CN108823106A - 一种蝉花液体发酵工艺 - Google Patents

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谢春芹
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宋刚
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Abstract

本发明公开一种蝉花液体发酵工艺，将蝉花菌种接种于PDA平板培养基中，在28℃下培养2~3d；用接种钩从平板上挑取母种块，接种于250ml的三角瓶中，装液量为100ml的种子培养基中，培养温度为28℃，转速为180r/min的恒温摇床中培养72h得到菌悬液；取5ml菌悬液，接入250ml的三角瓶中进行发酵，将pH值调为6.5~7.4，恒温摇床的温度设为22℃~34℃，摇床转速为110~190r/min，培养时间为5d得到发酵液，测其生物量和虫草酸含量。本发明获得的真菌多糖含量为107.45mg/g，虫草酸含量为95.82mg/g，真菌多糖和虫草酸含量皆高于天然蝉花的含量。

Description

一种蝉花液体发酵工艺
技术领域
本发明涉及植物育种领域，具体涉及一种蝉花液体发酵工艺。
背景技术
蝉花(Cordyceps.cicadae)又称大虫草，目前市面上99％的都是无性型蝉拟青霉(Paecilomyces cicadae)。蝉花属于虫生真菌，与冬虫夏草有非常接近的亲缘关系，都属于菌物界、真菌门、子囊菌纲、麦角菌目、麦角菌科，在我国，蝉花集中分布的省份为四川、江苏、浙江、福建。
根据国内外多项研究成果表明，蝉花具有多种保健作用，包括提高人体自身免疫力、抗疲劳、养肾、养肝、改善睡眠、抗肿瘤、抗辐射和明目等，是一味具有神奇效果的古老中草药。李时珍在《本草纲目》中记载的药效为：“蝉花可治疗惊痫，夜啼心悸，功同蝉蜕”。而且蝉花的天然成分与冬虫夏草类似，具有相同的药用价值，然而像有毒重金属如碘、汞、铅尚等却尚未检测出，在安全性方面蝉花显然优于冬虫夏草，而且蝉花的价格相对于冬虫夏草，则更为亲民，因此蝉花常作为冬虫夏草的替代品。
蝉花的生长条件要求比较严格，需要特定的生态环境和寄主昆虫(金蝉)，这是蝉花资源稀少的主要原因。然而最近几年里随着生态环境的破坏，使得蝉花的生长区域大范围缩小；而且人们开始认识到蝉花的价值，使蝉花遭到了疯狂的采摘，导致蝉花资源迅速减少。本试验的目的是利用蝉拟青霉，在经优化的液态培养条件下生产菌丝体，并对菌丝体的活性物质进行提取及测定分析，以达到通过利用菌丝体发酵来获得天然蝉花含有的药用活性物质，为大规模工业生产提供参考。
发明内容
发明目的：为了克服现有技术的不足，本发明所要解决的技术问题是提供了一种蝉花液体发酵工艺。
技术方案：为了解决上述技术问题，本发明提供了一种蝉花液体发酵工艺，包括以下步骤：
1)菌种活化：将蝉花菌种通过无菌操作接种于PDA平板培养基中，在28℃下培养2～3d；
2)孢子悬浮液的制备：在无菌条件下，用接种钩从平板上挑取0.3cm*0.3cm的母种块，接种于250ml的三角瓶中，装液量为100ml的种子培养基中，培养温度为28℃，转速为180r/min的恒温摇床中培养72h得到菌悬液；
3)液体发酵：取5ml菌悬液，接入250ml的三角瓶中，装液量为三角瓶的20～80％的发酵培养基中进行发酵，将pH值调为6.5～7.4，恒温摇床的温度设为22℃～34℃，摇床转速为110～190r/min，培养时间为5d得到发酵液，测其生物量和虫草酸含量。
其中，所述PDA平板培养基包括：马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂20g，加水至1L，pH自然，121℃灭菌30min备用。
其中，所述种子培养基包括：土豆200g，蔗糖50g，豆粕5g，KH2PO45g，MgSO4·7H2O0.5g，加水至1L，pH自然，121℃灭菌30min备用。
其中，所述发酵培养基包括：蔗糖40g，蛋白胨15g，KH2PO41.5g，MgSO4·7H2O0.5g，补水至1L，在121℃灭菌30min备用。
作为优选，所述步骤3)中的装液量为三角瓶的40％。
作为优选，所述步骤3)中的pH值为7.1。
