CN101497868B - 一种改良的mrs液体培养基 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种改良MRS液体培养基,由下列组分组成:胰蛋白胨10.0g、牛肉膏10.0g、酵母膏5.0g、柠檬酸钠2.0g、葡萄糖20.0g、KH2PO42.0g、乙酸钠5g、吐温-80 1.0mL、七水硫酸镁0.58g、硫酸锰0.25g、浓度为0.25~1.0mol/L的KH2PO4缓冲液1000mL,用0.1mol/L的NaOH调节pH至6.5,121℃,灭菌25min,得到所述改良MRS液体培养基。利用上述改良MRS液体培养基能够克服了乳酸对亚硝酸盐降解的干扰,方便的从泡菜液中筛选出对60h发酵液中亚硝酸盐降解率超过90%的乳酸菌菌株。
Description
技术领域
本发明涉及一种改良的MRS液体培养基,以及利用改良的MRS液体培养基从泡菜液中筛选高效降解亚硝酸盐乳酸菌的方法。
背景技术
在大量施用含氮化肥、除草剂,且土壤中缺乏钼元素或干旱的情况下,许多蔬菜会从土壤中富集硝酸盐。在合适的条件下,微生物会将硝酸盐还原为亚硝酸盐,亚硝酸盐对人体有害,成人摄入 即可能引起中毒。此外,亚硝酸盐也是致癌物的前体物质,与次级胺类化合物反应可生成强致癌物亚硝胺。
我国大部分地区的食品亚硝酸盐污染已相当严重,为了排除腌制、腊制食品中亚硝酸盐的危害,在生产和储存时应尽可能的用能降解亚硝酸盐的益生菌降低亚硝酸盐的危害。诸多研究表明,自然发酵泡菜在腌制过程中会出现亚硝峰,且亚硝酸盐的含量远高于国家标准。如果利用乳酸菌纯种接种制作泡菜,则可使泡菜中亚硝酸盐的含量大幅降低,且亚硝峰出现较早,峰值较低,还能缩短泡菜发酵成熟的时间,缩短了生产周期。
根据乳酸菌产生乳酸的特性,通常采用含有碳酸钙的MRS培养基平板筛选出乳酸菌(所谓MRS培养基是用来培养乳酸菌的培养基),其中包含了能够降解亚硝酸盐和不能够降解亚硝酸盐的多种菌株。由于乳酸对亚硝酸盐也具有降解作用,对筛选工作造成较大影响,所以使用一般的MRS培养基分离高效降解亚硝酸盐乳酸菌存在缺陷。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种改良组分的MRS液体培养基以及利用这种改良的改良MRS液体培养基从泡菜液中筛选高效降解亚硝酸盐乳酸菌的方法。
本发明技术方案:一种改良MRS液体培养基,由下列组分组成:胰蛋白胨10.0g、牛肉膏10.0g、酵母膏5.0g、柠檬酸铵2.0g、葡萄糖20.0g、KH2PO4 2.0g、乙酸钠5g、吐温-80 1.0mL、七水硫酸镁0.58g、硫酸锰0.25g、浓度为0.25~1.0mol/L的KH2PO4缓冲液1000mL,用0.1mol/L的NaOH调节pH至6.5,121℃,灭菌25min,得到所述改良MRS液体培养基。
一种利用上述改良MRS液体培养基从泡菜液中筛选高效降解亚硝酸盐乳酸菌的方法,包括下列步骤:
a.取泡菜液1.0mL稀释108倍,然后取稀释液0.1-0.5mL于培养皿中并加入20ml、55℃的MRS固体培养基,摇匀,在30℃的培养箱中厌氧培养72h,挑取各培养基中溶钙圈较大的单菌落,进一步做划线分离,每一步纯化都镜检观察,直到菌体一致后将单菌株划线于MRS固体培养基中,培养72h后于4℃保存备用,其中所述MRS固体培养基组分为:胰蛋白陈10.0g、牛肉膏10.0g、酵母膏5.0g、柠檬酸铵2.0g、葡萄糖20.0g、KH2PO4 2.0g、乙酸钠5.0g、吐温-80 1.0mL、七水硫酸镁0.58g、硫酸锰0.25g,CaCO3 15.0g、水1000mL,调节pH至6.5,121℃灭菌25min;
