CN114605247B - 一种二萜类衍生物及其制备方法与镇痛药物、小脆柄菇发酵得物及其乙酸乙酯萃取液 - Google Patents

一种二萜类衍生物及其制备方法与镇痛药物、小脆柄菇发酵得物及其乙酸乙酯萃取液 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种二萜类衍生物及其制备方法与镇痛药物、小脆柄菇发酵得物及其乙酸乙酯萃取液，属于医药化学技术领域。该二萜类衍生物为化合物1至化合物10中的任意一种，上述二萜类衍生物的制备方法是将经小脆柄菇的发酵得物经乙酸乙酯萃取后所得的乙酸乙酯萃取液进行硅胶柱层析，随后再经过中压液相色谱分离，将所得的子组分按不同的洗脱和分离方式进行制备，所得的二萜类衍生物纯度高，具有一定的镇痛活性。此外，本申请的制备原料包括上述二萜类衍生物的镇痛药物具有较高效的镇痛效果，其镇痛活性与临床广泛使用的镇痛药物吗啡相当。

Description

一种二萜类衍生物及其制备方法与镇痛药物、小脆柄菇发酵 得物及其乙酸乙酯萃取液
技术领域
本发明涉及医药化学技术领域，具体而言，涉及一种二萜类衍生物及其制备方法与镇痛药物、小脆柄菇发酵得物及其乙酸乙酯萃取液。
背景技术
国际疼痛研究学会在2020年重新将疼痛定义为：与实际或潜在组织损伤相关，或类似的令人不愉快的感觉和情感体验。这一新的定义着重强调了疼痛的复杂性(与实际或潜在的组织损伤有关)。世界卫生组织估计，全球约30％的成年人长期忍受疼痛的折磨。疼痛不仅会影响患者的睡眠、食欲，还会改变患者的精神状况以及心理健康等，严重降低患者的生活质量。由于疼痛的类型多样、机制复制，其治疗难度相对较大。目前常见的治疗方法包括物理治疗和药物治疗。
临床实践中物理治疗疗效十分有限，一般慢性疼痛大多数需要长期用药，要常用的镇痛药物(非甾体类抗炎药、阿片类等)副作用较多，因此开发一种更加安全有效的镇痛药物一直是疼痛领域研究的热点话题。近年来，随着天然药物的发展，天然产物被认为是研究潜在新药的重要来源，具有研发治疗急性和慢性疼痛新药的广阔前景。
guanacastane二萜类衍生物，有着独特的5/7/6三环碳骨架，是一种主要存在于真菌中天然产生的二萜类化合物的一个小家族。自2000年科学家们从Daphnopsis americana树支上的真菌提取物中分离出第一个guanacastane二萜guanacastepene A以来，已鉴定出超过74种天然存在的guanacastane二萜类衍生物，其中一些化合物具有多种生物活性，包括抗菌、抗真菌、细胞毒活性。这种独特的5/7/6三环碳骨架和良好的生物活性也引起了合成化学家的广泛关注。但因其少量的存在，对其生物活性的研究并不全面。
目前，虽国内外学者内外学者对guanacastane二萜类衍生物及其应用研究取得了一定进展，但还需要进行深入研究。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的之一在于提供10种首次从小脆柄菇发酵得到的发酵得物中分离出的全新二萜类衍生物。
本发明的目的之二在于提供一种上述二萜类衍生物的制备方法。
本发明的目的之三在于提供一种经上述制备方法得到的发酵得物和/或乙酸乙酯萃取液。
本发明的目的之四在于提供一种制备原料包括上述二萜类衍生物、发酵得物或乙酸乙酯萃取液。
本申请可这样实现：
第一方面，本申请提供一种二萜类衍生物，该二萜类衍生物为化合物1至化合物10中的任意一种，化合物1至化合物10的化学结构式依次为：
Figure BDA0003560006090000021
Figure BDA0003560006090000031
第二方面，本申请提供如前述实施方式的二萜类衍生物的制备方法，包括以下步骤：
将小脆柄菇的发酵得物经乙酸乙酯萃取后所得的乙酸乙酯萃取液进行硅胶柱层析，硅胶柱层析的条件包括：以氯仿-甲醇为洗脱剂，按氯仿与甲醇的体积比依次为100:0、18-22:1、8-12:1、4-6:1以及0:1的比例进行梯度洗脱；
将第二个梯度对应的洗脱组分进行中压液相色谱分离，中压液相色谱分离条件包括：以甲醇-水为洗脱剂，按甲醇与水的体积比依次为15:85-25:75、35:65-45:55、55:45-65:35、75:25-25:75以及100:0的比例进行梯度洗脱，每个梯度所用的洗脱剂体积为1500-2000mL，将洗脱液按每400-500mL进行单独收集并进行薄层色谱检测，合并显色一致的组分，得到子组分B1至子组分B10；
随后根据所需得到的化合物按照以下对应的方式进行制备：
(a)、将子组分B2依次进行正相硅胶柱色谱等度洗脱和高效液相色谱分离，得到化合物2和化合物3；
(b)、将子组分B4依次进行凝胶柱色谱等度洗脱以及高效液相色谱分离，得到化合物1、化合物6和化合物7；
(c)、将子组分B5依次进行凝胶柱色谱等度洗脱和高效液相色谱分离，得到化合物10、化合物8和化合物9；
(d)、将子组分B6进行高效液相色谱分离，得到化合物4和化合物5。
在可选的实施方式中，乙酸乙酯萃取液硅胶柱层析过程中，洗脱流速为18-22mL/min，每个梯度所用的洗脱剂的体积均为1500-2000mL。
