CN104630073A - 一种铁皮石斛内生真菌菌株nt66g01及其应用 - Google Patents

一种铁皮石斛内生真菌菌株nt66g01及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种铁皮石斛内生真菌菌株NT66G01及其应用，所述菌株NT66G01在分类学上属于麦角菌属，命名为Claviceps sp.，已于2014年7月9日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO.M2014334；该菌株的基因组18s rDNA碱基序列如SEQ ID No.1所示。实验证明：采用本发明所述的铁皮石斛内生真菌菌株NT66G01制备的真菌诱导子培养基和生物菌肥均对铁皮石斛的生长具有明显的促进作用，可用于铁皮石斛的人工种植中，以提高铁皮石斛的产量，具有显著的应用价值。

Description

一种铁皮石斛内生真菌菌株NT66G01及其应用
技术领域
本发明涉及一种铁皮石斛内生真菌菌株及其应用，属于微生物技术领域。
背景技术
植物内生真菌是指那些在其生活史的一定阶段或全部阶段生活于健康植物的各种组织和器官内部的真菌，与菌根真菌只存在于植物根系不同，内生真菌在植株的地下和地上部分的任何组织器官都能存在(Faeth&Fagan，2002)。研究发现：植物内生真菌不仅包括了互惠共利的和中性的内共生真菌，也包括了那些潜伏在宿主体内的病原菌；有的内生真菌能促进宿主植物的生长、增强宿主的抗逆性、促进宿主植物活性成分的合成和积累，在提高植物产量和质量中可以起到积极作用。因此，内生真菌与植物的互作研究己日益受到研究者的关注，并成为内生真菌研究领域的国际热点。
铁皮石斛(Dendrobium officinale Kimura et Migo)属兰科附生草本植物，是我国传统名贵中药，广泛运用于慢性咽炎、闭塞性周围血管病、白内障、青光眼等疾病的治疗药方及各种保健品中，市场需求量很大，长期无节制的采挖造成其资源枯竭，已无野生资源可用。近年来，铁皮石斛的人工种植已在浙江、云南等地大规模开展，成为一个新兴产业。因此，研究筛选具有明显促生作用的铁皮石斛内生真菌菌株，将对铁皮石斛的大规模人工种植具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种具有明显促生作用的铁皮石斛内生真菌菌株NT66G01及其在铁皮石斛生长中的应用。
本发明所提供的铁皮石斛内生真菌菌株NT66G01，在分类学上属于麦角菌属(Claviceps)，命名为Claviceps sp.，已于2014年7月9日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO.M2014334；该菌株的基因组18s rDNA碱基序列如SEQ ID No.1所示。
本发明所述的铁皮石斛内生真菌菌株NT66G01是采用内生真菌分离纯化技术从铁皮石斛(Dendrobium officinale Kimura et Migo)植物活体中分离、纯化得到。
本发明所述的铁皮石斛内生真菌菌株NT66G01可通过制备成真菌诱导子培养基或生物菌肥应用于铁皮石斛的生长中。
由本发明所述的铁皮石斛内生真菌菌株NT66G01制备真菌诱导子培养基的方法，包括如下步骤：菌种活化→种子液培养→发酵培养→将发酵液真空抽滤，将菌丝体与液氮研磨液与滤液合并后灭菌，得到真菌诱导子→将真菌诱导子接入MS培养基中，即得真菌诱导子培养基。
作为优选方案，真菌诱导子按5％～15％体积的量接入MS培养基中。
由本发明所述的铁皮石斛内生真菌菌株NT66G01制备生物菌肥的方法，包括如下步骤：菌种活化→种子液培养→发酵培养→将发酵液与树皮粉搅拌混匀，即得生物菌肥。
作为优选方案，按每50g树皮粉加5～15mL发酵液搅拌混匀。
作为优选方案，上述的菌种活化采用试管斜面培养，培养基为马铃薯葡萄糖琼脂培养基(固体PDA)，于28±1℃活化培养72小时。
作为优选方案，上述的种子液培养采用马铃薯葡萄糖液体培养基(液体PDA)，于28±1℃摇床培养72小时。
作为优选方案，上述的发酵培养采用马铃薯葡萄糖液体培养基(液体PDA)，于28±1℃发酵培养7天，接种量为5V％～15V％。
实验证明：采用本发明所述的铁皮石斛内生真菌菌株NT66G01制备的真菌诱导子培养基和生物菌肥均对铁皮石斛的生长具有明显的促进作用，可用于铁皮石斛的人工种植中，以提高铁皮石斛的产量，具有显著的应用价值。
附图说明
图1为本发明所述的铁皮石斛内生真菌菌株NT66G01在100倍显微镜下观察到的菌丝形态图。
图2为本发明所述的铁皮石斛内生真菌菌株NT66G01在电子显微镜下观察到的菌丝形态图。
图3为本发明所述的铁皮石斛内生真菌菌株NT66G01在电子显微镜下观察到的孢子形态图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而 不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件、实验室手册中所述的条件或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1
本发明所述的铁皮石斛内生真菌菌株NT66G01于2014年7月9日保藏于中国典型培养物保藏中心(湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学，邮编430072)，保藏号为CCTCC NO.M2014334；该菌株的基因组18s rDNA碱基序列如SEQ ID No.1所示。
所述的铁皮石斛内生真菌菌株NT66G01的固体培养特征为：
在马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基上于28±1℃培养，最初气生菌丝无色，渐变白色；菌落呈白色绒毛状，菌丝体较发达，近培养基处时间长有淡紫色，背面白色慢慢变成红棕色。
所述的铁皮石斛内生真菌菌株NT66G01的液体培养特征为：
a)培养基PDA，摇瓶培养7天，培养温度为28±1℃；
b)发酵培养特征：培养第1-2天，未见明显生长现象；培养第3天，有白色菌丝出现；培养第4-5天，菌丝体增多；培养第6天，形成直径1-2mm白色菌丝球；培养第7天，菌丝球增大到2-4mm。
本发明所述的铁皮石斛内生真菌菌株NT66G01的形态特征为：
1、无性世代，菌丝体成典型人参形态，根须长短不一，末端可产孢子囊，孢子囊中最多可含8个孢子，亦可侧生短梗或无梗孢子(囊)。
2、有性世代，未发现。
实施例2
1)取本发明的铁皮石斛内生真菌菌株NT66G01菌种，在无菌条件下，用接种针挑取少量菌丝，接入已灭菌的固体PDA培养基试管，于28±1℃活化培养72小时；
2)取活化培养后的菌种，在无菌条件下，转接入已灭菌的液体PDA种子培养基中，于28±1℃、140rpm摇床培养72小时，得种子液；
3)在无菌条件下，按10V％(体积百分比)接种量接入500mL液体PDA培养基中，于28±1℃、140rpm摇床培养7天；
4)将发酵液真空抽滤，将菌丝体与液氮的研磨液与滤液合并后于121℃灭菌20分钟， 得到真菌诱导子；
5)将真菌诱导子按10％体积的量接入MS培养基中，得到真菌诱导子培养基；
6)在无菌条件下，接苗于对照(MS)培养基和真菌诱导子培养基中，无菌室培养，记录好苗的数量，根数目及高度；
7)定期观察，培养6个月后，对原球茎、苗进行称重，并计算增苗棵数，与对照组进行组间分析；观察结果见表1所示；
表1真菌诱导子对铁皮石斛苗增殖分化的影响
菌株/对照 原球茎增重(g) 苗增重(g) 总增重(g) 苗分化率(倍数)
NT66G01 2.356±1.203 6.165±0.940 8.521±1.558 6.40±0.61
空白对照 0.9225±0.389 3.370±0.364 4.293±0.658 2.99±0.30
由表1结果可见：由铁皮石斛内生真菌菌株NT66G01制备的真菌诱导子具有明显促进铁皮石斛苗的增重和分化作用。
8)取诱导组铁皮石斛苗及对照组铁皮石斛苗，提取总RNA，进行荧光定量PCR，对诱导组铁皮石斛苗进行相关基因表达分析，选取基因PAL；iaaM；检测结果见表2和表3所示；
表2PAL基因表达变化
组别 2-ΔΔct
空白对照 1.0060±0.1185
NT66G01 4.1119±0.5984
表3iaaM基因表达变化
组别 2-ΔΔct
空白对照 1.0026±0.0875
NT66G01 3.8178±0.2017
由表2和表3结果可见：诱导组铁皮石斛苗中PAL基因表达和iaaM基因均与空白组相比有明显增强(P＜0.05)。

