CN100510061C - 菌根真菌诱导子提高液体培养铁皮石斛原球茎质量的方法 - Google Patents
菌根真菌诱导子提高液体培养铁皮石斛原球茎质量的方法 Download PDFInfo
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Abstract
一种利用菌根真菌提高液体培养的铁皮石斛原球茎药用品质的应用技术，所用的菌根真菌为小菇属真菌MF24(Mycena sp.)；先分别培养真菌和铁皮石斛原球茎，再将培养的真菌制成诱导子，加入铁皮石斛原球茎中共同培养。该项新技术可以快速、大规模地生产铁皮石斛原球茎作为铁皮石斛的替代药材。采用该技术生产的铁皮石斛原球茎中，有效成分多糖和石斛碱类生物碱含量显著提高、免疫活性明显增强。
Description
技术领域
本发明属于生物工程技术领域。具体说涉及一种提高悬浮培养的铁皮石斛原球茎多糖和总生物碱含量的实用技术。
背景技术
铁皮石斛(Dedrobium candidum Wall.ex Lindl)，又名耳环石斛或黑节草，是药用石斛中的珍品。在我国石斛属60多种植物中，铁皮石斛是《中国药典》收录的仅有的5种石斛之一。经过一定工艺加工而制成的铁皮石斛的生药——枫斗是国内外著名的昂贵补品。然而，由于铁皮石斛的生长条件限制性较高，野生资源有限，加上近年来过分的采挖，已经造成铁皮石斛野生资源的枯竭。铁皮石斛已被列入中国濒危植物目录。
铁皮石斛是兰科(Orchidaceae)植物，采用合轴生长的方式进行繁殖：在匍匐的根状茎的节上长出新芽。新芽经过一个季节的生长成熟，发展成为新的植株。这些新植株先长出幼茎，称为假鳞茎，然后在假鳞茎上长出叶片，最终长成完整的植株。原球茎(Protocorm)是铁皮石斛种子萌发过程中，原胚萌动膨大，突破种皮后形成的浅黄色小圆锥形胚性组织。铁皮石斛的外植体叶尖、茎尖、基尖等经过诱导也可以形成类似于原球茎的胚性组织。原球茎可以进一步发育成为假鳞茎，然后长出根和叶，形成完整的植株。但原球茎形成成熟植株受很多因素限制，所需时间也比较长。铁皮石斛的原球茎生长快速，自我分生旺盛，活力持久，是一种理想的铁皮石斛药材的替代品。可是由于原球茎是幼嫩的植物体，含有较少的次生代谢产物，离真正成为铁皮石斛的替代药材还有一定的距离。
铁皮石斛是与真菌共生的植物。真菌诱导子(elicitor)是指将分离培养的真菌菌丝体制备成的灭菌溶液，它可以促进植物的生长或诱导植物产生和积累次生代谢产物。近年来的研究表明：利用来自真菌的诱导子成分，可以诱导植物悬浮培养细胞或植物幼苗产生或提高体内相关有效成分。现代生物技术应用诱导子可以大幅度提高人工组织细胞培养的药用植物包括红豆杉、长春花和紫草中的有效成分。
发明内容
本发明的目的是提供真菌诱导子制备方法、铁皮石斛原球茎液体悬浮培养方法和真菌诱导子与铁皮石斛原球茎混合培养方法，该方法工艺简单、成本低、周期短、可用于大规模工业化生产铁皮石斛原球茎。
本发明的另一目的在于提供优质的铁皮石斛原球茎，主要是提高铁皮石斛原球茎的有效成分石斛碱类生物碱和多糖含量，以便大规模生产的铁皮石斛原球茎能够替代铁皮石斛药材，解决铁皮石斛药用资源紧缺的问题。
为实现上述目的，本发明采用的技术是先培养铁皮石斛原球茎，在其生长后期加入真菌诱导子，共同培养一段时间。本发明提供的真菌诱导子制备方法是采用真菌MF24(Mycena sp.)发酵培养，再制备诱导子。本发明采用的真菌由野生铁皮石斛根中分离得到，经培养鉴定为小菇属真菌MF24(Mycena sp.)，该菌种于2005年4月20日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏单位地址：北京市海淀区中关村北一条13号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.1350。保藏和存活证明见附件。
具体地说，本发明所述的技术步骤如下：
1.真菌的培养