在可选的实施方式中，中压液相色谱分离过程中，流速为35-45mL/min。
在可选的实施方式中，子组分B2的正相硅胶柱色谱等度洗脱条件包括：以体积比为6-8:1的石油醚和丙酮作为洗脱剂，洗脱流速为5.5-6.5mL/min，洗脱时间为40min；
随后进行的高效液相色谱的条件包括：以乙腈-水作为洗脱剂，按体积比为15:85-25:75至30:70-40:60进行梯度洗脱，流速为3.5-4.5mL/min，洗脱时间为40min。
在可选的实施方式中，子组分B4的凝胶柱色谱等度洗脱条件包括：以纯甲醇作为洗脱剂，洗脱流速为1.5-2.5mL/min，洗脱时间为240min；
随后进行的高效液相色谱的条件包括：以乙腈-水作为洗脱剂，按体积比为15:85-22:78至25:75-35:65进行梯度洗脱，流速为3.5-4.5mL/min，洗脱时间为30-40min。
在可选的实施方式中，子组分B5的凝胶柱色谱等度洗脱条件包括：以纯甲醇作为洗脱剂，洗脱流速为1-2mL/min，洗脱时间为120-360min；
随后进行的高效液相色谱的条件包括：以乙腈-水作为洗脱剂，按体积比为15:85-20:80至30:70-40:60进行梯度洗脱，流速为3.5-4.5mL/min，洗脱时间为35-55min。
在可选的实施方式中，子组分B6的高效液相色谱的条件包括：以乙腈-水作为洗脱剂，按体积比为15:85-25:75进行等度洗脱，流速为3.5-4.5mL/min，洗脱时间为35-55min。
在可选的实施方式中，发酵得物包括小脆柄菇发酵后的发酵液和固态菌丝体。
在可选的实施方式中，发酵包括：将小脆柄菇与液体培养基混合，随后进行发酵培养；
其中，液体培养基的成分包括水、葡萄糖、猪肉蛋白胨、酵母粉、KH2PO4以及MgSO4，每升水中溶有4.8-5.2wt％的葡萄糖、0.12-0.18wt％的猪肉蛋白胨、0.45-0.55wt％的猪肉蛋白胨、0.045-0.055wt％的KH2PO4以及0.045-0.055wt％的MgSO4。
在可选的实施方式中，发酵是于23-28℃、转速为140-180rpm的条件下避光培养20-30天。
在可选的实施方式中，乙酸乙酯萃取液经以下方式得到：
将小脆柄菇发酵后所得的发酵液和固态菌丝体分别进行以下处理：
将发酵液进行乙酸乙酯萃取，收集乙酸乙酯层；将固态菌丝体依次进行丙酮提取和乙酸乙酯萃取，收集乙酸乙酯层；混合发酵液对应所得的乙酸乙酯层以及固态菌丝体对应所得的乙酸乙酯层，得乙酸乙酯萃取液。
第三方面，本申请提供一种经前述实施方式的制备方法得到的发酵得物和/或乙酸乙酯萃取液。
第四方面，本申请提供一种镇痛药物，其制备原料包括前述实施方式的二萜类衍生物、前述实施方式的发酵得物或前述实施方式的乙酸乙酯萃取液中的至少一种。
本申请的有益效果包括：
本申请提供的化合物1-10均为首次从小脆柄菇属Psathyrella sp.中分离得到的全新二萜类衍生物，拓宽了对小脆柄菇中化学成分的研究。上述二萜类衍生物的制备方法简单，易操作，能够制备得到得率和纯度均较高的化合物。上述二萜类衍生物均具有良好的镇痛活性，可用于制备镇痛药物。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为试验例2中小鼠醋酸扭体实验的结果图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
下面对本申请提供的二萜类衍生物及其制备方法与镇痛药物、小脆柄菇发酵得物及其乙酸乙酯萃取液进行具体说明。
本申请提供的二萜类衍生物包括化合物1至化合物10中的任意一种，化合物1至化合物10的化学结构式依次为：
Figure BDA0003560006090000061
Figure BDA0003560006090000071
上述10种二萜类衍生物均是从小脆柄菇属Psathyrella sp.中分离得到。
相应地，本申请还提供了上述二萜类衍生物的制备方法，可以包括以下步骤：
将小脆柄菇的发酵得物经乙酸乙酯萃取后所得的乙酸乙酯萃取液进行硅胶柱层析。
作为参考地，上述发酵得物包括小脆柄菇发酵后的发酵液和固态菌丝体。
发酵过程可包括：将小脆柄菇与液体培养基混合，随后进行发酵培养。
其中，液体培养基的成分包括水、葡萄糖、猪肉蛋白胨、酵母粉、KH2PO4以及MgSO4，每升水中溶有4.8-5.2wt％的葡萄糖、0.12-0.18wt％的猪肉蛋白胨、0.45-0.55wt％的猪肉蛋白胨、0.045-0.055wt％的KH2PO4以及0.045-0.055wt％的MgSO4。
在一些优选的实施方式中，每升水中溶有5wt％的葡萄糖、0.15wt％的猪肉蛋白胨、0.5wt％的猪肉蛋白胨、0.05wt％的KH2PO4以及0.05wt％的MgSO4。
发酵可以于23-28℃、转速为140-180rpm(优选160℃)的条件下避光培养(也即“暗培养”)20-30天(优选25天)。
在一些优选的实施方式中，发酵是于25℃、转速为160rpm的条件下避光培养25天。
发酵后，将发酵体系的固液混合物进行固液分离(如过滤)，即可分别得到液态物(发酵液)和固态物(固态菌丝体)。
进一步地，将小脆柄菇发酵后所得的发酵液和固态菌丝体分别进行以下处理：
