CN106190865A - 一种提高蝉花真菌生物量和活性成分含量的液体发酵培养基配方 - Google Patents

一种提高蝉花真菌生物量和活性成分含量的液体发酵培养基配方 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种提高蝉花真菌生物量和活性成分含量的液体发酵培养基配方，以水为溶剂，培养基组成为：蔗糖30～40g/L、蛋白胨15～25g/L、KH2PO40.5～1.5g/L和MgSO4·7H2O0.5～1g/L。本发明对发酵培养基进行设计优化，获得了最佳的碳源、氮源和无机盐，及相应的浓度，可以大幅提高蝉花真菌的生物量和活性成分‑虫草酸的含量。

Description

一种提高蝉花真菌生物量和活性成分含量的液体发酵培养基 配方
技术领域
本发明涉及微生物发酵，尤其涉及一种提高蝉花真菌生物量和活性成分含量的液体发酵培养基配方。
背景技术
蝉花又名蝉虫草、蝉茸、胡蝉等。《本草纲目》记载：蝉花出蜀中,其蝉上有一角,如花冠状。蝉花产于江苏、浙江、福建、四川、云南等地,性寒,味甘,无毒。民间用于治疗视物不明、小儿惊风夜啼等症。蝉花含丰富的蛋白质、氨基酸、真菌多糖及生理活性物质,有抑制肿瘤、镇痛退热、镇静明目等多种功能,且有降低血压、减慢心率、抗疲劳、抗应激及提高免疫力。
据《证类本草》载：“蝉花，所在皆有，七月采，生苦竹林者良,花出土上。”蝉花一般生长在针阔混交林带,山峦平缓起伏，生态环境优良，分布满山遍野的毛竹林，阴蔽较好的林地都有金蝉花，尤其在向阳坡地的竹林下，落叶和腐殖层很厚，透气、透水、保温，密布粗壮、浓白的菌丝体。
目前蝉花的使用中存在着资源有限，人工采集困难，功能活性组分不明，作用机制不清楚，甚至原料不纯等问题，这就成为蝉花这种传统中药走向世界的一个很大障碍,又由于蝉花是真菌寄生于竹蝉若虫体内形成的复合体,生长特定的环境和寄主，故资源稀少，再加上长期采挖资源日趋枯竭，已成为一种稀世良药。因此，如何通过人工培养提高蝉花真菌的生物量以及相关活性成分是亟待解决的问题。
发明内容
发明目的：针对现有技术中存在的问题，本发明提供了一种提高蝉花真菌生物量和活性成分含量的液体发酵培养基配方。
技术方案：一种提高蝉花真菌生物量和活性成分含量的液体发酵培养基配方，水为溶剂，培养基组成包括：蔗糖30～40g/L、蛋白胨15～25g/L、KH2PO40.5～1.5g/L和MgSO4·7H2O0.5～1g/L。
优选的，所述蔗糖的浓度为38～40g/L；更优选的，所述蔗糖的浓度为40g/L。
优选的，所述蛋白胨的浓度为15～18g/L；所述蛋白胨的浓度为15g/L。
优选的，所述KH2PO4的浓度为1.2～1.5g/L；更优选的，所述KH2PO4的浓度为1.5g/L。
优选的，所述MgSO4·7H2O的浓度为0.3～0.5g/L；更优选的，所述MgSO4·7H2O的浓度为0.5g/L。
本发明中，所述的蝉花真菌为蝉拟青霉(Paecilomyces cicadae)。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明对发酵培养基进行设计优化，获得了最佳的碳源、氮源和无机盐，及相应的浓度，可以大幅提高蝉花真菌的生物量和活性成分-虫草酸的含量。
本发明发酵培养基的配方简单，价格低廉。
附图说明
图1为甘露醇标准曲线图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐明本发明。
实施例1
母种培养基：土豆20％，葡萄糖2％，蛋白胨0.15％，KH2PO4 0.1％，MgSO4·7H2O0.05％，琼脂粉1.5～2％。pH自然，121℃灭菌30min。
液体菌种培养基：土豆20％，蔗糖5％，豆粉0.5％，KH2PO4 0.5％，MgSO4·7H2O0.05％。pH自然，121℃灭菌30min。
上述培养基中的成分百分比为质量百分数。本发明涉及的培养基配方中均以水为溶剂。
1、菌种活化
将保藏的金蝉花菌种-蝉拟青霉无菌操作接至试管斜面培养基(母种培养基)上，25℃下培养5～7d左右，此时菌丝长满斜面，即可使用。
2、种子液制备
从斜面上取大小相近的0.5cm×0.5cm的母种块，接种于液体菌种培养基中(菌块要薄，稍带培养基，尽量使菌块漂浮在液面上)，每瓶接种3块。装液量为40％，培养温度25℃，转速180r/min，一级种培养3d。二级种在与一级种同样条件下培养2d。
3、发酵培养
将制备的种子液接种于发酵培养基中进行培养，装液量为40％，接种量(v/v)为10％，培养温度为25℃，转速为180r/min。每个试验3次重复。用250mL的三角瓶，每瓶分装100mL。发酵结束后检测生物量和虫草酸含量。
生物量检测方法：
采用细胞干重法，取液体培养后发酵液，用100目尼龙纱网过滤得菌丝体和胞外液，并用蒸馏水反复冲洗，至滤出液澄清为止，收集菌丝体，60℃烘干至恒重，称重得干的菌丝体。
虫草酸含量测定方法：
取样品液(样品液为发酵液5000r/min离心所得上清液)1mL，用高碘酸钠比色法在420nm处测吸光度，制作甘露醇标准曲线(图1)并计算出虫草酸含量样品中虫草酸含量(mg/g)＝C×50/m，式中，C为提取液中虫草酸含量(mg/ml)，50是样品提取液体积(ml)，m为称取样品的质量(g)
发酵培养基的优化：
(1)碳源筛选
