为流动相洗脱，收集第13个柱体积的流出液，记为组分Gf.8-13；(4)组分Gf.8-13用凝胶Sephadex LH-20以甲醇为洗脱剂进行柱分离，流速为1drop/s，收集Rf值为0.4的组分，记为组分Gf.8-13a；(5)组分Gf.8-13a经甲醇溶解重结晶，晶体干燥，获得黄盖小脆柄菇Gb.PY-F1发酵产物，即为抑菌剂。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于步骤(1)所述黄盖小脆柄菇Gb.PY-F1发酵前先进行活化，所述活化方法为：黄盖小脆柄菇Gb.PY-F1接种于PDA培养基中，置于28℃恒温培养箱中培养7d；PDA培养基组成：马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L，琼脂15～20g/L，溶剂为蒸馏水，自然pH。

7.如权利要求5所述的应用，其特征在于步骤(2)所述硅胶与发酵粗产物质量比为1.5：1。

8.如权利要求5所述的应用，其特征在于步骤(3)所述硅胶与样品Gf.8质量比为1.5：1。