b.将上述分离到的纯菌株,用接种环接种于改良MRS液体培养基中,在30℃下培养,后取种龄为18h的种子,按1‰-15‰接种量接种于含100-400ug/mL亚硝酸盐的改良MRS液体培养基中,30℃厌氧培养60h,对亚硝酸盐残留量每隔12h进行检测,计算各菌株对亚硝酸盐的降解效果,最后筛选出对60h发酵液中亚硝酸盐降解率超过90%的乳酸菌菌株,其中所述改良MRS液体培养基组分为:胰蛋白胨10.0g、牛肉膏10.0g、酵母膏5.0g、柠檬酸铵2.0g、葡萄糖20.0g、KH2PO4 2.0g、乙酸钠5g、吐温-80 1.0mL、七水硫酸镁0.58g、硫酸锰0.25g、浓度为0.25~1.0mol/L的KH2PO4缓冲液1000mL,用0.1mol/L的NaOH调节pH至6.5,121℃,灭菌25min。
本发明的有益效果:本发明通过改良的MRS液体培养基克服了乳酸对亚硝酸盐降解的干扰,可以方便的从泡菜液中筛选出对60h发酵液中亚硝酸盐降解率超过90%的乳酸菌菌株,对S-2,K-2,H-3三菌株的初步鉴定表明:
S-2菌落白色,圆形,较小,菌体短杆状,革兰氏阳性,接触酶阴性,硫化氢阴性,葡萄糖产酸不产气,兼性厌氧,pH4.5条件下生长;
K-2菌落白色,圆形,较小,菌体长杆状,革兰氏阳性,接触酶阴性,硫化氢阴性,葡萄糖产酸不产气,兼性厌氧,pH4.5条件下生长;
H-3菌体白色,圆形,微小,球状或椭圆形,革兰氏阳性,接触酶阴性,硫化氢阴性,葡萄糖产酸不产气,兼性厌氧,pH4.5、pH 9.6条件下生长,18%NaCl条件下生长。
根据特征,参考《乳酸细菌分类鉴定及实验方法》中乳酸菌分类检索表,初步鉴定结果为:S-2和K-2属于乳杆菌属,H-3属于片球菌属。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明进一步详细描述,一种改良MRS液体培养基,由下列组分组成:胰蛋白胨10.0g、牛肉膏10.0g、酵母膏5.0g、柠檬酸铵2.0g、葡萄糖20.0g、KH2PO4 2.0g、乙酸钠5g、吐温-80 1.0mL、七水硫酸镁0.58g、硫酸锰0.25g、浓度为0.25~1.0mol/L的KH2PO4缓冲液1000mL,用0.1mol/L的NaOH调节pH至6.5,121℃,灭菌25min,得到所述改良MRS液体培养基。
利用上述改良MRS液体培养基从泡菜液中筛选高效降解亚硝酸盐乳酸菌的方法,包括下列步骤:
a.取泡菜液1.0mL加入到9.0mL无菌水中混匀,此即为稀释10倍,取10倍稀释样液0.5mL,再加入4.5mL的无菌水中混匀,此即为稀释102,依此法逐步将泡菜原液稀释108倍,然后取稀释液0.1-0.5mL于培养皿中加入20ml、55℃的MRS固体培养基,摇匀,在30℃的培养箱中厌氧培养72h,挑取各培养基中溶钙圈较大的单菌落,进一步做划线分离,每一步纯化都 镜检观察,直到菌体一致后将单菌株划线于MRS固体培养基中,培养72h后于4℃保存备用,其中所述MRS固体培养基组分为:胰蛋白陈10.0g、牛肉膏10.0g、酵母膏5.0g、柠檬酸铵2.0g、葡萄糖20.0g、KH2PO4 2.0g、乙酸钠5.0g、吐温-80 1.0mL、七水硫酸镁0.58g、硫酸锰0.25g,CaCO3 15.0g、水1000mL,调节pH至6.5,121℃灭菌25min;
b.将上述分离到的纯菌株,用接种环接种于改良MRS液体培养基中,在30℃下培养,后取种龄为18h的种子,按1‰-15‰接种量接种于含100-400ug/mL亚硝酸盐的改良MRS液体培养基中,30℃厌氧培养60h,对亚硝酸盐残留量每隔12h进行检测,计算各菌株对亚硝酸盐的降解效果,最后筛选出对60h发酵液中亚硝酸盐降解率超过90%的乳酸菌菌株,其中所述改良MRS液体培养基组分为:胰蛋白胨10.0g、牛肉膏10.0g、酵母膏5.0g、柠檬酸铵2.0g、葡萄糖20.0g、KH2PO4 2.0g、乙酸钠5g、吐温-80 1.0mL、七水硫酸镁0.58g、硫酸锰0.25g、浓度为0.25~1.0mol/L的KH2PO4缓冲液1000mL,用0.1mol/L的NaOH调节pH至6.5,121,灭菌25min。
