CN105602857A - 一种野生蝉花液体菌种人工培养的优化方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种野生蝉花液体菌种人工培养的优化方法，采用优化的液体培养基配方：可溶性淀粉20g，奶粉10g,磷酸二氢钾0.5g,硫酸镁1g,维生素B12？10片，水1000mL，pH？5.0-6.0；对野生蝉花菌种进行人工培养，在传统基础培养基的基础上，提出了一种系统有效的对野生蝉花液体菌种生产中最优碳源、氮源及微量营养素的筛选的优化培养方式，为野生蝉花的规模化栽培提供优良菌种技术指导。

Description

一种野生蝉花液体菌种人工培养的优化方法

技术领域

本发明涉及生物菌剂领域，尤其涉及一种野生蝉花液体菌种人工培养的优化方法。

背景技术

蝉花又名金蝉花、蝉茸、蝉蛹草、虫花等，为麦角菌科真菌大蝉草寄生在蝉科昆虫若虫上的子座及若虫尸体的复合体。蝉花的主要成分有虫草素、虫草酸、虫草多糖、氨基酸、多种维生素、麦角甾醇、蛋白质以及超氧化物歧化酶等,蝉花与冬虫夏草的无性型同属，它的所含成分和药用价值能够与冬虫夏草媲美。具有镇痛、镇静催眠、抗高血压、双向免疫调节、抗肿瘤生成及抗炎、改善肾功能等作用。

自然界中的蝉花资源非常稀少，又由于大量的采挖造成其生长环境的严重破坏，使得野生蝉花成为稀世良药，市场上供应蝉花主要是蝉拟青霉，蝉花是绿色健康食品具有广阔的市场，目前中国在蛹虫草规模化生产的菌株品种较少，生产成本大，品质不高、生长缓慢、退化严重、抗逆性差，远远不能满足规模化生产的需要。

目前人工栽培方式主要有三种，一种是从野生蝉花分离，纯化菌种后接种在含蝉蛹粉的固体培养上，以大米代料培养为主，二是将蝉花菌种接种在柞蚕，家蚕幼虫或活蛹等体内后按第一种的方法条件培养，三是以玉米，蔗糖为培养基采用液体发酵培养蝉花。但不管采取哪一种栽培方式均需要获得大量优质的液体菌种，现有的培养基配方以及培养方式并没有使得在野生蝉花液体培养过程中野生蝉花菌丝得到最优的生长，对菌液的质量和产量都产生了一定的影响。

目前尚无一套系统有效的对野生蝉花液体菌种生产中最优碳源、氮源及微量营养素的筛选的优化培养方式，从而为野生蝉花的规模化栽培提供优良菌种技术指导。

发明内容

发明目的：为了克服现有技术中存在的野生蝉花液体菌种培养过程中存在的问题，本发明提出了一种系统有效的对野生蝉花液体菌种生产中最优碳源、氮源及微量营养素的筛选的优化培养方式，为野生蝉花的规模化栽培提供优良菌种技术指导的一种野生蝉花液体菌种人工培养的优化方法。

技术方案：为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案为：一种野生蝉花液体菌种人工培养的优化方法，包括如下步骤：

(1)优化液体培养基的配方：可溶性淀粉20g，奶粉10g,磷酸二氢钾0.5g,硫酸镁1g,维生素B1210片，水1000mL，pH5.0-6.0；

(2)优化液体培养基的配制：按照步骤(1)中的配方准确称量各药品，以配制1000mL培养基为例，量取1000mL的水用电磁炉烧开，然后按照易溶到不易溶的顺序依次将药品加入水中，用玻璃棒搅拌直至溶解；将配制好的培养基分装到500ml的三角瓶中，每个三角瓶装150ml,分装时避免培养基粘在三角瓶口壁上，如粘上则用纱布擦干净否则易滋生杂菌；用封口膜封口，并贴上标签；放在高压灭菌锅内灭菌，在压力为0.1-0.2MPa，温度为121℃下，灭菌40min,待其压力降至零时，打开压力锅盖取出三角瓶放置冷却备用；