将上述真菌自低温保藏的斜面试管菌种活化后，转接于含PDA培养基的平皿中，于25℃恒温培养18-26天，分别在菌落边缘打孔成菌片，并以小碎块接入液体培养基进行培养和发酵。
真菌液体培养的培养基为：葡萄糖1.5-4％，KH2PO4 0.1-0.4％，MgSO4 0.1-0.3％；天然物：麦麸1-5％(煮汁)，以上组分均按重量百分含量计算，培养基pH5.0-6.5，三角瓶或其他容器振荡培养真菌。容器装量30-60％。高压灭菌后接入上述真菌。培养条件：振荡转速100-130转/分钟；22-26℃暗培养18-25天收获。
2.真菌诱导子的制备
上述真菌经发酵培养后，用80-120目尼龙网过滤，分离菌丝体和发酵液，按下列方法制备成不同真菌诱导子；
(1)混合诱导子：30-60g菌丝体兑入1L本身的发酵液，匀浆后121℃灭菌20分钟，制得混合诱导子
(2)菌丝体诱导子：30-60g菌丝体兑入1L盐溶液，匀浆后121℃灭菌20分钟，制得菌丝体诱导子。盐溶液组成及浓度：NaNO3(8-15mM)，KCl(0.8-1.5mM)，Na2SO4(0.8-1.5mM)，MgSO4(0.8-1.5mM)，CaCl2(0.8-1.5mM)。
3.铁皮石斛原球茎的液体悬浮培养
取在1/2MS土豆固体培养基上生长10-18周的铁皮石斛原球茎种源，继代于1/2MS土豆液体培养基中，接种量：2-8％(W/V)；于23-26℃光照培养30-45天，光照强度：1500-6000Lux，光照时间：8-12小时/天，震荡培养速度：100-130转/分钟。
铁皮石斛原球茎种源的培养基：土豆 150-250g/L(煮20分钟，取汁)，1/2MS培养基，蔗糖 20-40g/L，肌醇 80-120mg/L，pH 5.0-6.5，琼脂粉 6-9g/L，培养容器装量 10％-50％。
铁皮石斛原球茎液体悬浮培养的培养基：土豆 150-250g/L(煮20分钟，取汁)，1/2MS培养基，蔗糖 20-40g/L，肌醇 80-120mg/L，pH 5.0-6.5，培养容器装量 10％-50％。
4.铁皮石斛原球茎与真菌诱导子共同培养
向生长30-45天的铁皮石斛原球茎液体培养基中，加入任意一种灭菌的真菌诱导子，加入剂量为3-20％(V/V)。
5.铁皮石斛原球茎的收获
铁皮石斛原球茎加入诱导子后继续振荡光照培养2-8天收获，收获时80-120目尼龙网过滤去除培养基，原球茎冲洗干净，阴干或50-60℃烘干供药用。
具体实施方式
实施例：
1.真菌的培养
(1)将小菇属真菌(Mycena sp.)自低温保藏的斜面试管菌种活化后，转接于ф90mmPDA平皿中，25℃恒温培养24天后，用ф9mm的打孔器分别在平皿中的菌落边缘打孔成菌片，并以小碎块接入液体培养基进行培养和发酵。
(2)真菌液体培养的培养基：葡萄糖 20克/升，KH2PO4 3克/升，MgSO4 1.5克/升；天然物：麦麸 30克/升(煮汁)，pH5.6。
(3)培养条件：上述培养基500mL摇床培养瓶装量200mL，121℃灭菌30分钟，接入小菇属真菌(Mycena sp.)。其培养条件：摇床转速120转/分钟，温度：25℃，暗培养21天收获。
2.真菌诱导子的制备
小菇属(Mycena sp.)真菌发酵培养结束后，用100目尼龙网过滤，分离菌丝体和发酵液，菌丝体称重，50克菌丝体兑入1L本身的发酵液，匀浆后121℃灭菌20分钟，制成混合诱导子。
3.铁皮石斛原球茎的液体悬浮培养
(1)铁皮石斛原球茎种源的固体培养基：1/2MS，蔗糖 30克/升，肌醇 100毫克/升；天然物：土豆 200克/升(去皮，煮20分钟，取汁)，pH 5.8，琼脂粉 7.5克/升。
(2)铁皮石斛原球茎液体培养的培养基：1/2MS，蔗糖 30克/升，肌醇 100毫克/升；天然物：土豆 200克/升(去皮，煮20分钟，取汁)，pH5.8。
(3)上述液体培养基250mL三角瓶装量100mL，121℃灭菌20分钟，接入于固体培养基上生长15周的铁皮石斛原球茎，接种量5克左右/瓶，于24-26℃光照培养40天，光照强度：2000Lux，光照时间：10小时/天，震荡培养速度：120转/分钟。
4.铁皮石斛原球茎与真菌诱导子共同培养
