CN104946723B - 一种用于乳酸菌耐药性测定的通用培养基及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于乳酸菌耐药性测定的通用培养基，其中每1000mL的培养基包括：蛋白胨7～15g，牛肉浸粉3～7g，酵母粉2～4g，葡萄糖15～25g，抗坏血酸棕榈酸酯0.8～1.2g，维生素B6为2.6mg，半胱氨酸盐酸盐0.5～1g，泊洛沙姆1.0～2.0g，硫酸镁0.1～0.3g，MnSO₄.4H₂O 0.05g，β‑甘油磷酸二钠15～25g，琼脂15～20g，余量为水，pH为6.2±0.2。本发明的培养基可用于乳酸菌中三种不同类型菌种同时生长，培养基的成分对各类试验抗生素不会产生影响，大大降低了检测成本，并且减少操作步骤，降低工作人员的劳动强度。

Description

一种用于乳酸菌耐药性测定的通用培养基及其应用

技术领域

本发明涉及一种用于细菌耐药性测定的培养基，尤其涉及一种用于乳酸菌耐药性测定的通用培养基。

背景技术

乳酸菌(lactic acid bacteria)是一类可发酵糖主要产生大量乳酸的细菌的通称，主要为乳杆菌属(Lactobacillus)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)和链球菌属(Streptococcus)。乳酸菌为益生菌，在食品和医药工业中占据越来越重要的地位，然而，随着抗生素的广泛使用，使乳酸菌对多种类型的抗生素产生不同程度的耐药性(健康人体及保健品中乳酸菌和双歧杆菌的抗药性分析，中国食品学报，2009年，第9卷第6期)，另一方面，由于目前在构建乳酸菌的基因克隆与表达系统大都采用以抗生素抗性基因作为选择标记，存在抗药性基因转移和扩散的可能性，使得乳酸菌的生物安全性问题引起广泛重视。因此，测定乳酸菌的耐药性对于保证其安全性乃至保障人类健康具有重要现实意义。

目前医学领域测定致病菌，对不同抗生素的敏感性，已形成一套完善的实验方法，如美国国家临床实验室标准化委员会(NCCLS)，推荐的“抗菌药物敏感性试验执行标准”(Performance standards for antimicrobial susceptibility testing)。我国医学微生物实验室采用这一标准，目的在于通过实验筛选出针对目标致病菌敏感的抗生素种类及最小抑制量，从而用于治疗。然而，对于细菌耐药性试验，由于没有相应的方法标准，通常情况下参考上述标准，其中的药敏纸片琼脂扩散法(K-B法)，就是耐药性试验常采用方法之一。但就乳酸菌而言，由于乳酸菌对营养因子特殊的需求，该标准所推荐的培养基，不能满足对不同菌属的乳酸菌同时测定耐药性的需求。

乳酸菌主要包括乳杆菌属、双歧杆菌属和链球菌属，其中乳杆菌属、双歧杆菌属需在厌氧环境下生长，而链球菌则在需氧环境下生长，除此之外，这三个不同属的细菌，对营养的需求也不同。目前对乳酸杆菌、双歧杆菌和嗜热链球菌，这三种菌属的培养通常使用不同的培养基，如用于乳酸杆菌培养的乳酸杆菌琼脂培养基(GB 5413.14、GB 5413.15、GB5413.16、GB 5413.17、GB 5413.19)、MRS培养基(GB 4789.35)等；用于双歧杆菌培养的双歧杆菌培养基(GB 4789.34)、改良MRS(添加了抑制乳杆菌属生长的莫匹罗星锂盐，GB4789.35)；用于嗜热链球菌培养的MC培养基(GB 4789.35)、M17培养基等，换言之，目前的除能同时支持乳酸杆菌和双歧杆菌生长的培养基外，尚没有能够支持包括乳酸杆菌、双歧杆菌和嗜热链球菌三种菌生长的通用培养基。

对乳酸菌的耐药性测定只能使用不同培养基，乳杆菌属、双歧杆菌属耐药性测定以MRS培养基为主，对链球菌属则采用M17培养基或者其他培养基，如此一来，不仅给实验人员带来不便，而且不便于室内和室间结果比较，测定方法难以统一规范，并且检测成本比较高。如果能有一种培养基用于乳酸菌中不同属细菌耐药性测定，不仅提高检测效率，还将为耐药性测定结果的准确性提供了保证。

综上所述，目前使用没有一种培养基适用于三种不同类型乳酸菌耐药性测定，其技术瓶颈在于：如何选择和优化出一组促生长因子，以组合成一种可以满足三种不同类型乳酸菌较好生长的培养基，同时，所添加成分不能对各类试验抗生素产生影响，造成结果偏差。

