CN105543105A - 促进大花红景天积累红景天苷的真菌菌株及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种桦粉粒座孢(Trimmatostroma？betulinum)真菌菌株，保藏编号为CGMCC？No.11417。将这株真菌与大花红景天组培苗共培养，或经液体发酵产生的菌丝体或发酵液提取物加入到红景天组培苗的培养基中，能够促进大花红景天组培苗积累红景天苷。该菌在大花红景天资源引种、促进红景天积累红景天苷等方面具有重要的应用前景。

Description

促进大花红景天积累红景天苷的真菌菌株及其应用
技术领域
本发明涉及功能活性微生物，具体涉及桦粉粒座孢真菌菌株，以及该真菌菌株及其发酵产物在促进大花红景天组培苗积累红景天苷中的应用。
背景技术
大花红景天[Rhodiolacrenulata(Hook.f.etThoms.)S.H.Fu]系蔷薇目景天科红景天属的多年生草本植物。主要分布在喜马拉雅山脉地区，生长于海拔超过3000m的高寒、缺氧、强光照、多风的山区，是当地藏族等民族使用上千年的药用植物。随着研究的深入，大花红景天药材被广泛应用于医药、保健品、化妆品等领域，是历版《中国药典》收录的红景天药材的唯一基源植物。
大花红景天的化学成分包括苯烷基苷类如苯乙基苷类、酪醇、红景天苷；苯丙素苷类(络塞维)；酚苷(山奈酚7-O--α-L-鼠李糖苷)；黄酮类(黄酮醇及其形成的苷类化合物，如草质素7-O-α-L-鼠李糖苷)；有机酸类(如没食子酸)、多糖、氨基酸、萜烯类、醇类及脂肪类及硒等无机元素。传统药用中，大花红景天主要用于抗缺氧、抗氧化、抗疲劳等方面的治疗。药理活性研究表明，红景天苷是大花红景天的主要活性成分之一，而其含量的高低作为评价红景天品种优劣、红景天药材真伪的重要指标。
目前，大花红景天药材的供应主要来源于野生资源，但只有多年生的红景天植物的红景天苷含量才能达到药用标准；另一来源是高山地区的引种种植品，但红景天苷含量积累太慢即使是5年以上的药材，也低于野生样品含量；随着组织培养技术的发展，人们尝试在低海拔条件下模拟野生条件，进行红景天的大规模组织培养，但面临的主要问题仍然是红景天苷含量偏低，积累速度太慢等主要问题。因此，严重阻碍了红景天药材的供应。
本发明是在突破传统技术(即依靠改变温度、pH值、光照、CO2浓度、湿度等条件)，利用真菌与植物共生，筛选获得的一株在低海拔条件下，较短的时间内促进红景天积累红景天苷的活性真菌，这种技术具有绿色可控、成本低廉、方法新颖等特点，这株真菌是一种有效促进红景天苷积累的生物诱导因子。
发明内容
本发明在于提供一株能够在较短时间内促进大花红景天组培苗积累主要活性成分红景天苷的生物活性真菌。
本发明提供的一株真菌ZPRS-R-11,经鉴定为桦粉粒座孢(Trimmatostromabetulinum)菌，这株真菌于2015年11月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.11417,保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。
这株真菌的培养特性为：在PDA培养基上培养，菌落为灰色，菌丝呈棉绒状，中央隆起，菌丝发达，呈毛状边缘，无可见分泌物；菌落背面黑褐色，中央深，边缘浅；该菌生长速度偏慢，生长两周的菌落直径为5cm；显微条件下，菌丝呈暗色和淡色二种，淡色菌丝纤细，暗色菌丝粗壮，直径介于1-2μm之间，常存在菌丝束，菌丝内容物清晰可见，菌丝无隔，具分支，不产孢。
