CN100457891C - 培养猪苓菌丝体形成猪苓菌核的方法 - Google Patents
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Abstract
一种培养猪苓菌丝体形成猪苓菌核的方法，所用的真菌为分离自野生猪苓(Polyporusumbellatus)并经过人工驯化和选育的猪苓菌种GZ-06；通过在培养基中添加特殊的物质，高效诱导猪苓菌丝体形成菌核。该技术猪苓菌丝体发生菌核率高、菌核生长周期短、培养过程简单，可大规模工业化生产；应用该技术培养生产的人工猪苓菌核和天然猪苓菌核特征性化学成分的指纹图谱基本一致，可以成为猪苓的替代药材使用。
Description
技术领域
本发明属于生物工程技术领域。具体说涉及一种在固体培养基中添加特殊物质诱导猪苓菌丝体快速形成猪苓菌核的实用技术。
背景技术
猪苓Polyporus umbellatus(Pers.)Fries隶属于真菌门(Eumycophyta)、担子菌纲(Basidiomycetes)、多孔菌目(Polyporales)多孔菌科(Polyporaceae)。猪苓菌核生于地下，其干燥品入药，又称豕苓、猪茯苓、野猪屎、地乌桃。猪苓子实体从地下的菌核上长出，俗称“猪苓花”、“千层蘑菇”，味美质软，可以食用。猪苓始载于《神农本草经》，列为中品，在我国已经有2000多年的药用历史，临床主要用于治疗急性肾炎，淋病，糖尿病，全身浮肿，小便不畅，尿急尿频，尿道疼痛，受暑水泻以及急性肝炎，急性胃炎等疾病。从猪苓菌核中提取的猪苓多糖能显著降低肝脏中氧化脂质的含量，有清除自由基损伤作用，能提高细胞中超氧化物歧化酶和肝脏过氧化氢酶的活力，对于延缓组织细胞老化、保护机体、抗老防衰十分有益。
近年来由于环境污染，人口增加，社会老龄化加快，使肿瘤及各种老年性疾病的发生率提高，导致猪苓在中药中用量大增。猪苓多糖是从猪苓菌核中提取的主要有效成分，主要用于肿瘤治疗，疗效可靠、稳定。由于肿瘤发病率提高，猪苓多糖的需求量和生产量显著提高，加之近年的研究发现猪苓多糖还具有抗老防衰的新疗效，使得猪苓菌核原料的年消耗量猛增。而野生猪苓一方面由于人类过度活动，大量的毁林造田，使其生境被破坏，另一方面由于价格因素的刺激，导致无序采挖，使近年来其产量锐减。以上因素造成猪苓菌核的货源紧缺，价格持续升高。
人工栽培猪苓，虽然早已实验成功，但由于栽培技术要求高，工序繁杂，生产周期长，需要3-4年方能采收，且单产低、收益少，因此发展缓慢。由于现有的猪苓人工栽培技术中的种苓问题始终没有根本解决，目前大规模的猪苓栽培还只限于半野生栽培，这是限制猪苓货源的瓶颈问题。如果能研究出由猪苓菌丝体大面积工业化生产猪苓菌核的新技术，每年将可以节约大量的种苓用猪苓菌核，使商品菌核的产量大幅度增加。
近20多年来，中国以及日本、韩国的科技工作者先后对猪苓菌丝体形成菌核的机理进行了长期研究，均未取得实质性进展。由于猪苓菌核的形成机制研究一直没有突破性进展，对菌核形成的机理尚不明确，一直难以实现由菌丝体到菌核的稳定的转化，因而也就不能实现用猪苓菌种大量地生产猪苓菌核作为种苓或药材，也无法象人工培养许多食用菌那样全人工栽培猪苓菌核。
发明内容
本发明的目的是提供固体培养诱导猪苓菌丝体形成菌核的方法，该方法猪苓菌丝体发生菌核率高、菌核生长周期短、培养过程简单，可大规模工业化生产猪苓菌核。
本发明的另一目的是用固体培养的人工猪苓菌核替代野生猪苓菌核药材，解决猪苓菌核药用资源紧缺的问题。