将发酵液进行乙酸乙酯萃取，收集乙酸乙酯层；
将固态菌丝体依次进行丙酮提取和乙酸乙酯萃取，收集乙酸乙酯层；
混合发酵液对应所得的乙酸乙酯层以及固态菌丝体对应所得的乙酸乙酯层，得乙酸乙酯萃取液。
其中，发酵液进行乙酸乙酯萃取可参考以下方式进行：利用旋转蒸发仪及真空泵和低温冷却循环泵(下同，减压浓缩装置)将发酵液减压蒸馏成浓缩液(仅含水)，将该浓缩液和乙酸乙酯按照体积比1:1-1.5(如1:1)混合，在分液漏斗中摇晃萃取然后静置，分取上层乙酸乙酯层，下层水液继续和乙酸乙酯按照体积比1:1-1.5(如1:1)萃取，如此萃取三次后合并上层得发酵液对应的总乙酸乙酯层。
需说明的是，上述发酵液的萃取过程可仅进行1次或2次，也可根据需要进行4次、5次或更多次。
固态菌丝体依次进行丙酮提取和乙酸乙酯萃取可参考以下方式进行：将固态菌丝体放入锥形瓶中，加入丙酮，超声2.5-3.5h(如3h)，破壁，过虑得到丙酮提取液，重复操作3次，将该丙酮溶液减压浓缩至浓膏状，再加入水，超声混匀，并加入1-1.5倍体积的乙酸乙酯萃取，共萃取三次，合并得固态菌丝体对应的总乙酸乙酯层。
同理地，固态菌丝的萃取过程也可仅进行1次或2次，还可根据需要进行4次、5次或更多次。
合并上述发酵液对应的总乙酸乙酯层和固态菌丝体对应的总乙酸乙酯层，即得到乙酸乙酯萃取液。
在某些实施方式中，将上述乙酸乙酯萃取液进行减压浓缩，除去乙酸乙酯后得到粗浸膏，随后再将粗浸膏进行硅胶柱层析。
可参考地，本申请中，硅胶柱层析的条件包括：以氯仿-甲醇为洗脱剂，按氯仿与甲醇的体积比依次为100:0、18-22:1、8-12:1、4-6:1以及0:1的比例进行梯度洗脱。优选地，以体积比依次为100:0、20:1、10:1、5:1以及0:1的比例进行梯度洗脱。
该过程中，每个梯度所用的洗脱剂的体积均为1500-2000mL(如1800mL)。洗脱流速示例性地可以为18-22mL/min(如20mL/min)。硅胶柱所用的硅胶的目数优选为200-300目。
经上述硅胶柱层析，得到组分A、组分B、组分C、组分D和组分E共5个组分。根据所需，可对上述各组分进行浓缩回收。
进一步地，将第二个梯度对应的洗脱组分(也即组分B)进行中压液相色谱分离，中压液相色谱分离条件包括：以甲醇-水为洗脱剂，按甲醇与水的体积比依次为15:85-25:75、35:65-45:55、55:45-65:35、75:25-25:75以及100:0的比例进行梯度洗脱，每个梯度所用的洗脱剂体积为1500-2000mL，将洗脱液按每400-500mL进行单独收集并进行薄层色谱检测，合并显色一致的组分，得到子组分B1至子组分B10。
在该中压液相色谱分离过程中，所用的色谱柱为PR-C18柱，填料的粒径为40-75μm。
在一些优选的实施方式中，按甲醇与水的体积比依次为20:80、40:60、60:40、80:20以及100:0的比例进行梯度洗脱，每个梯度所用的洗脱剂体积为1600mL。
作为参考地，洗脱剂的流速示例性地可以为35-45mL/min。在一些具体的实施方式中，流速为40mL/min，每个梯度所用的洗脱剂体积为1600mL，也即每个梯度的洗脱时间为40min。
在某些具体的实施方式中，将洗脱液按每500mL进行单独收集，减压浓缩，随后进行薄层色谱检测，合并显色一致的组分，最终得到子组分B1至子组分B10共计10个子组分。
需说明的是，上述“显色一致”并非绝对地指显色完全一致，而是指显色相同或类似。
随后根据所需得到的化合物按照以下对应的方式进行制备：
(a)、将子组分B2依次进行正相硅胶柱色谱等度洗脱和高效液相色谱分离，得到化合物2和化合物3；
(b)、将子组分B4依次进行凝胶柱色谱等度洗脱以及高效液相色谱分离，得到化合物1、化合物6和化合物7；
(c)、将子组分B5依次进行凝胶柱色谱等度洗脱和高效液相色谱分离，得到化合物10、化合物8和化合物9；
(d)、将子组分B6进行高效液相色谱分离，得到化合物4和化合物5。
其中，子组分B2的正相硅胶柱色谱等度洗脱条件包括：以体积比为6-8:1(优选7:1)的石油醚和丙酮作为洗脱剂，洗脱流速为5.5-6.5mL/min(如6mL/min)，洗脱时间为40min。
随后将子组分B2的经正相硅胶柱色谱等度洗脱得到的洗脱液进行高效液相色谱分离，可参考地，该高效液相色谱的条件包括：以乙腈-水作为洗脱剂，按体积比为15:85-25:75至30:70-40:60(优选为20:80至35:65)进行梯度洗脱，流速为3.5-4.5mL/min(优选4mL/min)，洗脱时间为40min。
子组分B4的凝胶柱色谱等度洗脱条件包括：以纯甲醇作为洗脱剂，洗脱流速为1.5-2.5mL/min(如2mL/min)，洗脱时间为240min。所用的凝胶色谱柱可以为Sephadex LH-20，下同。
随后，用薄层色谱(TLC)检测并显色，将相同或者类似的组分合并，再用高效液相色谱(HPLC)进行制备。可参考地，该高效液相色谱的条件包括：以乙腈-水作为洗脱剂，按体积比为15:85-22:78至25:75-35:65(优选为20:80至30:70)进行梯度洗脱，流速为3.5-4.5mL/min(优选4mL/min)，洗脱时间为30-40min(优选35min)。