质量分数计，以豆粉2％，KH2PO4 0.1％，MgSO4·7H2O 0.05％为基础培养基，分别将葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、乳糖、甘露醇5种碳源以质量分数3％的量加入制成发酵培养基，pH自然，于25℃、180r/min恒温水浴摇床培养5d，分别对比这5种碳源对生物量及虫草酸含量的影响。其中，豆粉煮沸水解20min，经过滤取滤液加入。
结果参见表1。
表1不同碳源对蝉花液体发酵生物量及虫草酸含量的影响
由表1可知，在5种碳源中，葡萄糖、麦芽糖、甘露醇、蔗糖和乳糖都能得到较高的生物量，而虫草酸含量最高的是甘露醇，由于标准品的主要成分是甘露醇，所以适合的碳源是蔗糖，虫草酸的含量是28.148mg/g。
(2)氮源筛选
质量分数计，以蔗糖2％，可溶性淀粉1％，KH2PO4 0.1％，MgSO4·7H2O 0.05％为基础培养基，分别将蛋白胨、酵母膏、麸皮、酪蛋白、豆粉5种氮源以质量分数2％的量加入制成发酵培养基，PH自然，于25℃、180r/min恒温水浴摇床培养5d，分别对比这5种碳源对生物量及虫草酸含量的影响。其中，麸皮经煮沸水解10min，经过滤取滤液加入。
结果参见表2。
表2不同氮源对蝉花液体发酵生物量及虫草酸含量的影响
由表2可以看出，不同的氮源对虫草酸含量及生物量的影响较大。在5种氮源中，蛋白胨和豆粉对蝉花液体发酵虫草酸含量的影响比显著，但是豆粉在碳源筛选中作为基础培养基中的氮源，对于氮源筛选有一定干扰，所以合适的氮源是蛋白胨，其生物量为1.361g/ml，虫草酸含量为32.284mg/g。
(3)无机盐筛选
质量分数计，以蛋白胨2％，蔗糖2％为基础培养基，分别将KH2PO4、K2HPO4、MgSO4·7H2O、KCl、CaCl2这5种无机盐以质量分数0.05％的量加入，PH自然，于25℃、180r/min恒温水浴摇床培养5d，分别对比这5种碳源对生物量及虫草酸含量的影响。
结果参见表3。
表3不同的无机盐对蝉花液体发酵生物量及虫草酸含量的影响
由表3可以看出，5种无机盐对生物量的影响不是很大，但根据虫草酸的含量可以看出MgSO4·7H2O和KH2PO4、K2HPO4能同时获得高产量的虫草酸。值得注意的是，CaCl2的添加反而抑制了虫草酸的产生。基于K、P、S和Mg作为微生物生长所需的营养元素和虫草素产量考虑，同时选用MgSO4·7H2O、KH2PO4作为培养基中的无机盐组分，保证微生物能更好的生长。
(4)正交试验优化研究
在温度25℃、初始pH值为自然、接种菌龄4d(接种菌龄是指种子液培养时间)、接种量(v/v)10％、摇床转速180r/min、发酵时间5d的条件下，在发酵培养基优化得到的最佳碳源、氮源、无机盐单因素实验结果基础上，进行四因素四水平(L16(44))正交试验设计进行考察，具体设计见表4。发酵结果经极差和方差分析，找出各种发酵培养基成分的最佳浓度和它们对蝉花生物量和虫草酸含量的影响程度。
表4L16(44)正交试验设计
结果参见表5。
表5蝉花液体发酵产生物量和虫草酸含量的正交实验结果
从表5直观分析可以看出，发酵培养基的成分对蝉花液体发酵产生生物量的影响顺序为：蔗糖>蛋白胨>KH2PO4>MgSO4·7H2O，最优水平为A3B4C1D1，即蔗糖30g/L、蛋白胨25g/L、KH2PO40.5g/L、MgSO4·7H2O0.5g/L。
发酵培养基成分对禅花液体发酵产生虫草酸含量的影响顺序为：蔗糖>蛋白胨>KH2PO4>MgSO4·7H2O，最优水平为A4B2C3D1，即蔗糖40g/L、蛋白胨15g/L、KH2PO41.5g/L、MgSO4·7H2O0.5g/L。在上述优化条件下，蝉花生物量和蝉花虫草酸含量都要比正交试验最高组(第10组)高，优化后生物量提高了22.85％；虫草酸含量提高了30.77％。由以上分析可知，蝉花生物量和虫草酸含量呈正相关，生物量的大量产生是虫草酸积累的基础。
(5)验证实验
将正交试验所获得的最佳培养工艺条件进一步验证，并设置对照，比较优化的发酵培养基与基础培养基同条件下其生物量及虫草酸含量的差异。
基础培养基即为液体菌种培养基。
优化后发酵培养基的配方为：蔗糖40g/L、蛋白胨15g/L、KH2PO41.5g/L、MgSO4·7H2O0.5g/L。
培养条件：温度25℃、初始pH值为自然、接种菌龄4d、接种量(v/v)10％、摇床转速180r/min、发酵时间5d。
表6基础培养基和优化后的发酵培养基验证结果比较
从表6可知，在验证实验中，工艺优化后蝉花生物量和虫草酸含量都比未优化的高得多，优化后生物量提高了62.59％，虫草酸含量提高了66.96％。说明优化后各种适宜浓度的营养因子能更好的促进生物量和虫草酸的生产。
在真菌发酵过程中，生物量的大量产生是次生代谢积累的基础，当需要的发酵产物是次生代谢产物时，发酵培养基的设计显得特别重要。本发明研究发现，蝉花菌株的生长和虫草酸的产生的最佳碳源是蔗糖，成本也低，适合工业生产。
氮是有机体的重要组成元素，真菌能利用的氮包括铵态氮、硝态氮和有机氮，但是有机氮源比无机氮源能获得更高的生物量和代谢产物。本实验在对蝉花液体深层培养的研究中，发现无机氮源获得较低的生物量和虫草素含量，而优化后的以15g/L的蛋白胨添加量作为氮源获得总的虫草酸含量达到44.317mg/g，说明适量的蛋白胨可促进虫草素的产生。
无机盐在蝉花的生长和虫草酸的产生中扮演着重要的角色。本实验的研究证明发现了所有添加的无机盐均能提高虫草酸的产量，只是Ca2+在添加以后虫草酸的增加的量和其他无机盐相比要少，即影响虫草酸的积累。