为实现上述目的，本发明采用的技术是先液体发酵培养猪苓种子菌种，再将种子菌种接种到添加了特殊物质的固体培养基上，诱导猪苓菌丝体形成猪苓菌核。本发明采用的真菌为分离自野生猪苓并经过人工驯化和选育的猪苓菌株GZ-06，经培养鉴定为猪苓(Polyporusumbellatus)，该菌种于2005年7月20日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏单位地址：北京市海淀区中关村北一条13号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.1418。保藏和存活证明见附件。
具体地说，本发明所述的技术步骤方法如下：
1.猪苓种子菌种的液体培养
将猪苓菌株GZ-06自低温保藏的斜面试管菌种活化后，转接于含PDA培养基的平皿中，于24-26℃恒温培养30-50天，分别在菌落边缘打孔成菌片，并以小碎块接入液体培养基中进行发酵培养；
猪苓菌株GZ-06液体培养的培养基：玉米面1-5％，酵母膏1-5％，KH2PO4 0.05-0.2％，MgSO40.05-0.2％，CaCO3 0.05-0.1％，VB1 0.008-0.03％，以上组分均按重量百分含量计算，其余成分为水，pH 5.0-6.5，三角瓶或其他容器振荡，暗培养真菌。容器装量30-60％，灭菌后接入上述猪苓菌株。培养条件：振荡转速100-150转/分钟；22-25℃暗培养；12-20天收获。
2.猪苓菌丝体的固体诱导培养
上述菌株液体发酵培养后，种子菌种接入诱导猪苓菌丝体形成猪苓菌核的固体培养基上，培养条件：18-25℃静置，暗培养；25-50天收获。固体培养的培养基为：
(1)培养基1：甘油0.5-6％，蛋白胨0.6-1％，玉米浆0.5-2％，琼脂0.8-2.0％，以上组分均按重量百分含量计算，其余成分为水，pH 4.5-6.5，试管或罐头瓶等玻璃器皿，容器装量20-50％，静置，暗培养，25-50天收获；
(2)培养基2：甘露醇0.5-6％，蛋白胨0.6-1％，玉米浆0.5-2％，琼脂0.8-2.0％，以上组分均按重量百分含量计算，其余成分为水，pH 4.5-6.5，试管或罐头瓶等玻璃器皿，容器装量20-50％，静置，暗培养，25-50天收获；
(3)培养基3：锯末(或小麦秸、或玉米秸、或玉米芯)20-25％，豆饼粉0.5-2％，甘油1.0-7.0％，玉米浆0.2-1.0％，以上组分均按重量百分含量计算，其余成分为水，罐头瓶、花盆等器皿，容器装量50-80％，静置，暗培养，30-120天收获。
具体实施方式
实施例：
1.猪苓种子菌种的液体培养
将猪苓菌株GZ-06自低温保藏的斜面试管菌种活化后，转接于含PDA培养基的平皿中，于24-26℃恒温培养40天，分别在菌落边缘打孔成菌片，并以小碎块接入液体培养基中进行发酵培养；猪苓菌株GZ-06液体培养的培养基：玉米面3％，酵母膏3％，KH2PO4 0.1％，MgSO4 0.1％，CaCO3 0.05％，VB1 0.01％，以上组分均按重量百分含量计算，其余成分为水，pH 6.0，三角瓶振荡，暗培养真菌。容器装量40％，灭菌后接入上述猪苓菌株。培养条件：振荡转速120转/分钟；22-25℃暗培养，15天收获。
2.猪苓菌丝体的固体诱导培养
上述菌株液体发酵培养后，种子菌种接种到诱导猪苓菌丝体形成猪苓菌核的固体培养基1上，培养基组成：甘油2％，蛋白胨0.6％，玉米浆1％，琼脂2％，以上组分均按重量百分含量计算，其余成分为水，pH 6.0，试管静置，暗培养，容器装量30％；培养条件：18-25℃静置暗培养；35天收获。
比较例：
1.固体培养基1对猪苓菌核的诱导