子组分B5的凝胶柱色谱等度洗脱条件包括：以纯甲醇作为洗脱剂，洗脱流速为1-2mL/min(如2mL/min)，洗脱时间为120-360min(如240min)。
随后，用薄层色谱检测并显色，将相同或者类似的组分合并，再用高效液相色谱(HPLC)进行制备。可参考地，该高效液相色谱的条件包括：以乙腈-水作为洗脱剂，按体积比为15:85-20:80至30:70-40:60(优选为18:85至35:65)进行梯度洗脱，流速为3.5-4.5mL/min(优选4mL/min)，洗脱时间为35-55min(优选40min)。
子组分B6的高效液相色谱的条件包括：以乙腈-水作为洗脱剂，按体积比为15:85-25:75(优选为20:80)进行等度洗脱，流速为3.5-4.5mL/min(优选4mL/min)，洗脱时间为35-55min(优选40min)。
此外，本申请还提供了一种经前述实施方式的制备方法得到的二萜类衍生物、发酵得物或乙酸乙酯萃取液的应用，如可用于制备镇痛药物。
需说明的是，可单独将发酵得物中的发酵液或固态菌丝体用于制备镇痛药物，也可将发酵液或固态菌丝体同时用于制备镇痛药物。
相应地，本申请还提供了一种镇痛药物，其制备原料包括上述二萜类衍生物、发酵得物或乙酸乙酯萃取液中的至少一种。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1
将小脆柄菇属真菌Psathyrella sp.(采自云南省昆明市)在液体培养基中进行发酵培养。其中，液体培养基的体积为30L，培养基组成为：每升蒸馏水中溶有葡萄糖(5wt％)、猪肉蛋白胨(0.15wt％)、酵母(0.5wt％)、KH2PO4(0.05wt％)及MgSO4(0.05wt％)。培养条件为：摇床培养，在恒温25℃，转速160rpm条件下暗培养发酵25天。
随后用纱布将发酵体系的固液混合物进行过滤，分别得到液态物(发酵液)和固态物(固态菌丝体)。
利用旋转蒸发仪及真空泵和低温冷却循环泵(减压浓缩装置)将滤液减压蒸馏至3L浓缩液(仅含水)，将该浓缩液和乙酸乙酯按照体积比1:1混合，在分液漏斗中摇晃萃取然后静置，分取上层乙酸乙酯层，下层水液继续和乙酸乙酯按照体积比1:1萃取，如此萃取3次后合并上层，得发酵液对应的总乙酸乙酯层。
将上述过滤得到的固态菌丝体放入锥形瓶中，加入丙酮，超声3h，破壁，过虑得到丙酮提取液，重复操作3次，将该丙酮溶液减压浓缩至浓膏状，再加入1L水，超声混匀，并用1:1的乙酸乙酯萃取，共萃取3次，合并得固态菌丝体对应的总乙酸乙酯层。
合并上述发酵液对应的总乙酸乙酯层和固态菌丝体对应的总乙酸乙酯层，即得到乙酸乙酯萃取液，随后减压浓缩，除去乙酸乙酯，得粗浸膏60g。
将所得的总浸膏进行正相硅胶柱层析，具体的：以氯仿-甲醇为洗脱剂，按氯仿与甲醇的体积比依次为100:0、20:1、10:1、5:1以及0:1进行梯度洗脱，每个梯度所用的洗脱剂的体积均为1800mL，洗脱流速为20mL/min。硅胶柱所用的硅胶的目数为200-300目。
经上述硅胶柱层析，得到组分A、组分B、组分C、组分D和组分E共5个组分，浓缩回收各组分。
将组分B(25.0g)进行中压液相色谱分离，具体的：以甲醇-水为洗脱剂，按甲醇与水的体积比依次为20:80、40:60、60:40、80:20以及100:0进行梯度洗脱，每个梯度各冲40min，流速为40mL/min。每500mL接一瓶，减压浓缩转移至2mL的小瓶中，用薄层色谱检测并显色，将相同或者类似的组分合并，最后合并成10个组分(即子组分B1至子组分B10)。上述中压液相色谱分离过程中所用的色谱柱为PR-C18柱，填料的粒径为40-75μm。
将子组分B2(500mg)进行正相硅胶柱色谱等度洗脱，具体的：以体积比为7:1的石油醚和丙酮作为洗脱剂，洗脱流速为6mL/min，洗脱时间为40min。随后，用高效液相色谱进行分离，具体的：以乙腈-水作为洗脱剂，按体积比为20:80至35:65进行线性梯度洗脱，流速为4mL/min，洗脱时间为40min，得到化合物2(15.3mg)和化合物3(16.5mg)。
将子组分B4(230mg)进行凝胶柱色谱等度洗脱，具体的：以纯甲醇作为洗脱剂，洗脱流速为2mL/min，洗脱时间为240min。用薄层色谱检测并显色，将相同或者类似的组分合并。随后，用高效液相色谱进行分离，具体的：以乙腈-水作为洗脱剂，按体积比为20:80至30:70进行线性梯度洗脱，流速为4mL/min，洗脱时间为40min，得到化合物1(5.5mg)、化合物6(13mg)和化合物7(9.8mg)。
将子组分B5(300mg)进行凝胶柱色谱等度洗脱，具体的：以纯甲醇作为洗脱剂，洗脱流速为2mL/min，洗脱时间为240min。用薄层色谱检测并显色，将相同或者类似的组分合并。随后，用高效液相色谱进行分离，具体的：以乙腈-水作为洗脱剂，按体积比为18:85至35:65进行线性梯度洗脱，流速为4mL/min，洗脱时间为40min，得化合物10(22mg)、化合物8(18mg)以及化合物9(15mg)。
