CN105830744A - 一种可食用载体培养蛹虫草子实体的方法 - Google Patents
一种可食用载体培养蛹虫草子实体的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种可食用载体培养蛹虫草子实体的方法，属于蛹虫草培养技术领域。步骤为：（1）将红枣去核后烘干粉碎，然后与蔗糖、淀粉、甘露糖混合，加水使其呈可以捏成固体状但没有液体的浸出的状态，制成圆饼状，在抑制杂菌生长的条件下自然晾干，得到可食用载体；（2）将蛹虫草原菌种依次进行固体种子斜面培养基菌种的活化和液体种子培养基扩大培养，得到蛹虫草菌丝；（3）用可食用载体吸附蛹虫草菌丝，待可食用载体长满菌丝后放入新鲜的出草培养基中，采用划线处理结皮，用食用载体悬载法培养蛹虫草。本发明生长周期短，培养基利用率和有效成分利用率高，）实现了蛹虫草子实体大规模液态栽培。
Description
技术领域
本发明属于蛹虫草培养技术领域，具体涉及一种可食用载体培养蛹虫草子实体的方法。
背景技术
蛹虫草亦称北冬虫夏草，属于真菌门、子囊菌亚门、肉座菌目、麦角菌科、虫草属，寄生于夜蛾科等蛹体，分布于世界各地，是一种国内外公认的既可食用又可药用的真菌。
蛹虫草与冬虫夏草同属异种，是我国分布最广的具有药用价值的两种虫草属。研究表明蛹虫草与冬虫夏草具有相同属性，相似的药理功能及详尽的临床效果，可替代冬虫夏草如要。蛹虫草中含有虫草素、虫草多糖、虫草酸、腺苷等成分，具有增强免疫、抗氧化、抗病毒、抗菌、明显抑制肿瘤生长、预防治疗脑血栓、脑溢血、肾功能衰竭，利尿、抑制血小板积聚防止血栓形成，消除面斑，抗衰防皱、保护心脏，肝脏，抗痉等多种功能。
野生虫草资源有限，因此人们开始转而研究虫草的人工栽培。蛹虫草对于生长环境的要求相对较低，人工培育相比之下较容易，目前主要以液体发酵形成菌丝体，通过人工规模固体培养获得子实体，另外通过活体培养进行规模化蛹虫草生产成为现实。蛹虫草在培养过程中，如果杀菌不好或者消毒不严，易发生细菌、酵母菌和霉菌等污染。若出现细菌、酵母菌和霉菌污染，将对母种进一步纯化，严重的将被淘汰。由此可见，细菌、酵母菌和霉菌对蛹虫草的污染，将造成培养财力、物力损失，增加不必要的麻烦。
为了解决现有技术存在的上述缺陷，本发明研发了一种有可食用的抑菌功能的培养基，并进一步解决现有培养蛹虫草子实体存在的周期长、原料利用率低的缺陷。
发明内容
本发明的目的是提供一种可食用载体培养蛹虫草子实体的方法。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种可食用载体培养蛹虫草子实体的方法，步骤为：
（1）制备可食用载体：
将红枣去核后烘干粉碎，然后与蔗糖、淀粉、甘露糖混合，加水使其呈可以捏成固体状但没有液体的浸出的状态，制成圆饼状，在抑制杂菌生长的条件下自然晾干，得到可食用载体；
（2）菌种活化：
将蛹虫草原菌种依次进行固体种子斜面培养基菌种的活化和液体种子培养基扩大培养，得到蛹虫草菌丝；
（3）培养蛹虫草子实体：
用可食用载体吸附蛹虫草菌丝，待可食用载体长满菌丝后放入新鲜的出草培养基中，置于适宜的环境下培养加速了菌丝的扭结、转色、出草，过程中需采用划线处理结皮以便缩短出草周期，用食用载体悬载法培养蛹虫草。
进一步地，所述的红枣：蔗糖：淀粉：甘露糖的质量比为20～22：10～12： 13～15：甘露糖13～15。
所述的可食用载体吸附蛹虫草菌丝的吸附量为8％—10％。
所述的可食用载体长满菌丝后放入新鲜的出草培养基中，在温度20～25℃，湿度55～70%的环境中黑暗培养，当菌丝布满可食用载体表面后划线处理并移入15～20℃的环境中进行散射光刺激、温差刺激，诱导子实体产生，在子实体发生期要适当通风，增加新鲜空气。
