一种高纯度竹红菌素的制备方法
技术领域
本发明属于生物工程技术领域,具体涉及一种高纯度竹红菌素的制备方法。
背景技术
竹黄菌是一种特异寄生于某些竹子嫩枝上的真菌,其子座称为竹黄,隶属于肉座菌科竹黄属。主要分布于我国南部(云南、四川、福建、湖南和江苏等地区),斯里兰卡和日本也有分布(李向敏,高健,岳永德,等.竹黄的系统学、生物学及活性成分的研究[J].林业科学研究,2009,22(2):279.)。竹黄是一种民间药材,可用于治疗风湿性关节炎、虚寒胃痛、坐骨神经痛、气管炎、百日咳、跌打损伤及贫血头痛等病症(钟树荣,赵海,李安明,等.一种尚待开发的中药-竹黄[J].中草药,2002,33(4):372-374.)。近年来,国内外学者对竹黄菌的化学成分及其药理作用进行了深入的研究。竹黄菌的化学分析表明其具有多种生物活性物质,其中研究的最为深入的活性成分是竹红菌素。
竹红菌素属于苝醌类化合物,包括竹红菌甲素、竹红菌乙素、竹红菌丙素和竹红菌丁素。可溶于丙酮、氯仿、甲醇和乙醇等有机溶剂,微溶于石油醚,不溶于水。竹红菌素在中性和酸性溶液中呈红色,在碱性溶液中呈鲜绿色,乙醇溶液在465nm有最大光吸收。竹红菌素具有一定的消炎、镇痛和局麻作用(朱丽青,胡汉杰,张黎明,等.竹黄的镇痛抗炎作用[J].中草药,1990,21(1):22-23)。竹红菌素也是是可见光区内的优良光敏剂,单线态氧量子产率高,具有光敏杀伤肿瘤细胞、抗病毒和抑制HIV-Ⅰ型病毒增殖(HUDSON J B,ZHOU J,CHEN J,et al.Hypocrellin,from Hypocrella bambuase,is phototoxic to humanimmunodeficiency virus[J].Photochem Photobiol,1994,60(3):253-255.)等作用。在临床上已经用于治疗皮肤病,如瘢痕疙瘩、牛皮癣、白癜风和外阴白色病变(崔荔群,探讨竹红菌素软膏治疗外阴白斑病的临床价值[J].中医诊疗标准前研究,2017,8(20):108-109)等。竹红菌素还可以制成新型光敏杀菌剂和杀虫剂,并且是潜在的光电转换材料(周家宏,冯玉英,魏少华,等.竹红菌甲素和竹红菌乙素的光电转换性能[J].南京师大学报,2004,27(4):59-60.)。此外,竹红菌素色泽鲜红且富有保健功能,因此还可以用于食品领域。
竹黄通常生长在衰败或者即将发生衰败的竹林中。其寄主植物主要为短穗竹属(Brachystachyum sp.)和箭竹属(Fargesia Franch)植物,其中以短穗竹(B.densiflorum)、白纹短穗竹(B.albostriatum)和毛环短穗竹(B.densilorumvar.villosum)最为主要(赖广辉,傅乐意.竹黄主要寄主植物的研究[J].中国野生植物资源,2000,19(1):8-11)。竹黄在不同生长环境的竹林中的寄生状况差别很大,通常在阴凉湿润环境下生长的竹林中的寄生率较高,在纯竹林中的寄生率比在混交林中的寄生率高(邓丹,张灏.竹黄的研究进展及应用[J].食品科技,2001,5:36-37)。竹黄的大量生长会对寄主植物造成损伤,常会引起竹林大面积死亡。研究表明野生竹黄菌适宜生长的时期是每年4至6月份,适宜生长的地区4,5月份的平均气温应保持在22~26℃左右,生长的竹林中空气的相对湿度应保持在85~90%,光照强度在25000~40000lx之间,避免阳光直射(赖广辉,傅乐意.竹黄主要寄主植物的研究[J].中国野生植物资源,2000,19(1):8-11)。可见,天然竹黄的生长,对寄主植物和自然条件的要求严格。所以,天然竹黄的产量是非常有限的。因此本发明采用固态发酵技术人工模培养的竹黄菌为原料来提取竹红菌素,原料来源稳定、充足,不受天然竹黄产量有限的制约,为竹红菌素的开发提供了更好的基础。
竹红菌素大多以硅胶吸附柱层析法进行纯化。1992年,胡晓等人从天然竹黄的粗粉中提取得到竹红菌素结晶,其方法是利用石油醚和乙酸乙醋连续回流至无色得到石油醚和乙酸乙酯提出物,最后石油醚提出物经过溶解、过滤、蒸干、反复结晶和过层析柱得到结晶,而乙酸乙酯经过放置得到混合物结晶,经过鉴定确定里面具有竹红菌素晶体(胡晓,沈联德.竹黄化学成分的分离和结构鉴定[J].华西药学杂志,1992(1):1-4)。2002年沈修云等人采用丙酮浸泡天然竹黄得到浸膏,然后再采用硅胶柱层析进行洗脱,石油醚-乙酸乙酯(2∶3)部分再经硅胶柱层析,氯仿∶甲醇(100∶1-20∶1)洗脱,重结晶后得到竹红菌甲素,再结晶得到竹黄菌甲素结晶成品(沈云修,荣先国,高宗华.竹黄的化学成分研究[J]中国中药杂志,2002,27(9):674-676)。2013年殷志琦等人在竹黄饮片中用90%乙醇提取获得提取液,再用乙酸乙醋提取得到浸膏,经硅胶柱色谱得到竹红菌素晶体(殷志琦,陈占利,张健,等.药用真菌竹黄的化学成分研究[J].中国中药杂志,2013,38(7):1008-1013.)。这几种方法提取所用的原料均为天然竹黄,得到的结晶没有公开纯度,而且用不同配比有机溶剂进行硅胶柱洗脱,步骤较为复杂。还有一个缺点是硅胶柱层析用的硅胶难以再生,大多使用一次后就扔掉,不能重复利用。
发明内容
本发明主要目的在于提供一种高纯度竹红菌素制备方法,本发明方法对竹红菌素乙醇提取物进行进一步除杂后,利用大孔吸附树脂进行吸附,使用乙醇溶液进行洗脱,制备得到高纯度竹红菌素;整个制备过程步骤简单,所用吸附柱使用周期长,再生方便,可反复利用,从而克服现有方法的不足。
为实现上述目的,本发明采用以下技术方案:
本发明提供一种高纯度竹红菌素制备方法,其包括以下步骤:向含竹红菌素原料中加入乙醇溶液进行提取,得竹红菌素粗提物;向竹红菌素粗提物中加入水、乙酸乙酯、NaHCO3溶液进行除杂,得竹红菌素提取物;将竹红菌素提取物采用大孔吸附树脂吸附,乙醇溶液洗脱,即得。
进一步地,向含竹红菌素原料中加入5-20倍重量的乙醇溶液,70℃-95℃热回流提取0.5-2h。
进一步地,向竹红菌素粗提物中加入水、乙酸乙酯、NaHCO3溶液进行除杂的具体步骤,包括:向竹红菌素粗提取物中加入30-90倍重量的水,搅拌0.5-1h,加入20-50倍重量的乙酸乙酯,搅拌0.5-1h,静置分层后,收集乙酸乙酯提取液;向乙酸乙酯提取液中加入20-40倍NaHCO3溶液,搅拌0.5-1h,静置分层后,收集乙酸乙酯提取液,减压回收乙酸乙酯,即得竹红菌素提取物。
进一步地,采用大孔吸附树脂吸附前需对大孔吸附树脂进行预处理;大孔吸附树脂预处理方法优选为:大孔吸附树脂先用乙醇浸泡12-24h,然后装柱;用乙醇洗至流出液与水按体积1:3-8比例混合溶液不浑浊,然后用水洗至无乙醇味;再用3-5%v/v HCl溶液浸泡2-4h,然后水洗至中性;最后用1-5%v/v NaOH溶液浸泡2-4h,然后水洗至中性即处理完成。
进一步地,所述乙醇溶液体积浓度为90-95%。
进一步地,所述含竹红菌素原料为竹黄菌固态发酵物。
更进一步地,所用NaHCO3溶液的质量浓度为4%-6%。
进一步地,所用大孔吸附树脂为ADS21、D101、D4020和HPD600中的一种。
更进一步地,所用大孔吸附树脂为ADS21,柱高30-50cm,直径1-3cm。
本发明还提供以上任一项所述方法制备得到的高纯度竹红菌素。
与现有技术相比,本发明具有以下优势:
本发明方法以竹黄菌固态发酵物为原料,采用乙醇溶液提取后,对竹红菌素乙醇提取物进行进一步除杂后,利用大孔吸附树脂进行吸附,使用乙醇溶液进行洗脱,制备得到高纯度竹红菌素;所用吸附柱使用周期长,再生方便,可反复利用;采用乙醇溶液作为洗脱剂不需配置多种不同比例有机溶剂,而且乙醇无毒,生产安全性提高。本发明方法整个制备过程步骤简单,安全性高,成本低,有利于工业化生产。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解,本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明,并不构成对本发明的不当限定。
图1为本发明实施例1所述方法制备得到的竹红菌素HPLC检测图。
具体实施方式
应该指出,以下详细说明都是示例性的,旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明,本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是,这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式,而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的,除非上下文另外明确指出,否则单数形式也意图包括复数形式,此外,还应当理解的是,当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时,其指明存在特征、步骤、操作和/或它们的组合。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案,以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。
竹红菌素总量测定方法:竹红菌素具有相似的分子骨架,乙醇溶液在464nm左右有最大吸收,无需显色可直接用分光光度法测定,方法简单、快速、准确。配置不同浓度的竹红菌素标准液,测量吸光度,绘制标准曲线,得回归方程y=0.0439x-0.0001,R2=0.999。
竹红菌素HPLC测定方法:使用C-18分析柱,流动相为甲醇:水=85:15(v/v),流速1.0mL/min,进样量20μL,柱温30℃,检测波长464nm。
实施例1
高纯度竹红菌素制备方法,包括以下步骤:
(1)竹黄菌固态发酵物为原料,称取50g放于提取器中,加入乙醇溶液,75℃热回流提取两次,每次加500ml 95%v/v乙醇溶液提取1小时;合并提取液,回收乙醇,得竹红菌素粗提取物10.2g。经检测,粗提物中竹红菌素的纯度为4.5%。
所述竹黄菌固态发酵物的制备方法:
①菌株来源:菌株由本单位从野生竹黄分离所得,已保藏于中国普通微生物菌种保藏中心,保藏编号为CGMCC No.18808,保藏日期为2019年12月02日。
②制备种子接种液:所用培养基为PDB培养基。培养基灭菌后,接入活化菌株,26℃摇瓶培养48h。
③制备固体发酵培养基:所述固体发酵培养基包括如下质量百分比的组分:大米45%,麸皮15%,NaCl 0.5g/L,ZnSO4·7H2O 0.01g/L,余量为水。0.1MPa灭菌30min。向固体发酵培养基中加入3%的淡竹茎的浸提液。
④固态发酵:将制备的种子液接入固体发酵培养基中,置26℃恒温箱中发酵,15天后发酵结束。
⑤烘干:将④中得到的固态发酵料放置在烘箱中,65℃烘72h,然后粉碎,得到提取物料。
(2)取10g竹红菌素粗提物,加700ml水,搅拌45min;加入300ml乙酸乙酯搅拌45min然后静置3h,弃掉水层,收集乙酸乙酯提取液;向乙酸乙酯提取液中加700ml质量浓度为5%的NaHCO3溶液,搅拌45min;静置分层后,留乙酸乙酯层,减压回收乙酸乙酯,得竹红菌素提取物;经检测,所述提取物中竹红菌素的纯度为29.3%。
(3)取1g竹红菌素提取物置于预处理后的大孔吸附树脂柱ADS21中,柱高50cm,直径3cm。用95%v/v乙醇溶液洗脱,每50ml收集一次,洗脱至滴出液不带红色为止。回收洗脱液,检测竹红菌素纯度。经检测,竹红菌素的纯度为93.2%。制备的高纯度竹红菌素为竹红菌甲素、竹红菌乙素和竹红菌丙素的混合物,其中,其中竹红菌甲素约占60%,乙素约占25%,丙素约占8%。所得竹红菌素HPLC检测的结果如图1所示。
采用大孔吸附树脂吸附前需对大孔吸附树脂进行预处理;大孔吸附树脂预处理方法为:大孔吸附树脂先用乙醇浸泡24h,然后装柱;用乙醇洗至流出液与水按体积1:5比例混合溶液不浑浊,然后用水洗至无乙醇味;再用5%v/v HCl溶液浸泡3h,然后水洗至中性;最后用2%v/v NaOH溶液浸泡3h,然后水洗至中性即处理完成。
实施例2
所述高纯度竹红菌素制备方法与实施例1的区别在于,采用大孔吸附树脂柱ADS21的柱高为30cm。其它步骤均与实施例1相同。
经检测,竹红菌素的纯度为73.5%。
实施例3
所述高纯度竹红菌素制备方法与实施例1的区别在于,采用大孔吸附树脂柱D101,柱高30cm,直径3cm。其它步骤均与实施例1相同。
经检测,竹红菌素的纯度为53.2%。
实施例4
所述高纯度竹红菌素制备方法与实施例1的区别在于,采用大孔吸附树脂柱D4020,柱高30cm,直径3cm。其它步骤均与实施例1相同。
经检测,竹红菌素的纯度为59.4%以上。
实施例5
所述高纯度竹红菌素制备方法与实施例1的区别在于,采用大孔吸附树脂柱HPD600,柱高30cm,直径3cm。其它步骤均与实施例1相同。
经检测,竹红菌素的纯度为63.8%以上。
实施例6
所述高纯度竹红菌素制备方法与实施例1的区别在于,每次加1000ml 95%v/v乙醇溶液提取1小时,其它步骤均与实施例1相同。
经检测,竹红菌素的纯度为94.6%。
实施例7
所述高纯度竹红菌素制备方法与实施例1的区别在于,每次加250ml 95%v/v乙醇溶液提取1小时,其它步骤均与实施例1相同。
经检测,竹红菌素的纯度为90.2%。
实施例8
所述高纯度竹红菌素制备方法与实施例1的区别在于,步骤(1)中每次加250ml95%v/v乙醇溶液提取半小时,其它步骤均与实施例1相同。
经检测,竹红菌素的纯度为88.3%。
实施例9
所述高纯度竹红菌素制备方法与实施例1的区别在于,步骤(2)中取10g竹红菌素粗提物,加900ml水,搅拌1h;加入乙酸乙酯500ml搅拌1h,然后静置3h,弃掉水层,收集乙酸乙酯提取液;向乙酸乙酯提取液中加700ml质量浓度为6%的NaHCO3溶液,搅拌45min;静置分层后,留乙酸乙酯层,减压回收乙酸乙酯,得竹红菌素提取物;经检测,所述提取物中竹红菌素的纯度为33.1%。其它步骤均与实施例1相同。
经检测,竹红菌素的纯度为97.5%。
实施例10
所述高纯度竹红菌素制备方法与实施例1的区别在于,步骤(2)中取10g竹红菌素粗提物,加300ml水,搅拌0.5h;加入乙酸乙酯200ml搅拌1h,然后静置3h,弃掉水层,收集乙酸乙酯提取液;向乙酸乙酯提取液中加800ml质量浓度为4%的NaHCO3溶液,搅拌45min;静置分层后,留乙酸乙酯层,减压回收乙酸乙酯,得竹红菌素提取物;经检测,所述提取物中竹红菌素的纯度为22.4%。其它步骤均与实施例1相同。
经检测,竹红菌素的纯度为80.1%。
对比例1
一种竹红菌素制备方法,与实施例1的区别在于,步骤(2)中,取10g竹红菌素粗提物,加700ml水,搅拌45min;加入乙酸乙酯300ml搅拌45min,然后静置3h,弃掉水层,收集乙酸乙酯提取液,得竹红菌素提取物;经检测,所述提取物中竹红菌素的纯度为20.6%。其它步骤均与实施例1相同。
经检测,竹红菌素的纯度为78.3%。
上述实施例为本发明较佳的实施方式,但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制,其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化,均应为等效的置换方式,都包含在本发明的保护范围之内。