将子组分B6(105mg)直接用高效液相色谱进行纯化，具体的：以乙腈-水作为洗脱剂，按体积比为20:80进行等度洗脱，流速为4mL/min，洗脱时间为40min，得化合物4(14mg)和化合物5(25mg)。
实施例2
将小脆柄菇属Psathyrella sp.(采自云南省昆明市)在液体培养基中进行发酵培养。其中，液体培养基的体积为30L，培养基组成为：每升蒸馏水中溶有葡萄糖(4.8wt％)、猪肉蛋白胨(0.12wt％)、酵母(0.45wt％)、KH2PO4(0.045wt％)及MgSO4(0.045wt％)。培养条件为：摇床培养，在恒温23℃，转速140rpm条件下暗培养发酵20天。
随后用纱布将发酵体系的固液混合物进行过滤，分别得到液态物(发酵液)和固态物(固态菌丝体)。
利用旋转蒸发仪及真空泵和低温冷却循环泵(减压浓缩装置)将滤液减压蒸馏至3L浓缩液(仅含水)，将该浓缩液和乙酸乙酯按照体积比1:1混合，在分液漏斗中摇晃萃取然后静置，分取上层乙酸乙酯层，下层水液继续和乙酸乙酯按照体积比1:1萃取，如此萃取2次后合并上层，得发酵液对应的总乙酸乙酯层。
将上述过滤得到的固态菌丝体放入锥形瓶中，加入丙酮，超声3h，破壁，过虑得到丙酮提取液，重复操作2次，将该丙酮溶液减压浓缩至浓膏状，再加入1L水，超声混匀，并用1:1的乙酸乙酯萃取，共萃取2次，合并得固态菌丝体对应的总乙酸乙酯层。
合并上述发酵液对应的总乙酸乙酯层和固态菌丝体对应的总乙酸乙酯层，即得到乙酸乙酯萃取液，随后减压浓缩，除去乙酸乙酯，得粗浸膏。
将所得的总浸膏进行正相硅胶柱层析，具体的：以氯仿-甲醇为洗脱剂，按氯仿与甲醇的体积比依次为100:0、18:1、8:1、4:1以及0:1进行梯度洗脱，每个梯度所用的洗脱剂的体积均为1500mL，洗脱流速为18mL/min。硅胶柱所用的硅胶的目数为200-300目。
经上述硅胶柱层析，得到组分A、组分B、组分C、组分D和组分E共5个组分，浓缩回收各组分。
将组分B进行中压液相色谱分离，具体的：以甲醇-水为洗脱剂，按甲醇与水的体积比依次为15:85、35:65、55:45、75:25以及100:0进行梯度洗脱，每个梯度各冲50min，流速为35mL/min。每500mL接一瓶，减压浓缩转移至2mL的小瓶中，用薄层色谱检测并显色，将相同或者类似的组分合并，最后合并成10个组分(即子组分B1至子组分B10)。上述中压液相色谱分离过程中所用的色谱柱为PR-C18柱，填料的粒径为40-75μm。
将子组分B2进行正相硅胶柱色谱等度洗脱，具体的：以体积比为6:1的石油醚和丙酮作为洗脱剂，洗脱流速为5.5mL/min，洗脱时间为40min。随后，用高效液相色谱进行分离，具体的：以乙腈-水作为洗脱剂，按体积比为15:85至30:70进行线性梯度洗脱，流速为3.5mL/min，洗脱时间为40min，得到化合物2和化合物3。
将子组分B4进行凝胶柱色谱等度洗脱，具体的：以纯甲醇作为洗脱剂，洗脱流速为1.5mL/min，洗脱时间为240min。用薄层色谱检测并显色，将相同或者类似的组分合并。随后，用高效液相色谱进行分离，具体的：以乙腈-水作为洗脱剂，按体积比为15:85至25:75进行线性梯度洗脱，流速为3.5mL/min，洗脱时间为25min，得到化合物1、化合物6和化合物7。
将子组分B5进行凝胶柱色谱等度洗脱，具体的：以纯甲醇作为洗脱剂，洗脱流速为1mL/min，洗脱时间为360min。用薄层色谱检测并显色，将相同或者类似的组分合并。随后，用高效液相色谱进行分离，具体的：以乙腈-水作为洗脱剂，按体积比为15:85至30:70进行线性梯度洗脱，流速为3.5mL/min，洗脱时间为55min，得化合物10、化合物8以及化合物9。
将子组分B6直接用高效液相色谱进行纯化，具体的：以乙腈-水作为洗脱剂，按体积比为15:85进行等度洗脱，流速为3.5mL/min，洗脱时间为40min，得化合物4和化合物5。
实施例3
将小脆柄菇属Psathyrella sp.(采自云南省昆明市)在液体培养基中进行发酵培养。其中，液体培养基的体积为30L，培养基组成为：每升蒸馏水中溶有葡萄糖(5.2wt％)、猪肉蛋白胨(0.18wt％)、酵母(0.55wt％)、KH2PO4(0.055wt％)及MgSO4(0.055wt％)。培养条件为：摇床培养，在恒温28℃，转速180rpm条件下暗培养发酵30天。
随后用纱布将发酵体系的固液混合物进行过滤，分别得到液态物(发酵液)和固态物(固态菌丝体)。
利用旋转蒸发仪及真空泵和低温冷却循环泵(减压浓缩装置)将滤液减压蒸馏至3L浓缩液(仅含水)，将该浓缩液和乙酸乙酯按照体积比1:1混合，在分液漏斗中摇晃萃取然后静置，分取上层乙酸乙酯层，下层水液继续和乙酸乙酯按照体积比1:1萃取，如此萃取4次后合并上层，得发酵液对应的总乙酸乙酯层。
将上述过滤得到的固态菌丝体放入锥形瓶中，加入丙酮，超声3h，破壁，过虑得到丙酮提取液，重复操作4次，将该丙酮溶液减压浓缩至浓膏状，再加入1L水，超声混匀，并用1:1的乙酸乙酯萃取，共萃取4次，合并得固态菌丝体对应的总乙酸乙酯层。
合并上述发酵液对应的总乙酸乙酯层和固态菌丝体对应的总乙酸乙酯层，即得到乙酸乙酯萃取液，随后减压浓缩，除去乙酸乙酯，得粗浸膏。