(3)接种：将已灭过菌的三角瓶、接种工具、酒精棉球、酒精灯、接种环等放入超净工作台中，开启紫外线灯照射30min，用70％的酒精对菌种培养皿进行消毒，操作人员的手带无粉乳胶手套并用70％酒精消毒；点燃酒精灯，在酒精灯火焰无菌区范围内，将接种针和打孔器在酒精灯火焰上灼烧消毒，用打孔器在蝉花平板菌种表面进行打孔，打孔时沿菌落最外缘向中间逐次打，边缘的菌丝生长能力比较旺盛；用消毒过的接种针挑1个菌饼块，沿着三角瓶封口薄膜一侧揭开一条缝，通过酒精灯火焰的无菌区，将菌饼块掉入三角瓶内，每个三角瓶内接2块的菌饼块；放菌饼块的时候不要接触到瓶壁，避免污染；

(4)培养：接种后将三角瓶移至19℃的恒温振荡摇床中静止培养24h，后在恒温19℃，转速为120r/min的恒温振荡摇床继续培养6-7天。

更为优选的，所述步骤(2)中的分装采用漏斗进行分装，以避免培养基粘在三角瓶口壁上易滋生杂菌。

有益效果：本发明提供的一种野生蝉花液体菌种人工培养的优化方法，采用优化的液体培养基配方：可溶性淀粉20g，奶粉10g,磷酸二氢钾0.5g,硫酸镁1g,维生素B1210片，水1000mL，pH5.0-6.0；对野生蝉花菌种进行人工培养，在传统基础培养基的基础上，提出了一种系统有效的对野生蝉花液体菌种生产中最优碳源、氮源及微量营养素的筛选的优化培养方式，为野生蝉花的规模化栽培提供优良菌种技术指导。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的详细说明：

实施例1：

一种野生蝉花液体菌种人工培养的优化方法，包括如下步骤：

(1)优化液体培养基的配方：可溶性淀粉20g，奶粉10g,磷酸二氢钾0.5g,硫酸镁1g,维生素B1210片，水1000mL，pH5.0-6.0；

(2)优化液体培养基的配制：按照步骤(1)中的配方准确称量各药品，以配制1000mL培养基为例，量取1000mL的水用电磁炉烧开，然后按照易溶到不易溶的顺序依次将药品加入水中，用玻璃棒搅拌直至溶解；将配制好的培养基分装到500ml的三角瓶中，每个三角瓶装150ml，分装时采用漏斗进行分装，以避免培养基粘在三角瓶口壁上易滋生杂菌，如粘上则用纱布擦干净否则易滋生杂菌；用封口膜封口，并贴上标签；放在高压灭菌锅内灭菌，在压力为0.1-0.2MPa，温度为121℃下，灭菌40min,待其压力降至零时，打开压力锅盖取出三角瓶放置冷却备用；

(3)接种：将已灭过菌的三角瓶、接种工具、酒精棉球、酒精灯、接种环等放人超净工作台中，开启紫外线灯照射30min，用70％的酒精对菌种培养皿进行消毒，操作人员的手带无粉乳胶手套并用70％酒精消毒；点燃酒精灯，在酒精灯火焰无菌区范围内，将接种针和打孔器在酒精灯火焰上灼烧消毒，用打孔器在蝉花平板菌种表面进行打孔，打孔时沿菌落最外缘向中间逐次打，边缘的菌丝生长能力比较旺盛；用消毒过的接种针挑1个菌饼块，沿着三角瓶封口薄膜一侧揭开一条缝，通过酒精灯火焰的无菌区，将菌饼块掉入三角瓶内，每个三角瓶内接2块的菌饼块；放菌饼块的时候不要接触到瓶壁，避免污染；