向生长40天的铁皮石斛原球茎培养基中加入灭菌的混合诱导子，加入剂量为10mL/瓶，加入混合诱导子后继续以原条件光照震荡培养。
5.铁皮石斛原球茎的收获
铁皮石斛原球茎加入混合诱导子后继续培养6天后收获，用100目尼龙网过滤，分离培养基和铁皮石斛原球茎，原球茎冲洗干净后，于55℃烘干。
比较例
1.真菌诱导子对液体悬浮培养的铁皮石斛原球茎生长的影响
MF24真菌(Mycena sp.)接种到有PDA培养基的平皿中，25℃恒温培养24天后，转入液体培养基中培养21天收获。分离发酵液和菌丝体，菌丝体称重，50菌丝体兑入1L本身的发酵液，匀浆后灭菌，制成混合诱导子。
固体培养的铁皮石斛原球茎转接到含有1/2MS液体培养基100mL的三角瓶中，接种量为5克/瓶。接种的原球茎于24-26℃光照培养，光照强度：2000Lux，光照时间：10小时/天，震荡培养速度：120转/分钟。培养40天后，向铁皮石斛原球茎培养基中加入灭菌的混合诱导子，加入剂量为10mL/瓶。加入混合诱导子后继续以原条件光照震荡培养6天，收获。以加入蒸馏水培养的原球茎为对照。收获的铁皮石斛原球茎称鲜重，样品55℃干燥后称干重。经统计分析，结果表明，MF24真菌混合诱导子对液体悬浮培养的铁皮石斛原球茎的生长没有影响。
2.真菌诱导子对液体悬浮培养的铁皮石斛原球茎多糖含量的影响
MF24真菌(Mycena sp.)接种到有PDA培养基的平皿中，25℃恒温培养24天后，转入液体培养基中培养21天收获。分离发酵液和菌丝体，菌丝体称重，50菌丝体兑入1L本身的发酵液，匀浆后灭菌，制成混合诱导子。
固体培养的铁皮石斛原球茎转接到含有1/2MS液体培养基100mL的三角瓶中，接种量为5克/瓶。接种的原球茎于24-26℃光照培养，光照强度：2000Lux，光照时间：10小时/天，震荡培养速度：120转/分钟。培养40天后，向铁皮石斛原球茎培养基中加入灭菌的混合诱导子，加入剂量为10mL/瓶。加入混合诱导子后继续以原条件光照震荡培养6天，收获。以加入蒸馏水培养的原球茎为对照。收获的铁皮石斛原球茎55℃干燥。以葡萄糖为标准品，用苯酚-硫酸法测定铁皮石斛原球茎中多糖的含量。实验结果表明：与对照组相比，MF24真菌混合诱导子处理的铁皮石斛原球茎多糖含量提高了40％。
3.真菌诱导子对液体悬浮培养的铁皮石斛原球茎总生物碱含量的影响
MF24真菌(Mycena sp.)接种到有PDA培养基的平皿中，25℃恒温培养24天后，转入液体培养基中培养21天收获。分离发酵液和菌丝体，菌丝体称重，50菌丝体兑入1L本身的发酵液，匀浆后灭菌，制成混合诱导子。
固体培养的铁皮石斛原球茎转接到含有1/2MS液体培养基100mL的三角瓶中，接种量为5克/瓶。接种的原球茎于24-26℃光照培养，光照强度：2000Lux，光照时间：10小时/天，震荡培养速度：120转/分钟。培养40天后，向铁皮石斛原球茎培养基中加入灭菌的混合诱导子，加入剂量为10mL/瓶。加入混合诱导子后继续以原条件光照震荡培养6天，收获。以加入蒸馏水培养的原球茎为对照。收获的铁皮石斛原球茎55℃干燥。以石斛碱为标准品，用酸性染料比色法测定铁皮石斛原球茎中总生物碱的含量。实验结果表明：与对照组相比，MF24真菌混合诱导子处理的铁皮石斛原球茎总生物碱含量提高了58.2％。
4.真菌诱导子对液体悬浮培养的铁皮石斛原球茎促淋巴细胞增殖作用的影响
MF24真菌(Mycena sp.)接种到有PDA培养基的平皿中，25℃恒温培养24天后，转入液体培养基中培养21天收获。分离发酵液和菌丝体，菌丝体称重，50菌丝体兑入1L本身的发酵液，匀浆后灭菌，制成混合诱导子。
固体培养的铁皮石斛原球茎转接到含有1/2MS液体培养基100mL的三角瓶中，接种量为5克/瓶。接种的原球茎于24-26℃光照培养，光照强度：2000Lux，光照时间：10小时/天，震荡培养速度：120转/分钟。培养40天后，向铁皮石斛原球茎培养基中加入灭菌的混合诱导子，加入剂量为10mL/瓶。加入混合诱导子后继续以原条件光照震荡培养6天，收获。以加入蒸馏水培养的原球茎为对照。收获的铁皮石斛原球茎55℃干燥。用铁皮石斛原球茎的水提取浸膏做鸡淋巴T细胞增殖实验，结果表明：与对照组相比，MF24真菌混合诱导子处理的铁皮石斛原球茎促进鸡淋巴T细胞增殖作用明显地提高。