将所得的总浸膏进行正相硅胶柱层析，具体的：以氯仿-甲醇为洗脱剂，按氯仿与甲醇的体积比依次为100:0、22:1、12:1、6:1以及0:1进行梯度洗脱，每个梯度所用的洗脱剂的体积均为2000mL，洗脱流速为22mL/min。硅胶柱所用的硅胶的目数为200-300目。
经上述硅胶柱层析，得到组分A、组分B、组分C、组分D和组分E共5个组分，浓缩回收各组分。
将组分B进行中压液相色谱分离，具体的：以甲醇-水为洗脱剂，按甲醇与水的体积比依次为25:75、45:55、65:35、25:75以及100:0进行梯度洗脱，每个梯度各冲40min，流速为45mL/min。每500mL接一瓶，减压浓缩转移至2mL的小瓶中，用薄层色谱检测并显色，将相同或者类似的组分合并，最后合并成10个组分(即子组分B1至子组分B10)。上述中压液相色谱分离过程中所用的色谱柱为PR-C18柱，填料的粒径为40-75μm。
将子组分B2进行正相硅胶柱色谱等度洗脱，具体的：以体积比为8:1的石油醚和丙酮作为洗脱剂，洗脱流速为6.5mL/min，洗脱时间为40min。随后，用高效液相色谱进行分离，具体的：以乙腈-水作为洗脱剂，按体积比为25:75至40:60进行线性梯度洗脱，流速为4.5mL/min，洗脱时间为40min，得到化合物2和化合物3。
将子组分B4进行凝胶柱色谱等度洗脱，具体的：以纯甲醇作为洗脱剂，洗脱流速为2.5mL/min，洗脱时间为240min。用薄层色谱检测并显色，将相同或者类似的组分合并。随后，用高效液相色谱进行分离，具体的：以乙腈-水作为洗脱剂，按体积比为22:78至35:65进行线性梯度洗脱，流速为4.5mL/min，洗脱时间为40min，得到化合物1、化合物6和化合物7。
将子组分B5进行凝胶柱色谱等度洗脱，具体的：以纯甲醇作为洗脱剂，洗脱流速为1.5mL/min，洗脱时间为240min。用薄层色谱检测并显色，将相同或者类似的组分合并。随后，用高效液相色谱进行分离，具体的：以乙腈-水作为洗脱剂，按体积比为20:80至40:60进行线性梯度洗脱，流速为4.5mL/min，洗脱时间为35min，得化合物10、化合物8以及化合物9。
将子组分B6直接用高效液相色谱进行纯化，具体的：以乙腈-水作为洗脱剂，按体积比为25:75进行等度洗脱，流速为4.5mL/min，洗脱时间为40min，得化合物4和化合物5。
试验例1
重复实施实施例1-3，得到足够多的二萜类衍生物。通过NMR、高分辨质谱及X单晶衍射等对所得的二萜类衍生物进行结构测定确定。
核磁共振测试结果如表1至表3所示：
表1化合物1-5的1H NMR数据(600MHz，in methanol-d4)
Figure BDA0003560006090000171
Figure BDA0003560006090000181
表2化合物6-10的1H NMR数据(600MHz，in methanol-d4)
Figure BDA0003560006090000182
表3化合物1-10的13C NMR数据(150MHz，in methanol-d4)
Figure BDA0003560006090000191
此外，上述所得的二萜类衍生物(化合物1-10)的理化数据如下：
①化合物1：无色晶体；熔点194-201℃；比旋光度[α]15.0 D-288.5(c 0.1,MeOH)；UV(MeOH)λmax(logε)：205(3.90)，280(4.06)nm；1H NMR和13C NMR谱图数据见表1和表3；高分辨质谱HR-ESI-MS m/z 333.20584[M+H]+(calcd for C20H29O4 +，333.20604)；
化合物1的晶体数据：C20H28O4,M＝333.24,
Figure BDA0003560006090000192
Figure BDA0003560006090000193
α＝90°,β＝90°,γ＝120°,/>
Figure BDA0003560006090000194
T＝100(2)K,spacegroup P61,Z＝6,μ(Cu Kα)＝0.601mm-1,总衍射数62417,独立衍射数3734(Rint＝0.0318)。终值R1＝0.0241(I>2σ(I))。终值wR(F2)＝0.0625(I>2σ(I))。终值R1＝0.0245(全部数据)。终值wR(F2)＝0.0629(全部数据)。F2拟合优化度为1.032。Flack参数＝0.09(4)。剑桥大学的晶体学数据中心(CCDC)号:2132084(https://www.ccdc.cam.ac.uk)。
②化合物2：无色晶体(MeOH)；熔点162-165℃；比旋光度[α]20.0 D-120.0(c 0.1,MeOH)；UV(MeOH)λmax(logε)：210(4.27),280(4.50),300(3.87)nm；1H NMR和13C NMR谱图数据见表1和表3；高分辨质谱HR-ESI-MS m/z331.19034[M+H]+(calcd for C20H27O4 +,331.19039)；
