CN110129207A - 一种高产抗氧化蝉花菌丝体的液体发酵培养基及其抗氧化蝉花菌丝体冲剂的生产方法 - Google Patents
一种高产抗氧化蝉花菌丝体的液体发酵培养基及其抗氧化蝉花菌丝体冲剂的生产方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种高产抗氧化蝉花菌丝体的液体发酵培养基及其抗氧化蝉花菌丝体冲剂的生产方法，该培养基组成包括：质量分数分别为1‑5％葡萄糖、1‑10％高分子碳源、1‑10％氮源、0‑0.5％无机盐，以蒸馏水为溶剂，pH自然。本发明高产抗氧化蝉花菌丝体的液体发酵培养基配方改良发酵获得高产的蝉花菌丝体，生物量含量高，有效成分多糖和甘露醇含量高，抗氧化活性强，增加保健食品原料的来源；同时利用液体发酵技术获得蝉花菌丝体，生产成本低、周期短、不受环境条件限制，适合大规模的工厂化生产和推广；本发明生产的高产抗氧化蝉花菌丝体冲剂，具有易吸收利用、携带便利、滋补强壮的功效。
Description
技术领域
本发明属于发酵技术和微粉技术生产领域，涉及虫草保健食品，具体涉及一种高产抗氧化蝉花菌丝体的液体发酵培养基及其抗氧化蝉花菌丝体冲剂的生产方法。
背景技术
蝉花(Cordyceps cicadae)是一种药食两用真菌，亦是我国传统名贵中药材之一。国内外研究发现蝉花具有广泛的药理活性，蝉花能增强机体免疫调节功能、滋补强壮，提升机体的营养状况，解热镇痛，改善肾功能，抗辐射、抗疲劳、抗应激、抗氧化，抑菌，抗肿瘤、抗病毒，调节脂质代谢，降血压、降血糖，抗惊厥等作用。
抗氧化能力是衡量营养健康食品和植物生物活性成分的重要指标。研究证明，蝉花多糖具有抗氧化、增强免疫功能、抗肿瘤、改善肾功能等作用；虫草酸是虫草类真菌中的重要有效成分之一，具有清除自由基、利尿、提高血浆渗透压、降低颅内压和眼内压、治疗脑水肿与青光眼及烧伤休克等并发的急性肾功能不全等作用。
蝉拟青霉(Paecilomyces cicadae)为虫草属真菌，是中药蝉花的无性型时期，蝉拟青霉寄生于一些蝉若虫后形成的复合体为蝉花。它的所含成分和药用价值能够与冬虫夏草媲美，具有较高的食用、营养和药用价值，被认为是和冬虫夏草相近的最具开发利用前景的珍贵菌类之一。
由于蝉花生长需要特定的生态环境和寄主昆虫，再加上长期采挖，资源日趋枯竭，远远达不到市场需求。为了对极其有限的野生蝉花资源进行可持续的永久利用，可利用生物发酵技术来获得高含量有效成分的蝉拟青霉菌丝体。
虫草类真菌的生产都可通过液体发酵或固体培养获得，且多糖、甘露醇等活性成分超过了蝉花，不仅可以克服化学合成中可能存在的高成本及对环境污染问题，也可以避免人工栽培过程周期长、易受气候、土壤和病虫害等的影响。发酵蝉花菌丝体进一步加工成速溶冲剂，易吸收利用，且携带便利及具有滋补强壮的功效，具有极高的开发价值。而现有天然蝉花至少5-6年时间才长成，每年只能在夏季6-8月份采摘1次，价格1-10元/株，野生资源稀少且逐年减少，天然的资源有限，生长周期长。
发明内容
发明目的：针对现有技术存在的问题，本发明提供一种高产抗氧化蝉花菌丝体的液体发酵培养基及其抗氧化蝉花菌丝体冲剂的生产方法。本发明高产抗氧化蝉花菌丝体的液体发酵培养基配方改良发酵获得高产的蝉花菌丝体，生物量含量高，有效成分多糖和甘露醇含量高，抗氧化活性强，增加保健食品原料的来源；同时利用液体发酵技术获得蝉花菌丝体，生产成本低、周期短、不受环境条件限制，适合大规模的工厂化生产和推广。
技术方案：为了实现上述目的，如本发明所述一种高产抗氧化蝉花菌丝体的液体发酵培养基，其特征在于，所述的培养基组成包括：质量分数分别为1-5％葡萄糖、1-10％高分子碳源、1-10％氮源、0-0.5％无机盐，以蒸馏水为溶剂，pH自然。