所述的划线处理结皮是用消毒的铁丝或钢丝在菌丝体表面间隔1cm×1cm轻轻的划2mm深的网格以便刺激出草。
本发明方法使用可食用载体红枣、淀粉、蔗糖、甘露糖作为制备培养基的原料，利用可食用载体悬载法对蛹虫草子实体进行培养，采用正交优化实验确定对原基光照、温差刺激的最佳条件，确定子实体生长的最佳条件：其中光照刺激为，白天自然光，晚上黑暗培养；温差刺激为，白天温度为22℃，夜晚温度为27℃；连续刺激出草。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
（1）本发明培养蛹虫草子实体的生长周期为30天左右，相比传统的56天左右的培养周期，缩短了20天左右；
（2）传统的蛹虫草子实体类胡萝卜素含量为1.028mg/g，而利用本发明培养基，类胡萝卜素含量可达到1.653mg/g；
（3）实现了蛹虫草子实体大规模液态栽培。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
一种可食用载体悬载法培养蛹虫草子实体的方法，步骤：
（1）制备可食用载体：
先将可食红枣去核后烘干，并采用适当的方法将其粉碎后称取20g-22g，后称取适量的蔗糖10g-12g、淀粉13g-15g、甘露糖13-15g，将这几种原料与纯水按一定比例混合，使其可以捏成固体状但没有液体的浸出，将混合物捏成适宜大小且厚薄一致的圆饼状，放置通风处自然晾干，但要抑制杂菌的生长；
（2）可食用载体悬载法培养蛹虫草子实体：
首先对蛹虫草原菌种进行初步的活化，包括固体种子斜面培养基菌种的活化和液体种子培养基扩大培养，通过液体种子培养基培养出大量的蛹虫草菌丝，用已制备好的可食用载体吸附适量的蛹虫草菌种液菌丝，后期待食用载体长满菌丝后放入新鲜的出草培养基中，置于适宜的环境下培养加速了菌丝的扭结、转色、出草，过程中需采用划线处理结皮以便缩短出草周期，用食用载体悬载法培养蛹虫草；
其中斜面种子培养基PDA：称取200g左右去皮的马铃薯煮半小时后过滤得到液体，再加入大约20g葡萄糖、1.5g磷酸二氢钾、2g硫酸镁、0.5g蛋白胨、1g牛肉膏搅拌均匀，最后加入18g-20g琼脂粉，用玻璃棒在KDM型控温电热套中加热搅拌直至琼脂粉完全融化，分装加塞后在101KPa、121℃的条件下灭菌20min-30min。灭菌完成后，摆斜面备用，斜面培养基上画‘之’字接种后在20℃-24℃温度下培养7—10天，试管斜面菌种特征如表1所示，
表1
| 名称 | 透明度 | 颜色 | 凸起 | 菌丝形态 |
| 试管斜面菌种 | 不透明 | 白色略带橘色 | 有 | 绒毛状 |
液体种子培养基培养菌丝：称取葡萄糖40g、蛋白胨10g、磷酸二氢钾0.1g、硫酸镁0.5g，溶于适量蒸馏水中并用KDM型控温电热套加热使药品完全溶解后定容待1000mL，分装加塞后在101KPa、121℃的条件下灭菌20min-30min，灭菌后置于超净工作台备用，液体种子培养基中接入一厘米左右大小的菌块后放入恒温震荡培养器中，在23℃左右、120r/min条件下培养3—5天，液体锥形瓶菌种特征如表2所示；
表2
| 名称 | 菌丝形态 | 透明度 | 颜色 | 凸起 |
| 锥形瓶菌种 | 球状 | 不透明 | 乳脂色 | 不规则 |
可食用载体悬载法培养蛹虫草子实体：培养基配方为大米粉50g、蛋白胨9g、硫酸镁2g、磷酸二氢钾1.5g；高水平培养基3为：大米粉75g、蛋白胨13.5g、硫酸镁3g、磷酸二氢钾2.25g；低水平培养基1为：大米粉25g、蛋白胨4.5g、硫酸镁1g、磷酸二氢钾0.75g；可食载体覆盖液体培养基的百分比为70％-90％为宜；根据正交软件分析可得到出草时间直观分析表如表3所示，出草时间方差分析表如表4所示，