作为优选，所述步骤3)中的恒温摇床的温度为28℃。
作为优选，所述步骤3)中的摇床转速为150r/min
有益效果：相对于现有技术，本发明具有以下优点：本发明首次将蝉拟青霉(Paecilomyces cicadae)通过液态发酵，进行单因素和正交试验，以实现蝉花真菌液态发酵条件包括pH、温度、摇床转速、培养基装液量的优化，得到蝉花液体发酵的最优条件为pH＝7.1、摇床转速150r/min、温度28℃、装液量为40％；在最佳条件下，获得的真菌多糖含量为107.45mg/g，虫草酸含量为95.82mg/g，真菌多糖和虫草酸含量皆高于天然蝉花的含量。
附图说明
图1发酵温度的优化；
图2pH对蝉花发酵的影响；
图3摇床转速对蝉花发酵的影响；
图4装液量对蝉花发酵的影响；
图5虫草酸(D-甘露醇)含量标准曲线(波长421nm)；
图6葡萄糖含量标准曲线(波长490nm)。
具体实施方式：
下面通过实施例来进一步阐述本发明。
1、材料与方法
蝉花菌种来源：蝉花(Cordyceps.cicadae)菌株来自江苏食用菌研究所；
试剂与仪器：
试剂：
甘露醇标准品、乙酸铵、冰醋酸、乙酰丙酮、高碘酸钠、L—鼠李糖、葡萄糖、蔗糖、蛋白胨、酵母膏、琼脂、孟加拉红染色剂、氯霉素、K2HPO4、KH2PO4、MgSO4·7H2O、高碘酸钾、苯酚、浓硫酸、无水乙醇。
仪器：
水浴恒温振荡器；电子天平；千分之一精密电子天平；立式压力蒸汽灭菌器；数显恒温水浴锅；可见分光光度计；冷冻真空干燥机。
培养基：
菌种保藏培养基：PDA培养基：马铃薯200g、葡萄糖2og、琼脂20g、加水至1L，pH自然。121℃灭菌30min备用。
种子培养基：土豆200g，蔗糖50g，豆粕5g，KH2PO45g，MgSO4·7H2O 0.5g，加水至1L，pH自然，121℃灭菌30min备用。
发酵培养基：蔗糖40g，蛋白胨15g，KH2PO41.5g，MgSO4·7H2O 0.5g，补水至1L，在121℃灭菌30min备用。
实施例1一种蝉花液体发酵工艺
1、发酵种子的制备
菌种活化：将实验分离所得到的在低温保存的蝉花菌种通过无菌操作接种于PDA平板培养基中，在28℃下培养2～3d，当菌丝长满整个平皿，即可使用。
孢子悬浮液的制备：在无菌条件下，用接种钩从平皿上取大小相近约0.3cm*0.3cm的母种块，接种于250ml的三角瓶中，装液量为100ml的种子培养基中(菌块稍带培养基且要薄，以能浮在培养液表面为最佳)温度为28℃，转速为180r/min的恒温摇床中培养72h；
2、液体发酵条件的确定
1)发酵温度的优化：取5ml的菌悬液，接入250ml的三角瓶中，装液量为40％，恒温摇床的温度分别设为22℃、25℃、28℃、31℃、34℃，摇床转速为150r/min，培养时间为5d。测其生物量。
对于微生物液态发酵培养来说，温度的影响是双方面的：随着温度升高，可以加速微生物的生长代谢，但是温度过高不仅会导致微生物体内的酶失活还容易使菌体老化，从而影响微生物的正常生长以及代谢产物的积累；温度过低则菌体生长缓慢因而积累的代谢产物较少。蝉花真菌在不同温度下进行液态发酵培养的结果如图1所示。蝉花真菌菌株在22～34℃的条件下均能生长，在28℃所获得的生物量最大，为5.63g/L。
2)发酵pH的优化：取5ml的菌悬液，接入250ml的三角瓶中，装液量为三角瓶的40％的发酵培养基中进行发酵，将pH值分别调为6.5、6.8、7.1、7.4，置于温度为28℃的摇床以转速为150r/min的速率进行培养，培养时间为5d。测其生物量。
在正常条件下，pH值过低菌体容易衰老，而pH过高则会导致菌体自溶。本实验通过设置不同的pH来考察蝉花液体发酵培养的最佳pH。如图2所示，蝉花真菌在pH6.5～7.7均能生长，生物量的变化则是随着pH的上升出现了先增加后减少的现象，在pH为7.1时，达到最大值，为5.29g/L。
3)发酵摇床转速的优化：取5ml的菌悬液，接入250ml的三角瓶中，装液量为三角瓶的40％的发酵培养基中进行发酵，将摇床的转速分别设为110、130、150、170、190r/min，在28℃的条件下恒温培养5d。测其生物量。