作为优选，所述的培养基组成包括：质量分数分别为4％葡萄糖、5％高分子碳源、4％氮源、0.1％无机盐，以蒸馏水为溶剂，pH自然。
进一步地，所述的高分子碳源为铁棍山药粉；所述的氮源为蛋白胨；所述的无机盐为MgCl2·6H2O。
本发明中的高产抗氧化蝉花菌丝体的液体发酵培养基，首先按比例将高分子碳源如铁棍山药粉加入到蒸馏水，用大火煮沸，改为文火持续30min，用80目纱网过滤，收集滤液，在滤液中按比例加入葡萄糖、氮源、无机盐，使其充分溶解，加入蒸馏水补足体积。
例如，质量分数分别为4％葡萄糖、5％高分子碳源、4％氮源、0.1％无机盐的培养基，首先称取50g铁棍山药粉放入不锈钢容器中，加入1000mL蒸馏水，用大火煮沸，改为文火持续30min，用80目纱网过滤，收集滤液，加入40g葡萄糖、40g蛋白胨、1g MgCl2·6H2O，使其充分溶解，用蒸馏水补齐1000mL。
在本发明培养基中高分子碳源的最终含量，即为高分子碳源如铁棍山药粉初始加入水中的量再进行滤液制备(培养基中包括5％高分子碳源铁棍山药粉，即为取50g铁棍山药粉加入1000mL蒸馏水中)，其他葡萄糖、氮源、无机盐均为最终溶液的量。
本发明所述一种利用高产抗氧化蝉花菌丝体的液体发酵培养基生产抗氧化蝉花菌丝体冲剂的方法，包括如下步骤：
(1)菌种活化：将斜面培养的蝉拟青霉菌无菌操作分割成绿豆粒大小，接种至PDA斜面培养基上活化，25℃下培养5-7d，即可使用；
(2)种子液制备：将步骤1)中活化菌种无菌操作分割成黄豆粒大小，接种到种子培养液中，得一级种；将已经培养好的一级种无菌操作接种到同样种子培养液中，与一级种同样条件下培养1-2d，得二级种；
(3)发酵培养基制备：按比例称取的高分子碳源放入容器中，加入蒸馏水，用大火煮沸，改为文火，过滤，收集滤液，加入葡萄糖、氮源、无机盐，使其充分溶解，加入蒸馏水；灭菌冷却至室温得到发酵培养基；
(4)接种：将步骤(2)中的二级种无菌接种到步骤(3)发酵培养基；
(5)发酵培养：将步骤(4)中接种的发酵培养基，于25℃，转速180r/min下振荡培养7-10d，得发酵液；
(6)离心：将步骤(5)中发酵培养所得发酵液离心，于4000r/min下离心20min，得蝉花菌丝体；
(7)干燥粉碎：将步骤(6)所述得到的蝉花菌丝体干燥，50-60℃烘箱或60-70℃真空干燥箱烘干；将干燥蝉花菌丝体粉碎，用粉碎机进行初步粉碎；
(8)干燥超微粉碎：将初步粉碎的蝉花菌丝体粗粉进一步干燥，50-60℃烘箱或60-70℃真空干燥箱烘干，使蝉花菌丝体粗粉含水量低于4％；进行超微粉碎，过筛，得蝉花菌丝体微粉；
(9)包装辐照灭菌：将蝉花菌丝体微粉进行包装，包装产品进行辐照，得蝉花菌丝体冲剂成品。
其中，步骤(2)所述种子培养液：溶剂为水，包含以下质量分数原料：蔗糖2％，可溶性淀粉3％，豆粉2％，KH2PO4 0.1％，MgSO4·7H2O 0.05％，pH自然，装液量为40％每瓶体积，每瓶可加3-5颗玻璃珠。
进一步地，步骤(2)所述种子培养液中每瓶接种3-8块黄豆粒大小活化菌种，于25℃，180r/min振荡培养2-3d，得一级种。
作为优选，步骤(2)所述一级种按体积分数10-15％接种到同样种子培养液中，步骤(4)所述二级种按体积分数10-15％接种发酵培养基。
进一步地，其特征在于，步骤(8)所述超微粉碎过筛后，制成500目以上的微粉。
本发明中原料均由市售可得。本发明中的蝉拟青霉菌株由江苏食用菌研究所提供，可以采用市售的蝉拟青霉，或者采用常规的自然界分离的野生型蝉拟青霉均可。
有益效果：与现有技术相比本发明具有如下优点：