③化合物3：黄色油状物；比旋光度[α]20.0 D-150.0(c 0.1,MeOH)；UV(MeOH)λmax(logε)：210(4.27),280(4.50),300(3.87)nm；1H NMR和13C NMR谱图数据见表1和表3；高分辨质谱HR-ESI-MS m/z 331.19031[M+H]+(calcd for C20H27O4 +,331.19039)。
④化合物4：无色晶体(MeOH)；熔点233-242℃；比旋光度[α]20.0 D-220.5(c 0.1,MeOH)；UV(MeOH)λmax(logε)：210(3.96),280(3.77)nm；1H NMR和13C NMR谱图数据见表1和表3；高分辨质谱HR-ESI-MS m/z 349.20087[M+H]+(calcd for C20H29O5 +,349.20095)；
⑤化合物5：黄色油状物；比旋光度[α]14.9 D-205.5(c 0.07,MeOH)；UV(MeOH)λmax(logε)：210(3.96),280(3.77)nm；1H NMR和13C NMR谱图数据见表1和表3；高分辨质谱HR-ESI-MS m/z 349.20074[M+H]+(calcd for C20H29O5 +,349.20095)。
⑥化合物6：无色晶体(MeOH)；熔点：177-183℃；比旋光度[α]15.5 D-276.1(c 0.072,MeOH)；UV(MeOH)λmax(logε)：205(3.93),280(4.04),300(3.95)nm；1H NMR和13C NMR谱图数据见表2和表3；高分辨质谱HR-ESI-MS m/z 347.18521[M+H]+(calcd for C20H27O5 +,347.18530)。
⑦化合物7：黄色油状物；比旋光度[α]21.6 D-193.8(c 0.077,MeOH)；UV(MeOH)λmax(logε)：205(3.93),280(4.04),300(3.95)nm；1H NMR和13C NMR谱图数据见表2和表3；高分辨质谱HR-ESI-MS m/z 347.18509[M+H]+(calcd for C20H27O5 +,347.18530)。
⑧化合物8：黄色油状物；比旋光度[α]15.4 D-141.2(c 0.087,MeOH)；UV(MeOH)λmax(logε)：210(4.18),285(4.09),335(3.52)nm；1H NMR和13C NMR谱图数据见表2和表3；高分辨质谱HR-ESI-MS m/z 361.16447[M+H]+(calcd for C20H25O6 +,361.16456)。
⑨化合物9：黄色油状物；比旋光度[α]15.4 D-99.4(c 0.089,MeOH)；UV(MeOH)λmax(logε)：210(4.18),285(4.09)335(3.52)nm；1H NMR和13C NMR谱图数据见表2和表3；高分辨质谱HR-ESI-MS m/z 361.16460[M+H]+(calcd for C20H25O6 +,361.16456)。
⑩化合物10：黄色油状物；比旋光度[α]15.0 D-162.7(c 0.12,MeOH)；UV(MeOH)λmax(logε)：205(3.95),275(4.10),300(3.98)nm；1H NMR和13C NMR谱图数据见表2和表3；高分辨质谱HR-ESI-MS m/z 363.18001[M+H]+(calcd for C20H27O6 +,363.18022)。
根据上述检测的结果，确认所得化合物1至化合物10的化学结构式依次为：
Figure BDA0003560006090000211
/>
Figure BDA0003560006090000221
试验例2
小鼠醋酸扭体实验
原理：小鼠腹腔注射化学刺激剂(如醋酸溶液等)可诱导疼痛，动物表现出特征性的躯体伸缩行为称之为扭体反应(表现为腹部收缩内陷、躯干扭曲与后腿伸展及蠕行等)。镇痛药物可以抑制这种反应。将给药组与对照组相比，若使扭体反应发生率减少50％以上的，可认为有镇痛作用。
器材：鼠笼，电子称、1mL注射器、计时器；
药品：吗啡(浓度：0.5mg/mL、0.1mg/mL、0.02mg/mL)、0.8％醋酸(v/v现配现用)、生理盐水、待测化合物(浓度：0.5mg/mL、0.1mg/mL、0.02mg/mL)。
实验动物：来源，种系，品系：昆明小鼠，雌雄各半，18-25克(约6周)，购自华中农业大学实验动物中心，动物生产许可证号：SCXK(鄂)2020-0019号，实验动物使用许可证号：SYXK(鄂)2021-0089号。动物使用经中南民族大学动物伦理委员会批准(SYXK(武汉)2016-0089，No.2021-SCUEC-048)。所有动物至少饲养三天后使用，温度22±1℃，12小时光暗循环。饲料和水均在消毒后由动物自由摄取。所有实验均严格按照实验动物有关条例进行。
方法：取10只昆明小鼠(雌雄各半)，称重，分别放在10个鼠笼里为一组。观察每组动物的正常活动情况，无特殊情况下，每只小鼠腹腔注射0.9％生理盐水(0.1ml/10g)，30min后，在分别腹腔注射等量的0.8％醋酸(0.1ml/10g)，观察30min内每只小鼠的出现的扭体反应的次数(每组实验由三个人观察，使用三个独立观察的平均值来最小化主观偏差)，此组作为空白对照组。同理依次测试吗啡组(阳性对照组)和待测化合物组。