实施例1
取泡菜液1.0mL加入到9.0mL无菌水中混匀,此即为稀释10倍。取10倍稀释样液0.5mL,再加入4.5mL的无菌水中混匀,此即为稀释102倍。依此法逐步将泡菜原液稀释为108倍。然后,从稀释后的泡菜液中取0.1mL于培养皿中,后加入55℃左右的常用的MRS固体培养基约20ml,摇匀,于30℃培养箱中厌氧培养72h。挑取各培养基中溶钙圈较大的单菌落,做进一步划线分离,同时每一步需要镜检观察,直到菌体一致为止。最后将单菌株划线于MRS固体培养基中,培养72h,将上述分离到的纯菌株,用接种环挑取一满环接种于MRS液体培养基中,于30℃条件下培养,后取种龄为18h的种子,按1‰-15‰接种量接种于含120-400ug/mL亚硝酸盐的改良MRS液体培养基中,30℃,厌氧培养60h,对亚硝酸盐残留量每隔12h进行检测。
(MRS培养基成分为:胰蛋白陈10g、牛肉膏10g、酵母膏5g、柠檬酸铵2.0g、葡萄糖20g、KH2PO4 2g、乙酸钠5g、吐温80 1mL、七水硫酸镁 0.58g、CaCO3 15g、硫酸锰0.25g,水1000mL,pH 6.5,121℃25min灭菌。)
改良的MRS液体培养基成分为:胰蛋白胨10g、牛肉膏10g、酵母膏5g、柠檬酸铵2.0g、葡萄糖20g、KH2PO4 2g、乙酸钠5g、吐温80 1mL、七水硫酸镁0.58g、硫酸锰0.25g,0.25 1.0mol/L KH2PO4缓冲液1000mL,用0.1mol/LNaOH调节pH至6.5,121℃,25min灭菌。
实施例2
取泡菜液1.0mL加入到9.0mL无菌水中混匀,此即为稀释10倍。取10倍稀释样液0.5mL,再加入4.5mL的无菌水中混匀,此即为稀释102倍。依此法逐步将泡菜原液稀释为108倍。然后,从稀释后的泡菜液中取0.1mL于培养皿中,后加入55℃左右的常用的MRS固体培养基约20ml,摇匀,于30℃培养箱中厌氧培养72h。挑取各培养基中溶钙圈较大的单菌落,做进一步划线分离,同时每一步需要镜检观察,直到菌体一致为止。最后将单菌株划线于MRS固体培养基中,培养72h。将上述分离到的纯菌株,用接种环挑取一满环接种于MRS液体培养基中,于30℃条件下培养,后取种龄为18h的种子,按1‰-15‰接种量接种于含120-400ug/mL亚硝酸盐的改良MRS液体培养基中,30℃,厌氧培养60h,对亚硝酸盐残留量每隔12h进行检测。
改良的MRS液体培养基成分为:胰蛋白陈10g、牛肉膏10g、酵母膏5g、柠檬酸铵2.0g、葡萄糖20g、KH2PO4 2g、乙酸钠5g、吐温80 1mL、七水硫酸镁0.58g、硫酸锰0.25g,0.25 1.0mol/L KH2PO4缓冲液1000mL,用0.1mol/LNaOH调节pH至6.5,121℃,25min灭菌。
实施例3
取泡菜液1.0mL加入到9.0mL无菌水中混匀,此即为稀释10倍。取10倍稀释样液0.5mL,再加入4.5mL的无菌水中混匀,此即为稀释102倍。依此法逐步将泡菜原液稀释为108倍。然后,从稀释后的泡菜液中取0.1mL于培养皿中,后加入55℃左右的常用的MRS固体培养基约20ml,摇匀,于 30℃培养箱中厌氧培养72h。挑取各培养基中溶钙圈较大的单菌落,做进一步划线分离,同时每一步需要镜检观察,直到菌体一致为止。最后将单菌株划线于MRS固体培养基中,培养72h,将上述分离到的纯菌株,用接种环挑取一满环接种于MRS液体培养基中,于30℃条件下培养,后取种龄为18h的种子,按1‰-15‰接种量接种于含120-400ug/mL亚硝酸盐的改良MRS液体培养基中,30℃厌氧培养60h,对亚硝酸盐残留量每隔12h进行检测。各菌株对亚硝酸盐的降解试验结果见表1。