Claims (10)

1.一种铁皮石斛内生真菌菌株NT66G01，其特征在于：该菌株在分类学上属于麦角菌属，命名为Claviceps sp.，已于2014年7月9日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO.M2014334；该菌株的基因组18s rDNA碱基序列如SEQ ID No.1所示。
2.权利要求1所述的铁皮石斛内生真菌菌株NT66G01在铁皮石斛生长中的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于：将铁皮石斛内生真菌菌株NT66G01制备成真菌诱导子培养基或生物菌肥应用于铁皮石斛的生长中。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，由所述的铁皮石斛内生真菌菌株NT66G01制备真菌诱导子培养基的方法包括如下步骤：菌种活化→种子液培养→发酵培养→将发酵液真空抽滤，将菌丝体与液氮研磨液与滤液合并后灭菌，得到真菌诱导子→将真菌诱导子接入MS培养基中，即得真菌诱导子培养基。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于：真菌诱导子按5％～15％体积的量接入MS培养基中。
6.如权利要求3所述的应用，其特征在于，由所述的铁皮石斛内生真菌菌株NT66G01制备生物菌肥的方法包括如下步骤：菌种活化→种子液培养→发酵培养→将发酵液与树皮粉搅拌混匀，即得生物菌肥。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于：按每50g树皮粉加5～15mL发酵液搅拌混匀。
8.如权利要求4或6所述的应用，其特征在于：所述的菌种活化采用试管斜面培养，培养基为马铃薯葡萄糖琼脂培养基，于28±1℃活化培养72小时。
9.如权利要求4或6所述的应用，其特征在于：所述的种子液培养采用马铃薯葡萄糖液体培养基，于28±1℃摇床培养72小时。
10.如权利要求4或6所述的应用，其特征在于：所述的发酵培养采用马铃薯葡萄糖液体培养基，于28±1℃发酵培养7天，接种量为5V％～15V％。
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