本发明提供的一种促进组培大花红景天苗的红景天苷快速积累的方法，将保藏编号为CGMCCNo.11417的菌株活化，接种于PDA固体平板培养基，当菌种生长至大约平板直径的2/3时，用打孔器将菌饼打成直径为5～15mm的菌饼，取3～5块，均匀倒置放于红景天组培苗茎周围的培养基上，该培养基含0.3～1.0mg/LTDZ；0.3～1.0mg/LNAA，进行共培养，15～25天，相比于对照，共生苗的红景天苷含量大大提高。
本发明提供的一种促进组培大花红景天苗的红景天苷快速积累的方法，将保藏编号为CGMCCNo.11417的菌株活化，接种于PDA固体平板培养基，当菌种生长至大约平板直径的2/3时，用打孔器将菌饼打成直径为5～15mm的菌饼，将5～6块菌饼接种于装有200mL已灭菌的PDA液体培养基的三角瓶中，在25℃～30℃、150-200rpm条件下培养7～10天，用纱布过滤，获得菌丝及发酵液培养物；将菌丝在45℃条件下制成菌丝粉末，将发酵液培养物在45℃条件下制成膏状物；按照重量与体积为1～10︰1000(g︰mL)的比例，将菌丝和发酵液分别加入到MS培养基(含0.3-1.0mg/LTDZ；0.3-1.0mg/LNAA)中，接种大花红景天组培苗，培养15～25天，相比于对照，红景天苷含量大大提高。
与现有技术相比，本发明的优点和效果：
本发明采用保藏编号为CGMCCNo.11417的桦粉粒座孢(Trimmatostromabetulinum)真菌及其培养物与红景天苗共培养，可使红景天苷含量快速积累。该方法突破常规手段，采用微生物与植物共培养技术，新颖、方便、可控、发展潜力大，是解决红景天苷含量偏低的良好方法。
具体实施方式
实施例中真菌ZPRS-R-11即为保藏编号为CGMCCNo.11417的桦粉粒座孢(Trimmatostromabetulinum)真菌。
实施例1
将菌株活化，接种于PDA固体平板培养基，当菌种生长至大约平板直径的2/3时，用打孔器将菌饼打成直径为5mm的菌饼，取3块，均匀倒置放于红景天组培苗茎周围的培养基(含0.3mg/LTDZ；0.3mg/LNAA)上，进行共培养，15天后，根据2010年《中国药典》P144页记载的HPLC方法测定红景天苷含量。具体结果见表1。
实施例2
将菌株活化，接种于PDA固体平板培养基，当菌种生长至大约平板直径的2/3时，用打孔器将菌饼打成直径为15mm的菌饼，取5块，均匀倒置放于红景天组培苗茎周围的培养基(含1.0mg/LTDZ；1.0mg/LNAA)上，进行共培养，25天后，根据2010年《中国药典》P144页记载的HPLC方法测定红景天苷含量。具体结果见表1。
实施例3
将5块直径为5mm的菌饼接种于装有200mL已灭菌的PDA液体培养基的三角瓶中，在25℃、150rpm条件下培养7天，用4层纱布过滤，获得菌丝培养物，45℃条件下烘干，研磨成粉末，按照重量与体积为1︰1000(g︰mL)的比例，将菌丝粉末加入到MS培养基(含1.0mg/LTDZ；0.3mg/LNAA)中，接种大花红景天组培苗，培养15天，根据2010年《中国药典》P144页记载的HPLC方法测定红景天苷含量。具体结果见表1。
实施例4
将6块直径为15mm的菌饼接种于装有200mL已灭菌的PDA液体培养基的三角瓶中，在30℃、200rpm条件下培养10天，用4层纱布过滤，获得菌丝培养物，45℃条件下烘干，研磨成粉末，按照重量与体积为10︰1000(g︰mL)的比例，将菌丝粉末加入到MS培养基(含3.0mg/LTDZ；1.0mg/LNAA)中，接种大花红景天组培苗，培养25天，根据2010年《中国药典》P144页记载的HPLC方法测定红景天苷含量。具体结果见表1。
实施例5
将5块直径为5mm的菌饼接种于装有200mL已灭菌的PDA液体培养基的三角瓶中，在25℃、150rpm条件下培养7天，用4层纱布过滤，获得发酵液，45℃条件旋转蒸发成膏状物，按照重量与体积为1︰1000(g︰mL)的比例，将菌丝粉末加入到MS培养基(含1.0mg/LTDZ；0.3mg/LNAA)中，接种大花红景天组培苗，培养15天，根据2010年《中国药典》P144页记载的HPLC方法测定红景天苷含量。具体结果见表1。