(4)培养：接种后将三角瓶移至19℃的恒温振荡摇床中静止培养24h，后在恒温19℃，转速为120r/min的恒温振荡摇床继续培养6-7天。

培养菌种质量对比试验：

1)对比试验1：

碳元素是真菌最重要的营养，它不仅是碳水化合物还是蛋白质的基本组成元素，同时又是重要的能源来源。本发明优化培养基配方中碳元素的供给选择都是可溶性淀粉，将实施例1中培养基配方中的可溶性淀粉分别等量替换成传统培养方法中的葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、乳糖，其余成分不变和培养方法不变，用以下测定方法对培养基的pH值以及培养第三天的菌丝球直径、密度和重量分别进行测定：

a)菌丝球直径的测定

接种后48h开始测定，以后每隔24h测定一次。每次测量取液均需要在超净工作台内进行，取液时先用1mL移液枪枪头移取3次，共取出3mL培养液放入垫有吸水纸的培养皿中，按1mL培养液含菌球大小的数量比随机取十个菌丝球排成一行用游标卡尺测总长度，并计算出平均每个菌丝球的直径。

b)菌丝球密度的测定

测量时间及取液方法同上，取出3mL的培养液放入培养皿中，在培养皿中垫上彩色吸水纸便于观察计数数出3mL培养液中的菌丝球个数并求出1mL培养液中的菌丝球个数。

c)菌丝球重量的测定

测量时间及取液方法同上，取出3mL培养液放入垫有彩色吸水纸的培养皿中，用吸水纸把水分吸收掉用接种针随机的挑出不同大小10个的菌丝球放到电子天平上测出总质量，并求出每个菌丝球的重量。

d)培养基pH值得测定

在超净工作台内，以无菌操作的方式用灭过菌的玻璃棒蘸取培养液置于pH试纸上然后对照比色卡读出pH值并记录。

试验结果如表1所示：

表1不同碳源对野生蝉花液体菌丝生长的影响(取培养第3天的菌丝球)

从表1可以看出，以本发明采用的可溶性淀粉为碳源最好，并显著高于葡萄糖，麦芽糖等其他碳源，菌丝球培养第4d菌丝密度稠密，可溶性淀粉的直径最大，达到1.72mm，是葡萄糖为碳源培养基中菌丝球直径的2倍，不同碳源培养基中菌丝的生长量依次可溶性淀粉>乳糖>麦芽糖>葡萄糖>蔗糖。

2)对比试验2：

氮元素是真菌合成蛋白质、核酸的重要原料，对菌丝的生长发育非常重要。本发明优化培养基配方中氮元素采用的是奶粉，将实施例1中培养基配方中的奶粉分别等量替换成传统培养方法中的蛋白胨、酵母膏、尿素和氯化铵，其余成分不变和培养方法不变，用对比试验1中的测定方法对培养基的pH值以及培养第三天的菌丝球直径、密度和重量分别进行测定：

试验结果如表2所示：

表2不同氮源对蝉花菌丝生长状况的影响(取培养第3天的菌丝)

从表2可以看出以本发明采用的氮元素供给物质奶粉最好，奶粉，氯化铵和蛋白胨等有机氮为试验组菌丝球的密度稠密，菌丝球的直径大小一致性高，菌丝状况明显好于酵母膏和尿素为无机氮源的试验组。从生长量来看以奶粉为氮源的菌丝生长速度最快菌丝直径达到1.90mm，菌丝球重量21.30mg/个，菌丝球密度达到23.67个/ml，次之为蛋白胨和氯化铵。

3)对比试验3：

维生素作为微量生长因子对蝉花的生长有着明显的影响，本发明优化培养基配方中维生素的供给选择都是维生素B12，将实施例1中培养基配方中的维生素B12分别等量替换成传统培养方法中的维生素B1、维生素B2和维生素B6，其余成分不变和培养方法不变，用对比试验1中的测定方法对培养基的pH值以及培养第三天的菌丝球直径、密度和重量分别进行测定：