表3
| 因素 | 大米（A） | 蛋白胨（B） | 硫酸镁（C） | 磷酸二氢钾（D） | 出草时间（d） |
| 实验一 | 1 | 1 | 1 | 1 | 10 |
| 实验二 | 1 | 2 | 2 | 2 | 8.2 |
| 实验三 | 1 | 3 | 3 | 3 | 8.3 |
| 实验四 | 2 | 1 | 2 | 3 | 7.4 |
| 实验五 | 2 | 2 | 3 | 1 | 8 |
| 实验六 | 2 | 3 | 1 | 2 | 7.8 |
| 实验七 | 3 | 1 | 3 | 2 | 7 |
| 实验八 | 3 | 2 | 1 | 3 | 7.2 |
| 实验九 | 3 | 3 | 2 | 1 | 9.5 |
| 均值1 | 8.833 | 8.133 | 8.333 | 9.167 | |
| 均值2 | 7.733 | 7.800 | 8.367 | 7.667 | |
| 均值3 | 7.900 | 8.533 | 7.767 | 7.633 | |
| 极差R | 1.100 | 0.733 | 0.600 | 1.534 |
表4
| 因素 | 偏差平方和 | 自由度 | F比 | F临界值 | 显著性 |
| 大米 | 2.109 | 2 | 1.029 | 4.460 | 不显著 |
| 蛋白胨 | 0.809 | 2 | 0.395 | 4.460 | 不显著 |
| 硫酸镁 | 0.682 | 2 | 0.333 | 4.460 | 不显著 |
| 磷酸二氢钾 | 4.602 | 2 | 2.244 | 4.460 | 不显著 |
| 误差 | 8.20 | 8 |
对可食载体悬载法培养蛹虫草子实体产量的计算方法如下：待子实体长到5cm左右，其顶部出许多乳头状的小突起，或出现龟背状花纹，表明蛹虫草已经成熟，采收后测定蛹虫草子实体的鲜重；每瓶随机选择 10 根子实体，测定其直径及高度。
蛹虫草子实体中有效成分虫草素的提取：醇热回流法
材料：粉碎的蛹虫草子实体；70%乙醇
在培养皿中，称取0.5g-0.6g蛹虫草菌丝粉末放入试管，然后向每个试管加入5ml 70%乙醇，沸水浴约0.5h左右,待溶液冷却后，以5000r/min的速度,离心15min,然后用移液枪取大约650μl上清液注入试管内，每支试管加入4ml 70%乙醇，然后用紫外分光光度计在259nm处测定其吸光值。因为虫草素的含量与用紫外分光光度计测定出来的吸光值成正相关，所以可以通过比较吸光值的变化来比较不同样品中虫草素的含量变化。
测量成熟的蛹虫草子实体中的类胡萝卜素含量
采摘不同光照条件下蛹虫草子实体，把它们放入不同的培养皿中，放入60℃的烘箱中烘干，然后用粉碎机将样品粉碎，干燥条件下保存备用，不同的实验组中类胡萝卜素的含量如表5所示，不同的实验组中虫草素的吸光值如表6所示；
表5
| 类别 | 吸光值 | 类胡萝卜素含量（mg/g） |
| 12h/天蓝光 | 0.944 | 1.175 |
| 12h/天日光 | 0.912 | 1.140 |
| 24h/天蓝光 | 1.322 | 1.653 |
| 24h/天日光 | 1.121 | 1.401 |
| 24h/天黑暗 | 0.792 | 0.99 |
| 24h/天自然光 | 0.822 | 1.028 |
表6
| 类别 | 吸光值(1) | 吸光值(2) | 吸光值(3) | 吸光值的平均值 |
| 12h/天蓝光 | 1.534 | 1.023 | 1.342 | 1.300 |