汇总各组实验结果，并依照下列公式计算药物镇痛百分率或抑制百分率。
Figure BDA0003560006090000231
Figure BDA0003560006090000232
各组所得的数据整理后如图1所示。
由图1可以看出：经过小鼠醋酸扭体实验测试，本申请提供的二萜类衍生物(化合物1-10)均对小鼠的扭体反应有着显著的抑制活性，部分浓度抑制活性与阳性对照药吗啡相当。
综上所述，本申请提供的从小脆柄菇属Psathyrella sp.中分离得到的二萜类衍生物(化合物1-10)，具有镇痛活性，可指导从小脆柄菇属Psathyrella sp.中寻找具有镇痛活性的先导化合物；上述化合物1-10对小鼠的醋酸扭体实验的镇痛活性相当于临床广泛使用的镇痛药物吗啡，为高效的镇痛抑制剂，可用于制备镇痛药物；且上述化合物1-10可通过微生物发酵手段来获取，全部生产过程无化学污染，绿色环保。
以上仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (3)

1.一种二萜类衍生物，其特征在于，所述二萜类衍生物为化合物4至化合物10中的任意一种，所述化合物4至化合物10的化学结构式依次为：
Figure QLYQS_1
、/>
Figure QLYQS_2
、/>
Figure QLYQS_3
、
Figure QLYQS_4
、/>
Figure QLYQS_5
、/>
Figure QLYQS_6
和
Figure QLYQS_7
。
2.如权利要求1所述的二萜类衍生物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
将小脆柄菇的发酵得物经乙酸乙酯萃取后所得的乙酸乙酯萃取液进行硅胶柱层析，硅胶柱层析的条件包括：以氯仿-甲醇为洗脱剂，按氯仿与甲醇的体积比依次为100:0、18-22:1、8-12:1、4-6:1以及0:1的比例进行梯度洗脱；
将第二个梯度对应的洗脱组分进行中压液相色谱分离，中压液相色谱分离条件包括：以甲醇-水为洗脱剂，按甲醇与水的体积比依次为15:85-25:75、35:65-45:55、55:45-65:35、75:25-25:75以及100:0的比例进行梯度洗脱，每个梯度所用的洗脱剂体积为1500-2000mL，将洗脱液按每400-500mL进行单独收集并进行薄层色谱检测，合并显色一致的组分，得到子组分B1至子组分B10；中压液相色谱分离过程中，流速为35-45mL/min；
随后根据所需得到的化合物按照以下对应的方式进行制备：
（a）、将子组分B4依次进行凝胶柱色谱等度洗脱以及高效液相色谱分离，得到化合物6和化合物7；
（b）、将子组分B5依次进行凝胶柱色谱等度洗脱和高效液相色谱分离，得到化合物10、化合物8和化合物9；
（c）、将子组分B6进行高效液相色谱分离，得到化合物4和化合物5；
乙酸乙酯萃取液硅胶柱层析过程中，洗脱流速为18-22mL/min，每个梯度所用的洗脱剂的体积均为1500-2000mL；
子组分B4的凝胶柱色谱等度洗脱条件包括：以纯甲醇作为洗脱剂，洗脱流速为1.5-2.5mL/min，洗脱时间为240min；
随后进行的高效液相色谱的条件包括：以乙腈-水作为洗脱剂，按体积比为15:85-22:78至25:75-35:65进行梯度洗脱，流速为3.5-4.5mL/min，洗脱时间为30-40min；
子组分B5的凝胶柱色谱等度洗脱条件包括：以纯甲醇作为洗脱剂，洗脱流速为1-2mL/min，洗脱时间为120-360min；
随后进行的高效液相色谱的条件包括：以乙腈-水作为洗脱剂，按体积比为15:85-20:80至30:70-40:60进行梯度洗脱，流速为3.5-4.5mL/min，洗脱时间为35-55min；
子组分B6的高效液相色谱的条件包括：以乙腈-水作为洗脱剂，按体积比为15:85-25:75进行等度洗脱，流速为3.5-4.5mL/min，洗脱时间为35-55min；
所述发酵得物包括小脆柄菇发酵后的发酵液和固态菌丝体；
发酵包括：将小脆柄菇与液体培养基混合，随后进行发酵培养；
其中，所述液体培养基的成分包括水、葡萄糖、猪肉蛋白胨、酵母粉、KH2PO4以及MgSO4，每升水中溶有4.8-5.2wt%的葡萄糖、0.12-0.18wt%的猪肉蛋白胨、0.45-0.55wt%的酵母粉、0.045-0.055wt%的KH2PO4以及0.045-0.055wt%的MgSO4；
发酵是于23-28℃、转速为140-180rpm的条件下避光培养20-30天；
所述乙酸乙酯萃取液经以下方式得到：
将小脆柄菇发酵后所得的发酵液和固态菌丝体分别进行以下处理：
将所述发酵液进行乙酸乙酯萃取，收集乙酸乙酯层；将所述固态菌丝体依次进行丙酮提取和乙酸乙酯萃取，收集乙酸乙酯层；混合所述发酵液对应所得的乙酸乙酯层以及所述固态菌丝体对应所得的乙酸乙酯层，得乙酸乙酯萃取液。
3.一种镇痛药物，其特征在于，其包括权利要求1所述的二萜类衍生物。
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