Claims (6)
1.一种制备铁皮石斛原球茎的方法，包括步骤：
(1)真菌的培养
将保藏编号为CGMCC No.1350的小菇属真菌MF24(Mycena sp.)自低温保藏的斜面试管菌种活化后，转接于含PDA培养基的平皿中，于25℃恒温暗培养18-26天，分别在菌落边缘打孔成菌片，并以小碎块接入液体培养基进行培养和发酵；
真菌液体培养的培养基组成为葡萄糖、KH2PO4、MgSO4、麦麸；各组分按重量计为葡萄糖1.5-4％，KH2PO4 0.1-0.4％，MgSO4 0.1-0.3％，麦麸1-5％；其中所述麦麸须加水煮后取汁使用；培养基pH5.0-6.5；
真菌液体培养条件为：三角瓶或其他容器振荡培养真菌，容器装量30-60％；灭菌后接入上述真菌，振荡转速100-130转/分钟；22-26℃暗培养18-25天收获；
(2)真菌诱导子的制备
上述真菌经发酵培养后，按下列方法制备成不同真菌诱导子；
①混合诱导子：菌丝体兑入本身的发酵液，匀浆后灭菌，制成混合诱导子；
②菌丝体诱导子：菌丝体按比例兑入用蒸馏水配制的盐溶液中，匀浆，盐溶液过滤，灭菌，制成菌丝体诱导子溶液；
(3)铁皮石斛原球茎的液体悬浮培养
在1/2MS土豆固体培养基中生长的铁皮石斛原球茎种源，接入1/2MS土豆液体培养基中，振荡光照培养；固体培养基组成为：土豆150-250g/L，1/2MS培养基，蔗糖20-40g/L，肌醇80-120mg/L，pH5.0-6.5，琼脂粉6-9g/L；培养容器装量10％-50％；液体培养基组成为：土豆150-250g/L，1/2MS培养基，蔗糖20-40g/L，肌醇80-120mg/L，pH5.0-6.5；培养容器装量10％-50％；固体和液体培养基组分中的土豆须加水煮20分钟后取汁使用；
(4)铁皮石斛原球茎与真菌诱导子共同培养
向正在生长的铁皮石斛原球茎液体培养基中，加入一种灭菌的真菌诱导子，与其共同培养；
(5)铁皮石斛原球茎的收获
铁皮石斛原球茎加入诱导子后继续振荡光照培养2-8天，收获；原球茎冲洗干净，阴干或50～60℃烘干。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：30-60g菌丝体兑入1L本身的发酵液，匀浆后灭菌，制成混合诱导子。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于：30-60g菌丝体兑入1L盐溶液，匀浆后灭菌，制成菌丝体诱导子；盐溶液组成及浓度：NaNO3 8-15mM，KCl 0.8-1.5mM，Na2SO40.8-1.5mM，MgSO4 0.8-1.5mM，CaCl2 0.8-1.5mM。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于：取在1/2MS土豆固体培养基上生长10-18周的铁皮石斛原球茎，接种于1/2MS土豆液体培养基中，接种量以重量体积计为2-8％；于23-26℃光照培养30-45天，光照强度：1500-6000Lux，光照时间：8-12小时/天，震荡培养速度：100-130转/分钟。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于：在无菌条件下，向生长30-45天的铁皮石斛原球茎液体培养基中，任意加入一种灭菌的真菌诱导子与原球茎共同培养，加入剂量以体积比计为3-20％。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于：铁皮石斛原球茎加入诱导子后继续震荡光照培养2-8天收获，收获时80-120目尼龙网过滤去除培养基，原球茎冲洗干净，阴干或50-60℃烘干供药用。
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