蝉花真菌属于好氧微生物，菌丝的生长需要消耗氧气，提高摇床的转速，不仅可以增大液体接触空气的面积，还对蝉花真菌的生长有促进作用；转速太小影响通气量从而影响溶氧,不利于菌丝生长；摇床转速超过最佳转速时，由于剪切力增加，菌丝被切断导致菌丝体难以成行，因此难以维持正常的生长，导致获得的生物量减少。如图3所示，在摇床转速为150r/min时生物量达到最大，为4.68g/L。
4)发酵装液量的优化：取5ml的菌悬液，接入250ml的三角瓶中，装液量分别为三角瓶的20％，40％，60％，80％的发酵培养基，置于28℃的恒温摇床以转速为150r/min的速度培养5d，测其生物量。
不同装液量对生物量的影响结果如图4所示，装液量主要影响发酵过程中的通气情况从而影响菌丝体的生长，装液量过小导致培养基水分蒸发较快及代谢物浓度较大,溶氧下降；装液量过会使振荡效果减弱，溶氧降低。蝉花真菌液态发酵最佳装液量为40％，此时生物量为5.37g/L。
5)正交试验的确定
选择温度、摇床转速、pH和装液量为试验因素，进行4个因素3个水平【L9(34)】正交试验设计进行分析，发酵结果经极差和方差分析，找出各种培养条件对蝉花液态发酵所获得的生物量和虫草酸含量的影响程度。选择温度、pH、摇床转速、装液量为试验因素，因素水平表如表1。
表1正交试验因子水平表L9(34)
正交实验结果的极差分析如表2。
表2正交试验结果的极差分析
正交试验优化结果见表2，由表2中R值可知，影响蝉花真菌液态发酵生物量的各因素主次为A>C>D>B，即温度对蝉花真菌液态发酵过程中生物量的影响最大，摇床转速次之，装液量再次之，pH对生物量的影响最小。根据直表2直观分析最佳发酵条件为A2B1C2D3，发酵液中的生物量为6.13g/L。蝉花真菌液体发酵培养的最佳条件为28℃，摇床转速150r/min，pH为7.1，装液量为40％。
6)关于生物量的测定方法
采用细胞干重法。发酵液培养完成后，用100目筛过滤得到菌丝体和胞外液，用蒸馏水反复冲洗菌丝体直至所出滤液澄清为止，将所收集的菌丝体置于玻璃纸上，放入烘箱以温度60℃烘干至恒重，称量所得量即为生物量。
7)虫草酸含量测定
通过微波提取法提取菌丝体中的虫草酸。利用高碘酸钠比色法测定虫草酸含量。在412nm处测吸光度，将测得的OD值通过回归方程进行计算，然后通过下式计算菌丝体中虫草酸的含量。
式中：
R菌丝体中虫草酸含量，mg/g；
C提取液中虫草酸含量，μg/g；
10试样浸提后定容体积，ml；
V提取液体积，ml；
m试样的准确重量，g。
8)真菌多糖含量的测定
将干燥后的菌丝体进行前处理。步骤：热水提取、乙醇沉淀、脱色、去蛋白、低温干燥。采用硫酸-苯酚法测真菌多糖含量。在波长490nm处测OD值，将其OD值代入回归方程中进行计算，然后代入下式计算真菌多糖的含量。
R菌丝体中真菌多糖含量，mg/g；
C提取液中真菌多糖含量，μg/g；
V提取液体积，ml；
ω干菌丝体质量，g。
实验例蝉花菌丝体中的活性成分测定
1、虫草酸含量标准曲线的制备
根据高碘酸钠比色法，作虫草酸(D-甘露醇)含量的标准曲线。(图5)虫草酸含量的回归方程：y＝0.04x+0.0032。
2、蝉花真菌多糖含量标准曲线的制备
根据硫酸-苯酚法，作真菌多糖标准曲线(图6)。真菌多糖含量的回归方程：y＝0.0675x-0.014。
3、蝉花菌丝体中虫草酸的提取与测定
取0.050g实施例1的干燥液体发酵菌丝体加入10ml水中在微波炉通过中火加热2min进行微波处理。处理完毕后在3000r/min离心25min取上清液加入到50ml容量瓶进行定容。用高碘酸钠比色法测定样液的OD值。方法：取甘露醇50mg加入到50ml蒸馏水中配置成1mg/ml甘露醇溶液，分别取1ml、2ml、3ml、4ml、5ml甘露醇溶液于100ml容量瓶中进行定容，得到10、20、30、40、50μg/ml样液，取样液各1ml，加1ml高锰酸钾溶液(加0.15mol高锰酸钾于100ml的0.12mol/l盐酸溶液中混匀)。室温放置10min，加入2ml0.1％L-鼠李糖溶液除去过多的高碘酸盐。混合后加4ml新配NaSH试剂(150g醋酸铵，2ml冰醋酸，2ml乙酰丙酮，用蒸馏水稀释至1000ml)，53℃水浴加热15min使其呈色，冷却，用蒸馏水代替甘露醇标准液。在波长412nm处测OD值。此时样品的OD值为0.572，虫草酸含量为95.82mg/g。
4、蝉花菌丝体中真菌多糖的提取与测定