实施例6
将6块直径为5mm的菌饼接种于装有200mL已灭菌的PDA液体培养基的三角瓶中，在30℃、200rpm条件下培养10天，用4层纱布过滤，获得发酵液，45℃条件旋转蒸发成膏状物，按照重量与体积为10︰1000(g︰mL)的比例，将菌丝粉末加入到MS培养基(含0.3mg/LTDZ；1.0mg/LNAA)中，接种大花红景天组培苗，培养25天，根据2010年《中国药典》P144页记载的HPLC方法测定红景天苷含量。具体结果见表1。
比较例1
空白对照：采用MS培养基(含0.5mg/LTDZ；0.5mg/LNAA)中，接种大花红景天组培苗，培养20天，根据2010年《中国药典》P144页记载的HPLC方法测定红景天苷含量。具体结果见表1。
比较例2
阴性对照：不接真菌的情况下，将PDA液体培养基45℃条件旋转蒸发成膏状物，按照重量与体积为5︰1000(g︰mL)的比例，将PDA膏状物加入到MS培养基(含0.5mg/LTDZ；0.5mg/LNAA)中，接种大花红景天组培苗，培养20天，根据2010年《中国药典》P144页记载的HPLC方法测定红景天苷含量。具体结果见表1。
表1.真菌促进大花红景天提高红景天苷和酪醇含量
红景天苷(mg/g)
实施例1 2.216
实施例1 2.309
实施例1 2.782
实施例1 2.752
实施例1 1.963
实施例6 2.351
比较例1 1.450
比较例2 1.487

Claims (5)

1.一种桦粉粒座孢(Trimmatostromabetulinum)真菌菌株，其保藏编号为CGMCCNo.11417。
2.如权利要求1所述真菌菌株在促进大花红景天组培苗中红景天苷含量的积累中的应用。
3.一种促进组培大花红景天苗的红景天苷快速积累的方法，步骤包括：将权利要求1所述真菌菌株活化，接种于PDA固体平板培养基，当菌种生长至大约平板直径的2/3时，用打孔器将菌饼打成直径为5～15mm的菌饼，取3～5块，均匀倒置放于红景天组培苗茎周围的培养基上，该培养基含0.3～1.0mg/LTDZ；0.3～1.0mg/LNAA，进行共培养，15～25天。
4.一种促进组培大花红景天苗的红景天苷快速积累的方法，步骤包括：将权利要求1所述真菌菌株活化，接种于PDA固体平板培养基，当菌种生长至大约平板直径的2/3时，用打孔器将菌饼打成直径为5～15mm的菌饼，将5～6块菌饼接种于装有200mL已灭菌的PDA液体培养基的三角瓶中，在25℃～30℃、150-200rpm条件下培养7～10天，用纱布过滤，获得菌丝及发酵液培养物；将菌丝在45℃条件下制成菌丝粉末，按照重量与体积为1～10︰1000(g︰mL)的比例，将菌丝粉末加入到MS培养基中，该培养基含0.3-1.0mg/LTDZ；0.3-1.0mg/LNAA，接种大花红景天组培苗，培养15～25天。
5.一种促进组培大花红景天苗的红景天苷快速积累的方法，步骤包括：将权利要求1所述真菌菌株活化，接种于PDA固体平板培养基，当菌种生长至大约平板直径的2/3时，用打孔器将菌饼打成直径为5～15mm的菌饼，将5～6块菌饼接种于装有200mL已灭菌的PDA液体培养基的三角瓶中，在25℃～30℃、150-200rpm条件下培养7～10天，用纱布过滤，获得菌丝及发酵液培养物；将发酵液培养物在45℃条件下制成膏状物；按照重量与体积为1～10︰1000(g︰mL)的比例，将膏状物分别加入到MS培养基中，该培养基含0.3-1.0mg/LTDZ、0.3-1.0mg/LNAA，接种大花红景天组培苗，培养15～25天。
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