表1.各菌株对亚硝酸盐的降解试验结果表
由表1结果可看出,由于本发明中采用改良后的MRS培养基对降解亚硝酸盐乳酸菌进行筛选,排除了乳酸菌产酸对亚硝酸盐降解的干扰,从而较为容易分离到具有较高降解亚硝酸盐能力的优良菌株。
对上述降解率超过90%菌株S-2,K-2,H-3进行鉴定,三菌株的特征为:
S-2菌落白色,圆形,较小,菌体短杆状,革兰氏阳性,接触酶阴性,硫化氢阴性,葡萄糖产酸不产气,兼性厌氧,pH4.5条件下生长;
K-2菌落白色,圆形,较小,菌体长杆状,革兰氏阳性,接触酶阴性,硫化氢阴性,葡萄糖产酸不产气,兼性厌氧,pH4.5条件下生长;
H-3菌体白色,圆形,微小,球状或椭圆形,革兰氏阳性,接触酶阴性,硫化氢阴性,葡萄糖产酸不产气,兼性厌氧,pH4.5、pH 9.6条件下生长,18%NaCl条件下生长。
就以上特征,参考《乳酸细菌分类鉴定及实验方法》中乳酸菌分类检索表,初步鉴定结果为:S-2和K-2属于乳杆菌属,H3属于片球菌属。
应用实施例(高效降解亚硝酸盐乳酸菌在泡菜发酵中的应用)
将S-2,K-2,H-3接于在MRS液,于30℃恒温培养3代,每代培养时间为16-20h时,从培养箱取出,置于4℃冰箱中备用。
取新鲜大白菜1kg,清洗,沥干水分,后切分成宽约1.5cm,长约3cm的长方形。
取4个大小为500mL的三角瓶,向各瓶中加入350mL沸水,冷却至室温。并将其编号为A、B(代表自然发酵组),C,D(代表接种发酵组)
将切分好的白菜条装入各瓶中,每瓶的装菜量为150g。
将S-2,K-2,H-3接于在MRS液,按上述培养方法于30℃恒温培养3代。取出,置于4℃冰箱中备用。
取4个大小为500mL的三角瓶,编号为A、B(代表自然发酵组),C,D,(代表接种发酵组),向各瓶中加入250-350mL灭菌蒸馏水,冷却至室温备用,取新鲜大白菜1kg,清洗,沥干水分后切分成宽约1.5cm,长约3cm的长方形。分别放入三角瓶。然后按1%-15%接种量将上述冰箱保存的S-2,K-2,H-3菌株以1∶1∶1的比例接入C、D瓶中;而A,B为不接种。于20℃-30℃下培养发酵,每隔1d检测亚硝酸盐含量,结果见表2。(注:上述操作均在无菌操作下进行)
表2.自然发酵与接种发酵泡菜中亚硝酸盐含量对比表(单位ug/mL)
在自然发酵泡菜中亚硝酸盐含量在第3天达到最高,为35.72ug/mL,亚硝峰在第3天出现,培养5d后,亚硝酸盐含量仍为8.81ug/mL;接种发酵泡菜中亚硝酸盐含量在第2天出现最高值,为10.01ug/mL,第五天降低到1.64ug/mL。低于国家规定的4ug/mL标准。从亚硝酸盐含量的角度来说,缩短了泡菜安全发酵的周期。
所述内容仅为本发明构思下的基本说明,而依据本发明的技术方案所作的任何等效变换,均应属于本发明的保护范围。
Claims (1)
1.一种改良MRS液体培养基,由下列组分组成:胰蛋白胨10.0g、牛肉膏10.0g、酵母膏5.0g、柠檬酸铵2.0g、葡萄糖20.0g、KH2PO42.0g、乙酸钠5g、吐温-801.0mL、七水硫酸镁0.58g、硫酸锰0.25g、浓度为0.25~1.0mol/L的KH2PO4缓冲液1000mL,用0.1mol/L的NaOH调节pH至6.5,121℃,灭菌25min,得到所述改良MRS液体培养基。
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