将猪苓菌株GZ-06自低温保藏的斜面试管菌种活化后，在24-26℃下于PDA培养基平皿中培养40天，接入液体培养基中进行发酵培养。液体培养的培养基：玉米面3％，酵母膏3％，KH2PO40.1％，MgSO4 0.1％，CaCO3 0.05％，VB1 0.01％，以上组分均按重量百分含量计算，其余成分为水，pH 6.0，三角瓶振荡，暗培养真菌。容器装量40％，灭菌后接入上述猪苓菌株。培养条件：振荡转速120转/分钟；22-25℃暗培养；18天收获。收获的种子菌种接种到固体培养基1上，培养基组成：甘油2％，蛋白胨0.6％，玉米浆1％，琼脂2％，以上组分均按重量百分含量计算，其余成分为水，pH 6.0，用250ml输液瓶装培养基，容器装量40％；培养条件：18-25℃静置，暗培养。培养至32天时，每10瓶培养物中有3瓶生长形成了猪苓菌核；培养到50天时，每10瓶培养物有8瓶形成了猪苓菌核。这一结果说明固体培养基1对猪苓菌核的诱导率能达到80％。
2.固体培养基2对猪苓菌核的诱导
将猪苓菌株GZ-06自低温保藏的斜面试管菌种活化后，在24-26℃下于PDA培养基平皿中培养40天，接入液体培养基中进行发酵培养。液体培养的培养基：玉米面3％，酵母膏3％，KH2PO40.1％，MgSO4 0.1％，CaCO3 0.05％，VB1 0.01％，以上组分均按重量百分含量计算，其余成分为水，pH 6.0，三角瓶振荡，暗培养真菌。容器装量40％，灭菌后接入上述猪苓菌株。培养条件：振荡转速120转/分钟；22-25℃暗培养；18天收获。收获的种子菌种接种到固体培养基2上，培养基组成：甘露醇2％，蛋白胨0.6％，玉米浆1％，琼脂2％，以上组分均按重量百分含量计算，其余成分为水，pH 6.0，用250ml输液瓶装培养基，容器装量40％；培养条件：18-25℃静置，暗培养。培养至25天时，每10瓶培养物中有8瓶形成了猪苓菌核；培养至35天，每瓶中都形成了数量不等的黄豆粒大小的猪苓菌核。这一结果说明固体培养基2对猪苓菌核的诱导率能达到100％。
3.固体培养基3对猪苓菌核的诱导
将猪苓菌株GZ-06自低温保藏的斜面试管菌种活化后，在24-26℃下于PDA培养基平皿中培养40天，接入液体培养基中进行发酵培养。液体培养的培养基：玉米面3％，酵母膏3％，KH2PO40.1％，MgSO4 0.1％，CaCO3 0.05％，VB1 0.01％，以上组分均按重量百分含量计算，其余成分为水，pH 6.0，三角瓶振荡，暗培养真菌。容器装量40％，灭菌后接入上述猪苓菌株。培养条件：振荡转速120转/分钟；22-25℃暗培养；18天收获。收获的种子菌种接种到固体培养基3上，培养基组成：锯末20％，豆饼粉1％，甘油2.5％，玉米浆0.5％，以上组分均按重量百分含量计算，其余成分为水，用250ml输液瓶装培养基，容器装量70％；培养条件：18-25℃静置，暗培养。培养至30天时，10瓶培养物中都形成了白色的猪苓菌核，并且产生的猪苓菌核逐渐生长，体积增大，直径可以达到5cm以上。这一结果说明固体培养基3对猪苓菌核的诱导率能达到100％。
4.固体培养猪苓菌核与猪苓药材的质量比较
将猪苓菌株GZ-06自低温保藏的斜面试管菌种活化后，在24-26℃下于PDA培养基平皿中培养40天，接入液体培养基中进行发酵培养。液体培养的培养基：玉米面3％，酵母膏3％，KH2PO40.1％，MgSO4 0.1％，CaCO3 0.05％，VB1 0.01％，以上组分均按重量百分含量计算，其余成分为水，pH 6.0，三角瓶振荡暗培养真菌。容器装量40％，灭菌后接入上述猪苓菌株。培养条件：振荡转速120转/分钟；22-25℃暗培养；18天收获。收获的种子菌种分别接种到固体培养基1，2和3上。