取实施例1的干燥液体发酵菌丝2g研磨成粉末，用水提醇法提取，即加10倍量的蒸馏水水，100℃水浴煎煮1h，重复3次，提取液过滤，浓缩至1:1(g/ml)加3倍量的乙醇使其沉淀，5000r/min离心5min，取出上清液，继续加乙醇放置，倾出上清液，沉淀依次用乙醇、无水乙醇洗涤、过滤、低温干燥24h，即得多糖粗品，将提取的多糖粗品，置于10ml容量瓶中，加双蒸水溶解，并稀释到刻度，摇匀，备用。标准曲线的制作：吸取葡萄糖标准液(100μg/ml)0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.6、0.8、1ml，分别加入到各试管中，用双蒸水补足至每管2ml，使各管葡萄糖含量分别为0、10、20、30、40、60、80、100μg。各管加0.05ml80％苯酚溶液，再加入浓硫酸5ml(勿沿管壁加入，以便使样品与硫酸快速混匀)，静置10min，30℃水浴15min。在490nm波长处测各管的OD值，以糖浓度为横坐标，各管的OD值为纵坐标作标准曲线，作回归方程曲线，通过公式计算真菌多糖含量。此时样品的OD值是0.497，真菌多糖含量为107.45mg/g。
现有研究中，文欣等人通过改良液体发酵条件，得到的生物量为5.72g/L，真菌多糖含量为86.71mg/g，虫草酸含量为90.13mg/g。张宝珍通过改良液体发酵培养基的配方，得到的生物量为5.63g/L，得到的真菌多糖含量为88.73mg/g，得到的虫草酸含量为82.58mg/g。本发明在使用改良的液体发酵培养基的基础上，优化了发酵工艺，所获得的生物量为6.19g/L，所获得真菌多糖含量为107.45mg/g，虫草酸含量为95.82mg/g。三项指标皆明显提高，在发酵中所获得的蝉花菌丝体的活性物质与天然蝉花中活性物质相同，但蝉花菌丝体中的天然有益物质真菌多糖和虫草酸这两种活性物质皆含量高于天然蝉花，天然蝉花真菌多糖含量为33.2mg/g,虫草酸含量为53.6mg/g。因此用蝉花液体发酵菌丝体用于保健用品开发，以替代天然蝉花的使用不无可能，此方法不仅可以降低生产成本，也减少对天然蝉花资源的破坏。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (8)

1.一种蝉花液体发酵工艺，其特征在于，包括以下步骤：
1）菌种活化：将蝉花菌种通过无菌操作接种于PDA平板培养基中，在28℃下培养2~3d；
2）孢子悬浮液的制备：在无菌条件下，用接种钩从平板上挑取0.3cm*0.3cm的母种块，接种于250ml的三角瓶中，装液量为100ml的种子培养基中，培养温度为28℃，转速为180r/min的恒温摇床中培养72h得到菌悬液；
3）液体发酵：取5ml菌悬液，接入250ml的三角瓶中，装液量为三角瓶的20~80%的发酵培养基中进行发酵，将pH值调为6.5~7.4，恒温摇床的温度设为22℃~34℃，摇床转速为110~190r/min，培养时间为5d得到发酵液，测其生物量和虫草酸含量。
2.根据权利要求1所述的蝉花液体发酵工艺，其特征在于，所述PDA平板培养基包括：马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂20g，加水至1L，pH自然，121℃灭菌30min备用。
3.根据权利要求1所述的蝉花液体发酵工艺，其特征在于，所述种子培养基包括：土豆200g，蔗糖50g，豆粕5g，KH2PO45g，MgSO4·7H2O 0.5g，加水至1L，pH自然，121℃灭菌30min备用。
4.根据权利要求1所述的蝉花液体发酵工艺，其特征在于，所述发酵培养基包括：蔗糖40g，蛋白胨15g，KH2PO41.5g，MgSO4·7H2O 0.5g，补水至1L，在121℃灭菌30min备用。
5.根据权利要求1所述的蝉花液体发酵工艺，其特征在于，所述步骤3）中的装液量为三角瓶的40%。
6.根据权利要求1所述的蝉花液体发酵工艺，其特征在于，所述步骤3）中的pH值为7.1。
7.根据权利要求1所述的蝉花液体发酵工艺，其特征在于，所述步骤3）中的恒温摇床的温度为28℃。
8.根据权利要求1所述的蝉花液体发酵工艺，其特征在于，所述步骤3）中的摇床转速为150r/min。
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