1、本发明的蝉花菌丝体的液体发酵培养基，适合发酵生产蝉花菌丝体，获得的菌丝体生物量高，抗氧化活性强，活性物质多糖和虫草酸含量高，增加保健食品原料的来源。采用本发明的培养基配方：葡萄糖4％、山药5％、蛋白胨4％、MgCl2·6H2O 0.1％，发酵所得蝉花菌丝体生物量达8.71g/100mL，多糖含量和虫草酸含量分别达1450.48mg/100mL、285.74mg/100mL；山药粉发酵得到的蝉花菌丝体提取物清除DPPH自由基活性为95.47％。本发明的培养基生产的蝉花菌丝体生物量是优化前的2.07倍，多糖含量有所提高，虫草酸含量是优化前的7倍，对清除DPPH自由基活性是优化前的2.16倍(见表8)。
2、本发明的利用高产抗氧化蝉花菌丝体液体发酵培养基进行液体发酵技术获得蝉花菌丝体，生产成本低、周期短、不受环境条件限制，适合大规模的工厂化生产和推广，相对于天然蝉花至少5-6年时间才长成，每年只能在夏季6-8月份采摘1次，本发明的蝉花菌丝体液体发酵用培养基便宜易得，从母种到发酵结束最多需要23d，可以长期周年化生产。
3、本发明生产的高产抗氧化蝉花菌丝体冲剂，具有易吸收利用、携带便利、滋补强壮的功效。
附图说明
图1是本发明高产抗氧化蝉花菌丝体冲剂的生产方法的流程图。
具体实施方式
以下结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
实施例1
高产抗氧化蝉花菌丝体冲剂的生产流程如图1所示。
1)菌种活化：将斜面培养的蝉拟青霉菌无菌操作分割成绿豆粒大小，接种至PDA斜面培养基上，25℃下培养5d；
2)种子液制备：将活化菌种无菌操作分割成黄豆粒大小，接种到种子培养液(质量分数蔗糖2％，可溶性淀粉3％，豆粉2％，KH2PO4 0.1％，MgSO4·7H2O 0.05％，pH自然，装液量为40％，每250mL的三角瓶加3-5颗玻璃珠)中，每瓶接种4块，于25℃，180r/min振荡培养3d，得一级种。将已经培养好的一级种以体积分数10％无菌操作接种到同样种子培养液中，与一级种同样条件下培养得二级种；
3)发酵培养基制备(以配制1000mL培养基质为例)：称取50g铁棍山药粉放入不锈钢容器中，加入1000mL蒸馏水，用大火煮沸，改为文火持续30min，用80目纱网过滤，收集滤液，加入40g葡萄糖、40g蛋白胨、1g MgCl2·6H2O，使其充分溶解，用蒸馏水补齐1000mL，将发酵培养基分装于250mL的三角瓶，每瓶分装100mL，盖上透气硅胶塞，牛皮纸包扎，采用高压蒸汽灭菌，高压蒸汽灭菌121℃，维持20min，冷却至室温备用；
4)接种：在无菌条件下，移取10mL二级种接种到灭菌好的发酵培养基里；
5)发酵培养：将接种好的发酵培养基，于25℃，转速180r/min下振荡培养7d，得发酵液；
6)离心：将发酵液于4000r/min下离心20min，得蝉花菌丝体；
7)干燥粉碎：将蝉花菌丝体置于60℃烘箱中烘干；将干燥蝉花菌丝体用粉碎机进行初步粉碎；
8)干燥超微粉碎：将蝉花菌丝体粗粉置于70℃真空干燥箱烘干，使蝉花菌丝体粗粉含水量低于4％，将干燥后的蝉花菌丝体粉末用超细粉体设备进一步粉碎，过筛，制成500目以上的蝉花菌丝体微粉；
9)包装辐照灭菌：将蝉花菌丝体微粉进行包装，用包装机按1g/包定量包装蝉花菌丝体微粉，制得蝉花菌丝体冲剂；将包装产品送到具有辐照杀菌资质的单位，用钴60辐照，得蝉花菌丝体冲剂成品。
本实施例的高产抗氧化蝉花菌丝体的液体发酵培养基包括：质量分数分别为4％葡萄糖、5％高分子碳源铁棍山药粉、4％氮源蛋白胨、0.1％无机盐MgCl2·6H2O，以蒸馏水为溶剂，pH自然。
检测：发酵所得蝉花菌丝体生物量为8.75g/100mL，多糖含量和虫草酸含量分别为1568.21mg/100mL、142.97mg/100mL；山药粉发酵得到的蝉花菌丝体提取物清除DPPH自由基活性为96.14％。
实施例2：
1)菌种活化：将斜面培养的蝉拟青霉菌无菌操作分割成绿豆粒大小，接种至PDA斜面培养基上，25℃下培养5d。
2)种子液制备：将活化菌种无菌操作分割成黄豆粒大小，接种到种子培养液(蔗糖2％，可溶性淀粉3％，豆粉2％，KH2PO4 0.1％，MgSO4·7H2O 0.05％，pH自然，装液量为40％，每250mL的三角瓶加3-5颗玻璃珠)中，每瓶接种8块，于25℃，180r/min振荡培养2d，得一级种；将已经培养好的一级种以体积分数10％无菌操作接种到同样种子培养液中，与一级种同样条件下培养得二级种；
3)发酵培养基制备(以配制1000mL培养基质为例)：称取50g铁棍山药粉放入不锈钢容器中，加入1000mL蒸馏水，用大火煮沸，改为文火持续30min，用80目纱网过滤，收集滤液，加入40g葡萄糖、30g蛋白胨、0.5g MgCl2·6H2O，使其充分溶解，用蒸馏水补齐1000mL；将发酵培养基分装于250mL的三角瓶，每瓶分装100mL，盖上透气硅胶塞，牛皮纸包扎，采用高压蒸汽灭菌，高压蒸汽灭菌121℃，维持30min。冷却至室温备用；
4)接种：在无菌条件下，移取10mL二级种接种到灭菌好的发酵培养基里；
5)发酵培养：将接种好的发酵培养基，于25℃，转速180r/min下振荡培养10d，得发酵液；
6)离心：将发酵液于4000r/min下离心20min，得蝉花菌丝体；
7)干燥粉碎：将蝉花菌丝体置于70℃真空干燥箱中烘干；将干燥蝉花菌丝体用粉碎机进行初步粉碎；
8)干燥超微粉碎：将蝉花菌丝体粗粉置于50℃烘箱烘干，使蝉花菌丝体粗粉含水量低于4％；将干燥后的蝉花菌丝体粉末用超细粉体设备进一步粉碎，过筛，制成500目以上的蝉花菌丝体微粉；
9)包装辐照灭菌：将蝉花菌丝体微粉进行包装，用包装机按2g/包定量包装蝉花菌丝体微粉，制得蝉花菌丝体冲剂；将包装产品送到具有辐照杀菌资质的单位，用钴60辐照，得蝉花菌丝体冲剂成品。
本实施例的高产抗氧化蝉花菌丝体的液体发酵培养基包括：质量分数分别为4％葡萄糖、5％高分子碳源铁棍山药粉、3％氮源蛋白胨、0.5％无机盐MgCl2·6H2O，以蒸馏水为溶剂，pH自然。
检测：发酵所得蝉花菌丝体生物量为8.56g/100mL，多糖含量和虫草酸含量分别为1588.14mg/100mL、147.65mg/100mL；山药粉发酵得到的蝉花菌丝体提取物清除DPPH自由基活性为95.55％。
实施例3
1)菌种活化：将斜面培养的蝉拟青霉菌无菌操作分割成绿豆粒大小，接种至PDA斜面培养基上，25℃下培养5d；
2)种子液制备：将活化菌种无菌操作分割成黄豆粒大小，接种到种子培养液(质量分数蔗糖2％，可溶性淀粉3％，豆粉2％，KH2PO4 0.1％，MgSO4·7H2O 0.05％，pH自然，装液量为40％，每250mL的三角瓶加3-5颗玻璃珠)中，每瓶接种3块，于25℃，180r/min振荡培养2d，得一级种。将已经培养好的一级种以体积分数15％无菌操作接种到同样种子培养液中，与一级种同样条件下培养得二级种；
3)发酵培养基制备(以配制1000mL培养基质为例)：称取10g铁棍山药粉放入不锈钢容器中，加入1000mL蒸馏水，用大火煮沸，改为文火持续30min，用80目纱网过滤，收集滤液，加入10g葡萄糖、10g蛋白胨，使其充分溶解，用蒸馏水补齐1000mL，将发酵培养基分装于250mL的三角瓶，每瓶分装100mL，盖上透气硅胶塞，牛皮纸包扎，采用高压蒸汽灭菌，高压蒸汽灭菌121℃，维持20min，冷却至室温备用；
4)接种：在无菌条件下，移取15mL二级种接种到灭菌好的发酵培养基里；
5)发酵培养：将接种好的发酵培养基，于25℃，转速180r/min下振荡培养7d，得发酵液；
6)离心：将发酵液于4000r/min下离心20min，得蝉花菌丝体；
7)干燥粉碎：将蝉花菌丝体置于60℃真空干燥箱烘干；将干燥蝉花菌丝体用粉碎机进行初步粉碎；
8)干燥超微粉碎：将蝉花菌丝体粗粉置于60℃真空干燥箱烘干，使蝉花菌丝体粗粉含水量低于4％，将干燥后的蝉花菌丝体粉末用超细粉体设备进一步粉碎，过筛，制成500目以上的蝉花菌丝体微粉；
9)包装辐照灭菌：将蝉花菌丝体微粉进行包装，用包装机按1g/包定量包装蝉花菌丝体微粉，制得蝉花菌丝体冲剂；将包装产品送到具有辐照杀菌资质的单位，用钴60辐照，得蝉花菌丝体冲剂成品。
本实施例的高产抗氧化蝉花菌丝体的液体发酵培养基包括：质量分数分别为1％葡萄糖、1％高分子碳源铁棍山药粉、1％氮源蛋白胨，以蒸馏水为溶剂，pH自然。
实施例4
1)菌种活化：将斜面培养的蝉拟青霉菌无菌操作分割成绿豆粒大小，接种至PDA斜面培养基上，25℃下培养5d；
2)种子液制备：将活化菌种无菌操作分割成黄豆粒大小，接种到种子培养液(质量分数蔗糖2％，可溶性淀粉3％，豆粉2％，KH2PO4 0.1％，MgSO4·7H2O 0.05％，pH自然，装液量为40％，每250mL的三角瓶加3-5颗玻璃珠)中，每瓶接种8块，于25℃，180r/min振荡培养3d，得一级种。将已经培养好的一级种以体积分数15％无菌操作接种到同样种子培养液中，与一级种同样条件下培养得二级种；
3)发酵培养基制备(以配制1000mL培养基质为例)：称取100g铁棍山药粉放入不锈钢容器中，加入1000mL蒸馏水，用大火煮沸，改为文火持续30min，用80目纱网过滤，收集滤液，加入50g葡萄糖、100g蛋白胨、5g MgCl2·6H2O，使其充分溶解，用蒸馏水补齐1000mL，将发酵培养基分装于250mL的三角瓶，每瓶分装100mL，盖上透气硅胶塞，牛皮纸包扎，采用高压蒸汽灭菌，高压蒸汽灭菌121℃，维持20min，冷却至室温备用；
4)接种：在无菌条件下，移取15mL二级种接种到灭菌好的发酵培养基里；
5)发酵培养：将接种好的发酵培养基，于25℃，转速180r/min下振荡培养7d，得发酵液；
6)离心：将发酵液于4000r/min下离心20min，得蝉花菌丝体；
7)干燥粉碎：将蝉花菌丝体置于60℃烘箱中烘干；将干燥蝉花菌丝体用粉碎机进行初步粉碎；
8)干燥超微粉碎：将蝉花菌丝体粗粉置于70℃真空干燥箱烘干，使蝉花菌丝体粗粉含水量低于4％，将干燥后的蝉花菌丝体粉末用超细粉体设备进一步粉碎，过筛，制成500目以下的蝉花菌丝体微粉；
9)包装辐照灭菌：将蝉花菌丝体微粉进行包装，用包装机按2g/包定量包装蝉花菌丝体微粉，制得蝉花菌丝体冲剂；将包装产品送到具有辐照杀菌资质的单位，用钴60辐照，得蝉花菌丝体冲剂成品。
本实施例的高产抗氧化蝉花菌丝体的液体发酵培养基包括：质量分数分别为5％葡萄糖、10％高分子碳源铁棍山药粉、10％氮源蛋白胨、0.5％无机盐、MgCl2·6H2O，以蒸馏水为溶剂，pH自然。
本发明中上述实施例和试验例中各含量检测如下：
蝉花菌丝体生物量测定：采用细胞干重法，将发酵液倒入离心杯中，于4000r/min下离心20min，弃上清，并用蒸馏水悬浮离心进行清洗，重复3次(去培养基中的淀粉等干扰)，收集沉淀，于60℃干燥至恒重，称重，即得蝉花菌丝体生物量。
蝉花菌丝体活性物质的提取：采用沸水提取法，将干菌丝体研成粉末状，精确称取菌丝体粉末0.5000g菌丝体粉末，加水100mL沸水提取2h，冷却至室温，过滤，滤液加水定容至100mL，即为提取液。取提取液5mL，定容至100mL，摇匀，即为提取稀释液。
多糖的含量测定：采用苯酚-硫酸法测定。移取提取液10.0mL分别缓缓加入95％乙醇80mL，并不断搅拌，静置过夜，离心，沉淀物用少量蒸馏水溶解，乙醇在60℃水浴锅上挥发掉，定容至100mL，溶液待测。移取溶液1mL，测定其吸光度，计算得多糖含量。
虫草酸含量测定：采用高碘酸钠比色法测定，移取蝉花菌丝体提取稀释液1-2mL，测定其吸光度，计算得虫草酸含量。
蝉花菌丝体的抗氧化活性测定：采用DPPH自由基(DPPH·)方法，参照不同灵芝菌株功能性成分含量及其抗氧化活性比较(2016年)中的方法。移取蝉花菌丝体提取液4.0mL，测定其吸光度，计算对DPPH自由基清除率。
试验例1
不同高分子碳源发酵的蝉花菌丝生物量、多糖含量、虫草酸含量和DPPH清除率。
高分子碳源筛选培养基为高分子碳源3％、蔗糖2％，大豆粉2％，KH2PO4 0.1％，MgSO4·7H2O 0.05％，pH自然，分别以红薯淀粉、木薯淀粉、铁棍山药粉、茯苓粉、小麦淀粉、玉米淀粉、大米粉作为高分子碳源(其中淀粉类的都是直接添加到水中溶解，铁棍山药粉、茯苓粉、大米粉采用实施例1的方法煮沸收集提滤液)。
蝉花菌丝体的生产方法采用实施例1的中方法。
表1不同高分子碳源发酵的蝉花菌丝生物量、多糖含量、虫草酸含量和DPPH清除率
由表1可知，铁棍山药粉作为高分子碳源发酵得到的蝉花菌丝体生物量最多，达3.33g/100mL；高分子碳源发酵得到的蝉花菌丝体中，木薯淀粉发酵的多糖含量最高，铁棍山药粉其次，蝉花菌丝体中多糖含量分别为271.21mg/100mL、230.18mg/100mL；铁棍山药粉发酵的虫草酸含量最高，达182.92mg/100mL；铁棍山药粉发酵得到的蝉花菌丝体提取物清除DPPH自由基活性最高，达93.74％。由此可见，铁棍山药粉作为高分子碳源发酵，有利于蝉花菌丝体生物量的增加以及活性成分多糖和虫草酸的积累，更是极显著的增加了抗氧化活性。
综合考虑，铁棍山药粉为最优的高分子碳源，其发酵的蝉花菌丝体生物量、多糖含量、虫草酸含量均较高，以及抗氧化活性最强。
试验例2
不同小分子碳源发酵的蝉花菌丝生物量、多糖含量、虫草酸含量和DPPH清除率。
小分子碳源筛选培养基为小分子碳源2％，大豆粉2％，KH2PO4 0.1％，MgSO4·7H2O0.05％，pH自然，分别以葡萄糖、蔗糖、果糖、甘露醇作为小分子碳源。
蝉花菌丝体的生产方法采用实施例1的中方法。
表2不同小分子碳源发酵的蝉花菌丝生物量、多糖含量、虫草酸含量和DPPH清除率
由表2可知，不同小分子碳源发酵得到的蝉花菌丝体中，蔗糖发酵的生物量最多，达3.33/100mL g，甘露醇次之，葡萄糖的最少；葡萄糖发酵的多糖含量最高，甘露醇其次，蝉花菌丝体中多糖含量分别为2120.33mg/100mL、557.86mg/100mL；甘露醇发酵的虫草酸含量最高，葡萄糖其次，蝉花菌丝体中虫草酸含量分别为299.96mg/100mL、35.72mg/100mL；甘露醇和葡萄糖发酵得到的蝉花菌丝体提取物清除DPPH自由基活性较强，分别为48.27％、47.19％。从上述的比较可知，蔗糖作为小分子碳源发酵，有利于蝉花菌丝体生物量的增加；甘露醇和葡萄糖作为小分子碳源发酵，分别有利于活性成分多糖和虫草酸的积累，对抗氧化活性有一定的提高；而葡萄糖相较与甘露糖要便宜易得。
试验例3
不同氮源发酵的蝉花菌丝生物量、多糖含量、虫草酸含量和DPPH清除率。
氮源筛选培养基为氮源2％，蔗糖2％，可溶性淀粉3％，KH2PO4 0.1％，MgSO4·7H2O0.05％，pH自然，分别以大豆粉、麸皮、金蝉粉、蛋白胨、酵母膏作为氮源。其中大豆粉、麸皮、金蝉粉分别称取20g，放入不锈钢容器中，加入1000mL蒸馏水，用大火煮沸，改为文火持续30min，用80目纱网过滤，收集滤液，用滤液溶解30g可溶性淀粉，加入20g蔗糖、1g KH2PO4、0.5g MgSO4·7H2O，使其充分溶解，用蒸馏水补齐1000mL，其他氮源和其他原料直接溶解于水中即可。
蝉花菌丝体的生产方法采用实施例1的中方法。
表3不同氮源发酵的蝉花菌丝生物量、多糖含量、虫草酸含量和DPPH清除率
由表3可知，不同氮源发酵得到的蝉花菌丝体中，蛋白胨发酵的生物量、多糖含量、虫草酸含量最多，分别为4.80g/100mL、2096.65mg/100mL、214.39mg/100mL；蛋白胨发酵得到的蝉花菌丝体提取物清除DPPH自由基活性也是最高，达96.62％。由此可见，蛋白胨作为氮源发酵，有利于蝉花菌丝体生物量的增加以及活性成分多糖和虫草酸的积累，更是极显著的增加了抗氧化活性。
综合考虑，蛋白胨为最优的氮源，其发酵的蝉花菌丝体生物量、多糖含量、虫草酸含量均最高，以及抗氧化活性最强。
试验例4
不同无机盐发酵的蝉花菌丝生物量、多糖含量、虫草酸含量和DPPH清除率。
无机盐筛选培养基为无机盐0.05％，蔗糖2％，可溶性淀粉3％，豆粉2％，pH自然，分别以FeSO4·7H2O、FeCl3·6H2O、CaCO3、CaCl2、MgCl2·6H2O作为无机盐。
表4不同无机盐发酵的蝉花菌丝生物量、多糖含量、虫草酸含量和DPPH清除率
由表4可知，不同无机盐发酵得到的蝉花菌丝体中，MgCl2·6H2O发酵的生物量、多糖含量、虫草酸含量最多，分别为4.08g、1217.44mg/100mL、275.05mg/100mL；FeSO4·7H2O和MgCl2·6H2O发酵得到的蝉花菌丝体提取物，清除DPPH自由基活性较强，分别为93.97％、86.48％。由此可见，MgCl2·6H2O作为氮源发酵，有利于蝉花菌丝体生物量的增加以及活性成分多糖和虫草酸的积累，并显著的增加了抗氧化活性。值得注意的是，FeCl3·6H2O对蝉花菌丝体生物量的增加及活性成分虫草酸的积累有抑制作用，因此在配制培养基时应避免使用铁器。
综合考虑，MgCl2·6H2O为最优的无机盐，其发酵的蝉花菌丝体生物量、多糖含量、虫草酸含量均最高，以及抗氧化活性很强。
试验例5
本发明高产抗氧化蝉花菌丝体的液体发酵培养基与基础培养基验证结果比较，并采用实施例1的中方法生产蝉花菌丝体冲剂，并对生物量、多糖含量、虫草酸含量和DPPH清除率进行检测。
表5培养基因素水平表
表6液体发酵蝉花菌丝体的生物量和抗氧化活性正交试验结果
注：K11表示第1水平生物量平均值，K12表示第2水平生物量平均值；K13表示第3水平生物量平均值；R1表示生物量平均值的极差。K21表示第1水平抗氧化活性平均值，K22表示第2水平抗氧化活性平均值；K23表示第3水平抗氧化活性平均值；R2表示抗氧化活性平均值的极差。
利用正交试验对液体发酵蝉花菌丝体的培养基进行了优化，结果见表6和表7。由表6可知，从液体发酵所得蝉花菌丝体的生物量来考察各因素水平值，最优培养基为A3B3C3D2，据极差分析结果R1可知，各因素对蝉花菌丝体生物量的影响大小依次为C>A>B>D；从液体发酵所得蝉花菌丝体的抗氧化活性来考察各因素水平值，最优培养基为A1B3C3D2，据极差分析结果R2可知，各因素对蝉花菌丝体抗氧化活性的影响大小依次为D>B>A>C。由于A因素对蝉花菌丝体抗氧化活性的影响为次要因素，因此，选择A3B3C3D2为最优培养基。
表7液体发酵蝉花菌丝体多糖和虫草酸含量正交试验结果
注：K31表示第1水平多糖含量平均值，K32表示第2水平多糖含量平均值；K33表示第3水平多糖含量平均值；R3表示多糖含量平均值的极差。K41表示第1水平虫草酸含量平均值，K42表示第2水平虫草酸含量平均值；K43表示第3水平虫草酸含量平均值；R4表示虫草酸含量平均值的极差。
由表7可知，从液体发酵所得蝉花菌丝体的多糖含量来考察各因素水平值，最优培养基为A3B3C2D1，据极差分析结果R3可知，各因素对蝉花菌丝体多糖含量的影响大小依次为A>B>C>D；从液体发酵所得蝉花菌丝体的虫草酸含量来考察各因素水平值，最优培养基为A3B3C2D2，据极差分析结果R4可知，各因素对蝉花菌丝体虫草酸含量的影响大小依次为A>B>D>C。由于C、D两因素对蝉花菌丝体多糖和虫草酸含量的影响均为次要因素，考虑到蝉花菌丝体的生物量和抗氧化活性，因此，选择A3B3C3D2为最优培养基。
综合上所述，确定最佳培养基为A3B3C3D2，即葡萄糖4％、铁棍山药粉5％、蛋白胨4％、MgCl2·6H2O 0.1％。
表8基础培养基与本发明的培养基验证结果比较
基础培养基配方：蔗糖2％、可溶性淀粉3％、大豆粉2％、KH2PO4 0.1％、MgSO4·7H2O 0.05％；本发明的培养基配方：葡萄糖4％、铁棍山药粉5％、蛋白胨4％、MgCl2·6H2O0.1％。
由表8可知，本发明的培养基配方蝉花菌丝体生物量是基础培养基的2.07倍，多糖含量有所提高，虫草酸含量是基础培养基的7倍，对清除DPPH自由基活性是基础培养基的2.16倍。表明本发明的培养基各成分及其浓度以及本发明的生产方法，能更有利于蝉花菌丝体生物量的积累，促进了生物活性物质多糖和虫草酸的产生，显著提高了抗氧化活性。
Claims (10)
1.一种高产抗氧化蝉花菌丝体的液体发酵培养基，其特征在于，所述的培养基组成包括：质量分数分别为1-5％葡萄糖、1-10％高分子碳源、1-10％氮源、0-0.5％无机盐，以蒸馏水为溶剂。
2.根据权利要求1所述的高产抗氧化蝉花菌丝体的液体发酵培养基，其特征在于，所述的培养基组成包括：质量分数分别为4％葡萄糖、5％高分子碳源、4％氮源、0.1％无机盐，以蒸馏水为溶剂。
3.根据权利要求1所述的高产抗氧化蝉花菌丝体的液体发酵培养基，其特征在于，所述的高分子碳源为铁棍山药粉。
4.根据权利要求1所述的高产抗氧化蝉花菌丝体的液体发酵培养基，其特征在于，所述的氮源为蛋白胨。
5.根据权利要求1所述的高产抗氧化蝉花菌丝体的液体发酵培养基，其特征在于，所述的无机盐为MgCl2·6H2O。
6.一种生产高产抗氧化蝉花菌丝体冲剂的方法，其特征在，包括如下步骤：
(1)菌种活化：将蝉拟青霉无菌操作分割成绿豆粒大小，接种至PDA斜面培养基上活化培养，即可使用；
(2)种子液制备：将步骤1)中活化菌种无菌操作分割成黄豆粒大小，接种到种子培养液中，得一级种；将已经培养好的一级种接种到同样种子培养液中，与一级种同样条件下培养，得二级种；
(3)发酵培养基制备：按比例称取的高分子碳源放入容器中，加入蒸馏水，用大火煮沸，改为文火，过滤，收集滤液，加入葡萄糖、氮源、无机盐，使其充分溶解，加入蒸馏水；灭菌冷却至室温得到发酵培养基；
(4)接种：将步骤(2)中的二级种接种到步骤(3)发酵培养基；
(5)发酵培养：将步骤(4)中接种的发酵培养基振荡培养得发酵液；
(6)离心：将步骤(5)中发酵培养所得发酵液离心，得蝉花菌丝体。
(7)干燥粉碎：将步骤(6)所述得到的蝉花菌丝体干燥，将干燥蝉花菌丝体进行初步粉碎；
(8)干燥超微粉碎：将初步粉碎的蝉花菌丝体粗粉进一步干燥，进行超微粉碎，过筛，得蝉花菌丝体微粉；
(9)包装辐照灭菌：将蝉花菌丝体微粉进行包装，包装产品进行辐照，得蝉花菌丝体冲剂成品。
7.根据权利要求6所述生产高产抗氧化蝉花菌丝体冲剂的方法，其特征在于，步骤(2)所述种子培养液：优选包含以下质量分数原料：蔗糖2％，可溶性淀粉3％，豆粉2％，KH2PO40.1％，MgSO4·7H2O 0.05％，溶剂为水，pH自然，每瓶装液量为40％，每瓶可加3-5颗玻璃珠。
8.根据权利要求6所述生产高产抗氧化蝉花菌丝体冲剂的方法，其特征在于，步骤(2)所述种子培养液中每瓶接种3-8块黄豆粒大小活化菌种，于25℃，180r/min振荡培养2-3d，得一级种。
9.根据权利要求6所述生产高产抗氧化蝉花菌丝体冲剂的方法，其特征在于，步骤(2)所述一级种按体积分数10-15％接种到同样种子培养液中，步骤(4)所述二级种按体积分数10-15％接种发酵培养基。
10.根据权利要求6所述生产高产抗氧化蝉花菌丝体冲剂的方法，其特征在于，步骤(8)所述超微粉碎过筛后，制成500目以上的微粉。
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