| 12h/天日光 | 1.325 | 1.239 | 1.567 | 1.377 |
| 24h/天蓝光 | 1.023 | 1.216 | 0.878 | 1.039 |
| 24h/天日光 | 1.165 | 1.062 | 1.142 | 1.123 |
| 24h/天黑暗 | 1.656 | 1.768 | 1.649 | 1.691 |
| 12h/天自然光 | 1.574 | 1.673 | 1.432 | 1.560 |
提取方法：酸热法
材料：2mol/L盐酸；丙酮
在不同的培养皿中，称取约1g蛹虫草粉末，放入50ml的离心管中，然后加入配置好的2mol/L盐酸10ml。在室温下浸泡40min，然后放入100℃处理4min，等溶液冷却后，在离心机上以3000r/min的速度离心10min,离心完了之后，把离心管中的上清液倒掉。加入蒸馏水，再次离心，再次倒掉上清液，这个步骤重复两次。而后往每一个离心管加20ml丙酮，室温下震荡30min，再在4000r/min的条件下离心15min，得到上清液即为类胡萝卜素浸提液。
测量方法：将上述的提取液稀释十倍后，用紫外分光光度计在475nm处测定每个样品的吸光度，然后按照下列公式计算类胡萝卜素含量。
类胡萝卜素含量（μg/g）=A×V×D/0.16×W
A ___________475nm波长处的吸光度
V ___________丙酮用量ml
D __________测定式样时的稀释倍数
0.16___________类胡萝卜素克分子消光系数
W ___________蛹虫草样品的干质量g。
Claims (6)
1.一种可食用载体培养蛹虫草子实体的方法，其特征在于，步骤为：
（1）制备可食用载体：
将红枣去核后烘干粉碎，然后与蔗糖、淀粉、甘露糖混合，加水使其呈可以捏成固体状但没有液体的浸出的状态，制成圆饼状，在抑制杂菌生长的条件下自然晾干，得到可食用载体；
（2）菌种活化：
将蛹虫草原菌种依次进行固体种子斜面培养基菌种的活化和液体种子培养基扩大培养，得到蛹虫草菌丝；
（3）培养蛹虫草子实体：
用可食用载体吸附蛹虫草菌丝，待可食用载体长满菌丝后放入新鲜的出草培养基中，培养过程中需采用划线处理结皮，用食用载体悬载法培养蛹虫草。
2.根据权利要求1所述的可食用载体培养蛹虫草子实体的方法，其特征在于，所述的红枣：蔗糖：淀粉：甘露糖的质量比为20～22：10～12： 13～15：甘露糖13～15。
3.根据权利要求1或2所述的可食用载体培养蛹虫草子实体的方法，其特征在于，所述的可食用载体吸附蛹虫草菌丝的吸附量为体积的8％—10％。
4.根据权利要求1或2所述的可食用载体培养蛹虫草子实体的方法，其特征在于，所述的出草培养基为：大米粉50g、蛋白胨9g、硫酸镁2g、磷酸二氢钾1.5g；高水平培养基3为：大米粉75g、蛋白胨13.5g、硫酸镁3g、磷酸二氢钾2.25g；低水平培养基1为：大米粉25g、蛋白胨4.5g、硫酸镁1g、磷酸二氢钾0.75g。
5.根据权利要求1或2所述的可食用载体培养蛹虫草子实体的方法，其特征在于，所述的可食用载体长满菌丝后放入新鲜的出草培养基中， 当菌丝布满培养基表面后划线处理并移入15～20℃的环境中进行散射光刺激、温差刺激，诱导子实体产生，在子实体发生期要适当通风，增加新鲜空气防止菌丝自溶现象的发生。
6.根据权利要求1或2所述的可食用载体培养蛹虫草子实体的方法，其特征在于，所述的划线处理结皮是用消毒的铁丝或钢丝在菌丝体表面间隔1cm×1cm轻轻的划2mm深的网格以便刺激出草。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |