CN109207375A - 一种植物内生真菌菌种的保藏方法 - Google Patents

一种植物内生真菌菌种的保藏方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种植物内生真菌菌种的保藏方法，步骤如下：(1)将普通白纸剪成若干小块，并自制信封，制作土豆培养基；(2)将纸片、信封、土豆培养基、培养皿、镊子于121℃高压灭菌20min；将灭菌好的土豆培养基倒入灭菌的培养皿制成培养基平板；(3)将待保藏的内生真菌菌株，接种于平板，长满后，打取直径0.5‑1cm的菌饼；(4)无菌条件下，将菌饼接种于新的培养基平板中央，将灭菌的纸块摆放于菌饼周围，加盖，25℃条件下培养；(5)待菌丝生长布满纸片后，无菌镊子将布满菌丝的纸片放置于无菌的信封中封口；将信封干燥一周后置于‑20℃条件下，保藏。该方法具有操作简单、成本低、设备要求低、取用方便、成活率高、占用空间小等特点。

Description

一种植物内生真菌菌种的保藏方法
技术领域
本发明涉及微生物保藏，具体属于一种植物内生真菌菌种的保藏方法。
背景技术
植物内生真菌是一类生长于植物组织间隙或者细胞内部，但不引起植物过敏反应的真菌。一般呈无性型生长，大多属于半知菌属真菌。截至目前，在所有被研究过的植物中，都发现了内生真菌的存在，这大大的拓展了人们对真菌的种类和数量的预估，也加深了人们对自然界生命形式的认识。由于生物功能和代谢的多样性，内生真菌为药物的新药发现、生物防控病害、促进植物生长发育、调控药用植物代谢产物积累等方面提供了越来越多的选择机会和途径。
菌种保藏是内生真菌资源开发和研究的重要环节，是促进内生真菌可持续应用和研究的保证。保藏方法都是通过某种途径降低真菌新陈代谢的速度，最大限度的延长保藏时间。一个良好的保藏方法是在保证菌种的纯度、成活率和稳定性基础上，具有成本低、操作简单等优点。目前，内生真菌的保藏多采用传统的真菌保藏法，主要包括：(1)试管斜面法，此法是将试管菌保藏于4℃，3个月一次的菌种转接。此方法适用于常用菌种的日常工作，但容易污染、费工时、占空间大；(2)以石蜡或矿物油封存斜面、蒸馏水悬浮孢子、沙土，硅胶等为基质的保藏。这些方法适合十年左右的菌种保藏，主要存在操作复杂、占空间大等问题；(3)液氮保藏、冷冻干燥保藏、超低温冰箱保藏等优点是能对菌种进行50年以上的长期保藏，但是存在耗能大、设备要求高，连续使用过程中容易出现设备故障，从而导致菌种因反复冻融而死亡的情况。
目前的保藏方法，都存在着一定的缺点，并不适合对所有内生真菌的保藏。
发明内容
本发明的目的在于提供一种占用空间小、操作简单、对设备要求低、取用方便、保藏时间可长可短的植物内生真菌菌种的保藏方法。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种植物内生真菌菌种的保藏方法，步骤如下：
(1)将普通白纸(如A4打印纸)剪成1cm×1～3cm大小若干块，放入干净培养皿，报纸包裹；自制10cm×10～20cm尺寸的信封，折叠口部；制作1L土豆培养基：取土豆块200g煮熟，粉碎，过滤，在滤汁中，加入20g葡萄糖，18g琼脂，加去离子水至1L；
(2)将上述装有纸片的培养皿、信封、土豆培养基，培养皿、镊子等用具于121℃高压灭菌20min；将灭菌好的土豆培养基倒入灭菌的培养皿制成培养基平板，备用；
(3)将待保藏的植物内生真菌菌株，接种于培养基平板，长满后，打取直径0.5-1cm的菌饼，备用；
(4)无菌条件下，将直径0.5-1cm的菌饼接种于新的培养基平板中央，将灭菌的纸块摆放于菌饼周围，盖好培养皿，放在25℃条件下培养；
(5)待菌丝生长布满纸片后，无菌镊子将布满菌丝的纸片放置于无菌的信封中，封口，记录菌名，日期等；将信封放置于通风橱或者干燥器中干燥一周；之后，将信封置于-20℃条件下，保藏。
所述植物内生真菌为保藏编号为CGMCC No.9347的红松头霉菌(Phialocephalafortinii)或编号为CGMCC No.11417的桦粉粒座孢真菌(Trimmatostroma botulinum)。
保藏号CGMCC No.9347菌种的保藏单位：中国微生物菌种管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏时间：2014年7月10日。该菌种已在中国专利201410468041.3中公开。
保藏号CGMCC No.11417菌种的保藏单位：中国微生物菌种管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏时间：2015年11月6日。该菌种已在中国专利201610011872.7中公开。
与现有技术相比，本发明的有益效果：
本发明通过将植物内生真菌附着生长在普通白纸上、干燥后保藏于-20℃，14天、1个月、6个月、1年、2年时，成活率均可达100％，生理生化及基因检测无异常。该方法既适于长期也适于短期保藏。该方法具有操作简单、成本低、设备要求低、取用方便、成活率高、占用空间小等优势。
具体实施方式
实施例1：编号为CGMCC No.9347内生真菌鉴定为红松头霉菌(Phialocephalafortinii)的保藏：
(1)将A4打印纸剪成1cm×1cm大小若干块，放入干净的培养皿，报纸包好；自制10cm×10cm尺寸的信封，折叠口部；制作土豆培养基(PDA)(1L的PDA配方：200g土豆块，在煮熟的滤汁中，加入20g葡萄糖，18g琼脂，加去离子水至1L)；
(2)将上述装有纸片的培养皿、信封、土豆培养基、培养皿、镊子等用具于121℃高压灭菌20min；将灭菌好的PDA培养基倒入灭菌的培养皿，备用；
(3)将纯化的红松头霉菌菌株接种于新的培养基平板，长满后，打取直径0.5cm的菌饼，备用；
(4)无菌条件下，将0.5cm的菌饼接种于新的PDA培养基平板，将无菌的纸片摆放于菌饼周围，盖好。放在25℃条件下培养；
(5)当菌丝生长布满纸片后，用镊子将所有纸片取下，放置于无菌的信封中，封口，写菌名，日期等；将信封放置于通风橱或者干燥器中，一周之后，放-20℃冰箱，保藏。
(6)14天、1个月、6个月、1年、2年时，将信封中的纸片取出，长有真菌菌丝的一面朝下，放置于PDA培养基平板上，放25℃培养。同样地操作30个培养基平皿，计算成活率，成活率分别均达100％。
实施例2：编号为CGMCC No.11417的桦粉粒座孢真菌(Trimmatostromabotulinum)的保藏：
(1)将A4打印纸剪成1cm×3cm大小的纸块若干块，放入干净的培养皿，报纸包好；自制10cm×20cm尺寸的信封，折叠口部；制作土豆培养基(PDA)(1L的PDA配方：200g土豆块，在煮熟的滤汁中，加入20g葡萄糖，18g琼脂，加去离子水至1L)；
(2)将上述装有纸片培养皿、信封、土豆培养基、培养皿、镊子等相关用具于121℃高压灭菌20min；将灭菌好的PDA培养基倒入灭菌培养皿，备用；
(3)将纯化的真菌菌株，接种新的培养基平板，当菌丝长满时，打取直径1cm的菌饼，备用；
(4)无菌条件下，将1cm的菌饼接种于新的PDA培养基平板，将无菌纸片摆放于菌饼周围，盖好。放在25℃条件下培养；
(5)菌丝生长布满纸片后，无菌条件下，将纸片取下，放置于无菌信封，封口，写菌名，日期等；将信封放置于通风橱或者干燥器，一周之后，放-20℃，保藏。
(6)14天、1个月、6个月、1年、2年时，无菌条件下，将白纸附着菌丝的一面倒置于培养基平板上，同样的操作，培养30个平皿，计算成活率，成活率均达到100％，生理生化及基因检测无异常。
比较例1：编号为CGMCC No.9347内生真菌鉴定为红松头霉菌(Phialocephalafortinii)的10％甘油的超低温保藏：
(1)制作土豆培养基(PDA)(1L的PDA配方：200g土豆块，在煮熟的滤汁中，加入20g葡萄糖，18g琼脂，加去离子水至1L)，121℃高压灭菌20min；将灭菌好的PDA培养基倒入灭菌的培养皿，备用；
(2)取1.5mL的10％甘油-水溶液至2mL的冻存管，121℃高压灭菌20min；
(3)将纯化的真菌菌株接种于PDA培养基上，25℃条件下长满时，用接种铲将菌块接入上述处理的冻存管中；
(4)将冻存管在4℃和-20℃条件下分别放置一周，之后放入-80℃保藏。分别于14天、1个月、6个月、1年、2年的时候，于室温条件下解冻。将菌块挑出，放PDA培养基上培养30皿。14天、1个月、6个月、1年、2年的成活率分别为100％，100％，100％，100％，96.67％。
比较例2：编号为CGMCC No.11417的桦粉粒座孢真菌(Trimmatostromabotulinum)的液体石蜡保藏：
(1)制作土豆培养基(PDA)(1L的PDA配方：200g土豆块，在煮好后的滤汁中，加入20g葡萄糖，18g琼脂，加去离子水至1L)，121℃高压灭菌20min；将灭菌好的PDA培养基倒入已高温灭菌的试管1/3处，制作斜面。
(2)将纯化的真菌菌株接种于试管斜面培养基，25℃条件下培养。
(3)准备液体石蜡，在121℃灭菌20min。
(4)斜面菌长满时，将灭菌的液体石蜡倒入试管，完全覆盖斜面菌，密封，将试管放置于试管架上，放4℃冰箱保藏。
(5)分别于14天、1个月、6个月、1年、2年时，将菌块挑出，置于PDA培养基平板，25℃条件下，培养30皿。14天、1个月、6个月、1年、2年的成活率均为100％。
优缺点比较如表1：
表1.内生真菌四种保藏方法的优缺点比较

Claims (2)

1.一种植物内生真菌菌种的保藏方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)将普通白纸剪成1cm×1～3cm大小若干块，放入干净培养皿，用报纸包裹；自制10cm×10～20cm尺寸的信封，折叠口部；制作1L土豆培养基：取土豆块200g煮熟，粉碎，过滤，在滤汁中，加入20g葡萄糖，18g琼脂，加去离子水至1L；
(2)将上述装有纸片的培养皿、信封、土豆培养基，培养皿、镊子置于121℃高压灭菌20min；将灭菌好的土豆培养基倒入灭菌的培养皿制成培养基平板，备用；
(3)将待保藏的植物内生真菌菌株，接种于培养基平板，长满后，打取直径0.5-1cm的菌饼，备用；
(4)无菌条件下，将直径0.5-1cm的菌饼接种于新的培养基平板中央，将灭菌的纸块摆放于菌饼周围，盖好培养皿，放在25℃条件下培养；
(5)待菌丝生长布满纸片后，用无菌镊子将布满菌丝的纸片放置于无菌的信封中，封口，记录菌名，日期；将信封放置于通风橱或者干燥器中干燥一周；之后，将信封置于-20℃条件下，保藏。
2.如权利要求1所述的一种植物内生真菌菌种的保藏方法，其特征在于所述植物内生真菌是保藏编号为CGMCC No.9347或编号为CGMCC No.11417的真菌。
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