Claims (10)

1.一种提高蝉花真菌生物量和活性成分含量的液体发酵培养基配方，其特征在于，水为溶剂，培养基组成包括：蔗糖30～40g/L、蛋白胨15～25g/L、KH2PO40.5～1.5g/L和MgSO4·7H2O0.5～1g/L。
2.根据权利要求1所述的液体发酵培养基配方，其特征在于，所述蔗糖的浓度为38～40g/L。
3.根据权利要求2所述的液体发酵培养基配方，其特征在于，所述蔗糖的浓度为40g/L。
4.根据权利要求1所述的液体发酵培养基配方，其特征在于，所述蛋白胨的浓度为15～18g/L。
5.根据权利要求4所述的液体发酵培养基配方，其特征在于，所述蛋白胨的浓度为15g/L。
6.根据权利要求1所述的液体发酵培养基配方，其特征在于，所述KH2PO4的浓度为1.2～1.5g/L。
7.根据权利要求6所述的液体发酵培养基配方，其特征在于，所述KH2PO4的浓度为1.5g/L。
8.根据权利要求1所述的液体发酵培养基配方，其特征在于，所述MgSO4·7H2O的浓度为0.3～0.5g/L。
9.根据权利要求8所述的液体发酵培养基配方，其特征在于，所述MgSO4·7H2O的浓度为0.5g/L。
10.根据权利要求1所述的液体发酵培养基配方，其特征在于，所述的蝉花真菌为蝉拟青霉(Paecilomyces cicadae)。
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