CN113149819B - 一种从竹黄菌固态发酵料中提取竹红菌素的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种从竹黄菌固态发酵料中提取竹红菌素的方法。所述方法包括以下步骤：将竹黄菌固态发酵后的发酵料制成粉末，加入乙醇溶液、氯化钠、硫酸锌和氢氧化钠，热回流提取，过滤收集滤液，减压回收乙醇，得竹红菌素提取物。本发明方法简单，提取时间短，提取率高，提取过程中未使用有毒溶剂，生产安全性高；为采用竹黄菌固态发酵大量生产竹红菌素奠定了基础。

Description

一种从竹黄菌固态发酵料中提取竹红菌素的方法

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种从竹黄菌固态发酵料中提取竹红菌素的方法。

背景技术

竹黄菌是一种特异寄生于某些竹子嫩枝上的真菌，其子座称为竹黄，隶属于肉座菌科竹黄属。主要分布于我国南部(云南、四川、福建、湖南和江苏等地区)，斯里兰卡和日本也有分布(李向敏，高健，岳永德，等.竹黄的系统学、生物学及活性成分的研究[J].林业科学研究，2009，22(2):279.)。竹黄是一种民间药材，可用于治疗风湿性关节炎、虚寒胃痛、坐骨神经痛、气管炎、百日咳、跌打损伤及贫血头痛等病症(钟树荣,赵海,李安明,等.一种尚待开发的中药-竹黄[J].中草药,2002,33(4):372-374.)。近年来，国内外学者对竹黄菌的化学成分及其药理作用进行了深入的研究。竹黄菌的化学分析表明其具有多种生物活性物质，其中研究的最为深入的活性成分是竹红菌素。

竹红菌素属于苝醌类化合物，包括竹红菌甲素、竹红菌乙素、竹红菌丙素和竹红菌丁素。可溶于丙酮、氯仿、甲醇和乙醇等有机溶剂，微溶于石油醚，不溶于水。竹红菌素在中性和酸性溶液中呈红色，在碱性溶液中呈鲜绿色，乙醇溶液在465nm有最大光吸收。竹红菌素具有一定的消炎、镇痛和局麻作用(朱丽青，胡汉杰，张黎明，等.竹黄的镇痛抗炎作用[J].中草药,1990,21(1):22-23)。竹红菌素也是是可见光区内的优良光敏剂，单线态氧量子产率高，具有光敏杀伤肿瘤细胞、抗病毒和抑制HIV-Ⅰ型病毒增殖(HUDSON J B，ZHOU J，CHEN J，et al.Hypocrellin，from Hypocrella bambuase，is phototoxic to humanimmunodeficiency virus[J].Photochem Photobiol，1994，60(3):253-255.)等作用。在临床上已经用于治疗皮肤病，如瘢痕疙瘩、牛皮癣、白癜风和外阴白色病变(崔荔群，探讨竹红菌素软膏治疗外阴白斑病的临床价值[J].中医诊疗标准前研究，2017,8(20):108-109)等。竹红菌素还可以制成新型光敏杀菌剂和杀虫剂，并且是潜在的光电转换材料(周家宏，冯玉英，魏少华，等.竹红菌甲素和竹红菌乙素的光电转换性能[J].南京师大学报，2004，27(4):59-60.)。此外，竹红菌素色泽鲜红且富有保健功能，因此还可以用于食品领域。

天然竹黄的生长，对寄主植物和自然条件的要求严格。所以，天然竹黄的产量是非常有限的。以竹黄菌发酵物为原料来提取竹红菌素，原料来源充足，不受天然竹黄产量有限的制约，为竹红菌素的开发提供了更好的基础。

中国发明专利CN101875905B公开了一株高产竹红菌素的毛竹种子内生真菌菌株在发酵生产竹红菌素中的方法，所述方法包括以下步骤：(1)将所述毛竹种子内生真菌竹黄菌菌株接种到固体培养基上进行平板培养；(2)从平板中挑取菌块接入液体种子培养基中，培养，得到液体种子；(3)将液体种子接入到液体摇瓶发酵培养基中进行发酵培养；(4)将菌丝体与发酵液分离，再从菌丝体中提取得到竹红菌素。从菌丝体中提取得到竹红菌素的方法包括：将菌丝体用纯净水冲洗，抽滤；收集菌丝体，冷冻过夜，再经真空冷冻干燥器干燥至恒重；将干燥的菌丝体粉粹用丙酮回流提取4～5h至无色，浓缩，即得。该方法中用到了有毒性的丙酮，因此生产安全性降低。

中国发明专利CN102406668B公开了一种竹红菌浸膏的制备方法，该法以天然竹红菌粗颗粒或粗粉为原料，投入多功能提取罐中，加4-6倍重量的90％以上乙醇分别冷浸2-3次，每次12-24小时，合并提取液于真空罐内回收乙醇至浓缩液比重为1.2-1.6，即得竹红菌浸膏。该法采用乙醇冷浸提取竹红菌素，提取花费的时间太长，提取率也较低。

然而，目前尚未有从竹黄菌固态发酵料中提取竹红菌素的方法。

发明内容

本发明主要目的在于提供一种从竹黄菌固态发酵料中提取竹红菌素的方法。本发明方法简单，提取时间短，提取率高，提取过程中未使用有毒溶剂，生产安全性高；为采用竹黄菌固态发酵大量生产竹红菌素奠定了基础。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

本发明提供一种从竹黄菌固态发酵料中提取竹红菌素的方法，其包括以下步骤：将竹黄菌固态发酵后的发酵料制成粉末，加入乙醇溶液、氯化钠、硫酸锌和氢氧化钠，热回流提取，过滤收集滤液，减压回收乙醇，得竹红菌素提取物。

进一步地，加入5-20倍重量、浓度为80-95％v/v的乙醇溶液。

进一步地，加入氯化钠的量为发酵料粉末重量的1-5％。

进一步地，加入硫酸锌的量为发酵粉末重量的1-5％。

进一步地，加入氢氧化钠的量为发酵粉末重量的0.05-0.5％。

进一步地，70℃-95℃温度下热回流提取至少一次，每次热回流提取0.5-2h。

与现有技术相比，本发明具有以下优势：

本发明方法可从竹黄菌固态发酵料中有效提取竹红菌素，提取率高达95％。

本发明方法在提取过程中大大减少了提取时间，工艺步骤少，提取过程未使用有毒试剂，生产安全性高。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作和/或它们的组合。

申请人在先研究中筛选得到一株高产竹红菌素的竹黄菌，保藏编号为CGMCCNo.18808，该菌株不仅可高产竹红菌素，而且所得竹红菌素同时包括竹红菌甲素、竹红菌乙素、竹红菌丙素和竹红菌丁素。将该菌株分别进行液体发酵和固态发酵，发现该菌株固态发酵产竹红菌素更高。采用常规乙醇回流提取法对竹黄菌固态发酵物料进行提取，提取率较低，不能满足工业化生产的需要。

基于此，本申请提供一种从竹黄菌固态发酵料中提取竹红菌素的方法，其包括以下步骤：将竹黄菌固态发酵后的发酵料制成粉末，加入乙醇溶液、氯化钠、硫酸锌和氢氧化钠，热回流提取，过滤收集滤液，减压回收乙醇，得竹红菌素提取物。

作为优选实施例，加入5-20倍重量、浓度为80-95％v/v的乙醇溶液。

作为优选实施例，加入氯化钠的量为发酵料粉末重量的1-5％。

作为优选实施例，加入硫酸锌的量为发酵粉末重量的1-5％。

作为优选实施例，加入氢氧化钠的量为发酵粉末重量的0.05-0.5％。

作为优选实施例，70℃-95℃温度下热回流提取至少一次，每次热回流提取0.5-2h。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。

竹红菌素总量测定方法：竹红菌素具有相似的分子骨架，乙醇溶液在464nm左右有最大吸收，无需显色可直接用分光光度法测定，方法简单、快速、准确。配置不同浓度的竹红菌素标准液，测量吸光度，绘制标准曲线，得回归方程y＝0.0439x-0.0001，R²＝0.999。

提取率计算方法：

提取率＝提取出的竹红菌素质量/物料中竹红菌素质量*100％

实施例1

一种从竹黄菌固态发酵料中提取竹红菌素的方法，包括以下步骤：

(1)竹黄菌固态发酵物料的获得：

①菌株来源：菌株由本单位从野生竹黄分离所得，已保藏于中国普通微生物菌种保藏中心，保藏编号为CGMCC No.18808，保藏日期为2019年12月02日。

②制备种子接种液：所用培养基为PDB培养基。培养基灭菌后，接入活化菌株，26℃摇瓶培养48h。

③制备固体发酵培养基：所述固体发酵培养基包括如下质量百分比的组分：大米45％，麸皮15％，NaCl 0.5g/L，ZnSO₄·7H₂O 0.01g/L，余量为水。0.1MPa灭菌30min。向固体发酵培养基中加入3％的淡竹茎的浸提液。

④固态发酵：将制备的种子液接入培养基中，置26℃恒温箱中发酵，15天后发酵结束。

⑤烘干：将④中得到的固态发酵料放置在烘箱中，65℃烘72h，然后粉碎，得到固态发酵物料。

(2)竹红菌素提取

以步骤(1)得到的竹黄菌固体发酵物料为原料，称取50g粉末放于提取器中，加入95％乙醇，并加入氯化钠、硫酸锌和氢氧化钠，热回流提取两次，每次加500ml 95％乙醇、0.5g氯化钠、0.5g硫酸锌和0.02g氢氧化钠，提取1小时；合并提取液，回收乙醇，即得竹红菌素提取物。经检测，每克干粉可提取竹红菌素16.2毫克，粉末中竹红菌素的提取率达到81％。

实施例2

以实施例1中得到的竹黄菌固体发酵物料为原料，称取50g粉末放于提取器中，加入95％乙醇，并加入氯化钠、硫酸锌和氢氧化钠，热回流提取两次，每次加500ml 95％乙醇、0.8g氯化钠、0.8g硫酸锌和0.04g氢氧化钠，提取1小时；合并提取液，回收乙醇，即得竹红菌素提取物。经检测，每克干粉可提取竹红菌素17.6毫克，粉末中竹红菌素的提取率达到88％。

实施例3

以实施例1中得到的竹黄菌固体发酵物料为原料，称取50g粉末放于提取器中，加入95％乙醇，并加入氯化钠、硫酸锌和氢氧化钠，热回流提取两次，每次加500ml 95％乙醇、1.2g氯化钠、1.2g硫酸锌和0.07g氢氧化钠，提取1小时；合并提取液，回收乙醇，即得竹红菌素提取物。经检测，每克干粉可提取竹红菌素18.3毫克，粉末中竹红菌素的提取率达到92％。

实施例4

以实施例1中得到的竹黄菌固体发酵物料为原料，称取50g粉末放于提取器中，加入95％乙醇，并加入氯化钠、硫酸锌和氢氧化钠，热回流提取两次，每次加500ml 95％乙醇、2.5g氯化钠、2.5g硫酸锌和0.25g氢氧化钠，提取2小时；合并提取液，回收乙醇，即得竹红菌素提取物。经检测，每克干粉可提取竹红菌素19.1毫克，粉末中竹红菌素的提取率达到96％。

对比例1

以实施例1中得到的竹黄菌固体发酵物料为原料，称取50g粉末放于提取器中，加入95％乙醇，热回流提取两次，每次加500ml 95％乙醇提取1小时；合并提取液，回收乙醇，即得竹红菌素提取物。经检测，每克干粉可提取竹红菌素14.6毫克，粉末中竹红菌素的提取率达到73％。

对比例2

以实施例1中得到的竹黄菌固体发酵物料为原料，称取50g粉末放于提取器中，加入85％乙醇，热回流提取两次，每次加500ml 85％乙醇提取1小时，合并提取液，回收乙醇，加入6倍重量的丙酮趁热搅拌回流15分钟后，静置冷却至室温，过滤并回收丙酮得竹红菌素提取物。经检测，每克干粉可提取竹红菌素13.6毫克，粉末中竹红菌素的提取率达到68％。

对比例3

以实施例1中得到的竹黄菌固体发酵物料为原料，称取50g粉末放于提取器中，加入300ml 95％乙醇冷浸3次，每次24小时，合并提取液，回收乙醇，得竹红菌浸膏。经检测，每克干粉可提取竹红菌素12.2毫克，粉末中竹红菌素的提取率达到61％。

对比例4

以实施例1中得到的竹黄菌固体发酵物料为原料，称取50g粉末放于提取器中，加入95％乙醇，并加入氯化钠、硫酸锌和氢氧化钠，热回流提取两次，每次加125ml 95％乙醇、0.5g氯化钠、0.5g硫酸锌和0.02g氢氧化钠，提取1小时；合并提取液，回收乙醇，即得竹红菌素提取物。经检测，每克干粉可提取竹红菌素10.2毫克，粉末中竹红菌素的提取率达到51％。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (2)

1.一种从竹黄菌固态发酵料中提取竹红菌素的方法，其特征在于，包括以下步骤：将竹黄菌固态发酵后的发酵料制成粉末，加入乙醇溶液、氯化钠、硫酸锌和氢氧化钠，热回流提取，过滤收集滤液，减压回收乙醇，得竹红菌素提取物；

加入5-20倍重量、浓度为80-95％v/v的乙醇溶液；加入氯化钠的量为发酵料粉末重量的1-5％，加入硫酸锌的量为发酵粉末重量的1-5％，加入氢氧化钠的量为发酵粉末重量的0.05-0.5％。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，70℃-95℃温度下热回流提取至少一次，每次热回流提取0.5-2h。