试验结果如表3所示：

表3不同微量生长因子对蝉花菌丝生长状况的影响(取培养第3天的菌丝)

野生蝉花菌丝体不能合成必要的维生素，适当的加入一些VB系列的生长因子可以促进菌丝的生长，从表3可以看出，本发明采用的维生素B12对蝉花菌丝生长的促进高于对比组传统培养方法采用的维生素B1等生长因子。

4)对比试验4：

将实施例1培养基的初始pH调节为1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0，其余成分不变和培养方法不变，用对比试验1中的测定方法对培养基的pH值以及培养第5天的菌丝球直径、密度和重量分别进行测定：

试验结果如表4所示：

表4不同初始PH值对蝉花菌丝生长状况的影响(取培养第5天的菌丝)

从表4可以看出，初始pH值在5.0-9.0的范围内对蝉花的生长没有太大的影响，生长速率高于其他pH值。在培养液pH值为5.0-6.0范围内时菌丝球的直径与密度要其他的pH值范围是要大一些，说明蝉花子实体的形成与生长多以弱酸性为宜，因此本发明将培养液的pH值控制在5.0-6.0之间有利于菌丝生长。

上述试验数据显示，本发明提供的一种野生蝉花液体菌种人工培养的优化方法，采用的优化的液体培养基配方对野生蝉花菌种进行人工培养，在传统基础培养基的基础上，提出了一种系统有效的对野生蝉花液体菌种生产中最优碳源、氮源及微量营养素的筛选的优化培养方式，为野生蝉花的规模化栽培提供优良菌种技术指导。较传统培养方式在菌丝的生长和菌种的质量上都有很大的提高。

应当指出，以上具体实施方式仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修改均落于本申请所附权利要求所限定的范围。

Claims (2)

1.一种野生蝉花液体菌种人工培养的优化方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)优化液体培养基的配方：可溶性淀粉20g，奶粉10g,磷酸二氢钾0.5g,硫酸镁1g,维生素B1210片，水1000mL，pH5.0-6.0；

(2)优化液体培养基的配制：按照步骤(1)中的配方准确称量各药品，以配制1000mL培养基为例，量取1000mL的水用电磁炉烧开，然后按照易溶到不易溶的顺序依次将药品加入水中，用玻璃棒搅拌直至溶解；将配制好的培养基分装到500ml的三角瓶中，每个三角瓶装150ml,分装时避免培养基粘在三角瓶口壁上，如粘上则用纱布擦干净否则易滋生杂菌；用封口膜封口，并贴上标签；放在高压灭菌锅内灭菌，在压力为0.1-0.2MPa，温度为121℃下，灭菌40min,待其压力降至零时，打开压力锅盖取出三角瓶放置冷却备用；

(3)接种：将已灭过菌的三角瓶、接种工具、酒精棉球、酒精灯、接种环等放人超净工作台中，开启紫外线灯照射30min，用70％的酒精对菌种培养皿进行消毒，操作人员的手带无粉乳胶手套并用70％酒精消毒；点燃酒精灯，在酒精灯火焰无菌区范围内，将接种针和打孔器在酒精灯火焰上灼烧消毒，用打孔器在蝉花平板菌种表面进行打孔，打孔时沿菌落最外缘向中间逐次打，边缘的菌丝生长能力比较旺盛；用消毒过的接种针挑1个菌饼块，沿着三角瓶封口薄膜一侧揭开一条缝，通过酒精灯火焰的无菌区，将菌饼块掉入三角瓶内，每个三角瓶内接2块的菌饼块；放菌饼块的时候不要接触到瓶壁，避免污染；

(4)培养：接种后将三角瓶移至19℃的恒温振荡摇床中静止培养24h，后在恒温19℃，转速为120r/min的恒温振荡摇床继续培养6-7天。

2.根据权利要求1所述的野生蝉花液体菌种人工培养的优化方法，其特征在于：所述步骤(2)中的分装采用漏斗进行分装。