培养基1组成：甘油2％，蛋白胨0.6％，玉米浆1％，琼脂2％，以上组分均按重量百分含量计算，其余成分为水，pH 6.0，用250ml输液瓶装培养基，容器装量40％；培养基2组成：甘露醇2％，蛋白胨0.6％，玉米浆1％，琼脂2％，以上组分均按重量百分含量计算，其余成分为水，pH 6.0，用250ml输液瓶装培养基，容器装量40％；培养基3组成：锯末20％，豆饼粉1％，甘油2.5％，玉米浆0.5％，以上组分均按重量百分含量计算，其余成分为水，用250ml输液瓶装培养基，容器装量70％。培养条件：18-25℃静置，暗培养。培养至40天时，分别收获3种培养基上培养的猪苓菌核，55℃干燥。干燥的菌核粉碎后分别以甲醇提取，定容。各样品溶液经HPLC分析，并与用相同方法提取的猪苓药材溶液对照，结果表明：3种固体培养基上培养生产的人工猪苓菌核均与猪苓药材的特征性化学成分的指纹图谱基本一致，3种培养基培养的猪苓菌核的化学成分基本一致。
Claims (6)
1.一种培养猪苓(Polyporus umbellatus)菌株GZ-06的菌丝体形成猪苓菌核的方法，所述的猪苓菌株GZ-06的保藏编号为CGMCC No.1418，所述的方法包括步骤：
(1)猪苓种子菌种的液体培养
将所述的猪苓菌株GZ-06自低温保藏的斜面试管菌种活化后，转接于含PDA培养基的平皿中，于24-26℃恒温培养30-50天，分别在菌落边缘打孔成菌片，并以小碎块接入液体培养基中进行发酵培养；
所述的猪苓菌株GZ-06的液体培养：培养基组成为玉米面、酵母膏、KH2PO4、MgSO4、CaCO3、VB1，水；三角瓶或其他容器振荡暗培养真菌，制得猪苓种子菌种；
(2)猪苓菌丝体形成菌核的固体诱导培养
上述菌株液体发酵培养后，种子菌种接种到诱导猪苓菌丝体形成猪苓菌核的固体培养基上，于黑暗中静置培养，形成菌核；所述的固体培养基选自：
①、固体培养基1，所述的固体培养基1的组分按重量计为甘油0.5-6％，蛋白胨0.6-1％，玉米浆0.5-2％，琼脂0.8-2.0％，其余成分为水，pH 4.5-6.5；
②、固体培养基2，所述的固体培养基2的组分按重量计为甘露醇0.5-6％，蛋白胨0.6-1％，玉米浆0.5-2％，琼脂0.8-2.0％，其余成分为水，pH 4.5-6.5；
③、固体培养基3，所述的固体培养基3的组分按重量计为：
锯末、小麦秸、玉米秸或玉米芯 20-25％
豆饼粉 0.5-2％
甘油 1.0-7.0％
玉米浆 0.2-1.0％
其余成分为水。
2.如权利要求1所述的培养方法，其特征在于：猪苓种子菌种液体培养的培养基组分按重量计为玉米面1-5％，酵母膏1-5％，KH2PO40.05-0.2％，MgSO40.05-0.2％，CaCO30.05-0.1％，VB10.008-0.03％，其余成分为水，pH 5.0-6.5。
3.如权利要求1所述的培养方法，其特征在于：猪苓种子菌种液体培养条件为三角瓶或其他容器，培养基装量30-60％，灭菌后接入上述猪苓菌株，振荡培养转速100-150转/分钟；22-25℃暗培养，12-20天收获。
4.如权利要求1所述的培养方法，其特征在于：猪苓菌丝体在所述的固体培养基1和所述的固体培养基2上诱导形成猪苓菌核的培养条件为试管或玻璃罐头瓶静置，暗培养，容器装量20-50％；灭菌后接入液体培养的猪苓种子菌种，18-25℃暗培养；25-50天收获。
5.如权利要求1所述的培养方法，其特征在于：猪苓菌丝体在所述的固体培养基3上诱导形成猪苓菌核的培养条件为罐头瓶或花盆静置，暗培养，容器装量50-80％；灭菌后接入液体培养的猪苓种子菌种，18-25℃暗培养；30-120天收获。
6.如权利要求1中所述的培养方法，其特征在于，诱导猪苓菌丝体形成猪苓菌核的培养基3能用于大田或山区的猪苓菌丝体形成猪苓菌核的坑栽培。
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