发明内容

本发明的一个目的在于提供一种用于乳酸菌耐药性测定的通用培养基。已解决现有技术中没有能同时用于乳杆菌属、双歧杆菌属和链球菌属三种菌属的乳酸菌耐药性测试的培养基。

一种用于乳酸菌耐药性测定的通用培养基，其中，每1000mL的培养基包括：蛋白胨7～15g，牛肉浸粉3～7g，酵母粉2～4g，葡萄糖15～25g，抗坏血酸棕榈酸酯0.8～1.2g，维生素B6为2.6mg，半胱氨酸盐酸盐0.5～1g，泊洛沙姆1.0～2.0g，硫酸镁0.1～0.3g，MnSO₄.4H₂O0.05g，β-甘油磷酸二钠15～25g，琼脂15～20g，余量为水，pH为6.2±0.2。

在一些实施例中，优选为，所述蛋白胨为胰酪胨、大豆胨、细菌蛋白胨或胰酪胨和大豆胨的混合物。

在一些实施例中，优选为，所述维生素B6为吡哆醇、盐酸吡哆醛或吡哆胺。

在一些实施例中，优选为，所述泊洛沙姆为泊洛沙姆188。

在一些实施例中，优选为，所述蛋白胨为胰酪胨5g和大豆胨5g；所述牛肉浸粉为5g，所述酵母粉为3g，所述葡萄糖为20g，所述抗坏血酸棕榈酸酯为1g，所述维生素B6为盐酸吡哆醛，所述半胱氨酸盐酸盐为0.5g，所述泊洛沙姆为1.2g，所述硫酸镁为0.2g，所述β-甘油磷酸二钠为19g，所述琼脂为13g。

本发明的另一个目的在于提供一种使用上述通用培养基测定乳酸菌对抗生素耐药性的方法。具体如下：

一种用于测定乳酸菌对抗生素耐药性实验的方法，包括如下步骤：

1)平板制备：称取上述培养基的各组分，加入到去离子水中，搅拌，加热至完全溶解，调节pH至6.2±0.2，高压灭菌后，待冷却至45℃～55℃，无菌操作倒平板，备用；

2)受试菌和标准对照菌的活化与培养：受试菌与标准对照菌分别在各自最适温度下活化2～3代，分别以0.5～1.5％接种量接种液体培养基，在最适温度下厌氧或好氧培养12h左右，采用标准比浊溶液测定菌液的OD值，使菌液浓度在1.5×10⁸～3.0×10⁸cfu/mL范围；

3)接种：分别吸取受试菌与标准对照菌0.1mL，接种于所述步骤1制备的培养基上，涂布均匀，放置7～15min，使培养基表面干燥；

4)药敏纸片贴放及培养：将标准药敏纸片贴放所述步骤1制备的固体培养基表面，每皿4片，纸片外沿距平皿外沿15～20mm，纸片间距20mm，然后将平皿倒置在培养箱或充N₂的厌氧罐中，于最适温度下培养18～20h，对生长缓慢者培养48h；

5)结果分析：测量抑菌圈宽度并判断受试菌对抗生素的敏感性测量受试菌与标准对照菌的抑菌圈宽度，判断受试菌抗生素的敏感性结果。

如上所述的方法，优选地，所述受试菌包括乳杆菌、双歧杆菌和/或嗜热链球菌。

如上所述的方法，优选地，所述标准对照菌为金黄色葡萄球菌。

如上所述的方法，优选地，所述最适合温度为36℃±1℃。

如上所述的方法，优选地，所述判断的标准为：当受试菌的抑菌圈宽度大于或等于标准对照菌的抑菌圈宽度，或者前者小于后者，但两者之差小于3mm判为敏感；当受试菌的抑菌圈宽度大于3mm，但小于标准对照的抑菌圈宽度，且二者之差大于3mm为中度敏感；当抑菌圈的宽度小于或等于3mm，为耐药。

本发明的培养基可用于乳酸菌中三种不同类型菌种同时生长，培养基的成分对各类试验抗生素不会产生影响，采用本发明的培养基，通过各类抗生素对乳酸菌耐药性测试，可作为乳酸菌耐药性测定的通用培养基使用，大大降低了检测成本，并且减少操作步骤，降低工作人员的劳动强度。

本发明的培养基用于乳酸菌的耐药性测定，具有支持乳酸菌生长的包容性强、灵敏度高、易于操作、结果判断简单等优点，适合医学临床微生物检验、食品安全微生物检测、环境保护等领域，有广泛的应用前景，国内外没有同类产品。

本发明培养基与现有培养基相比，具有较强的通用性和专用性，更易于用于测定乳酸菌的耐药性。

具体实施方式

本发明在培养基中添加了蛋白胨为乳酸菌的生长提供充足氮源，牛肉浸出粉补充蛋白胨的功效，酵母粉为乳酸菌生长提供了促进生长和平衡代谢的B族维生素及微量元素，葡萄糖为细菌生长提供碳源。

本发明在培养基中添加了抗坏血酸棕榈酸酯，为刺激乳酸杆菌生长提供了Vc。

本发明在培养基中添加了泊洛沙姆(商品名普流尼克)，起增溶作用及利于代谢物质传输，优选泊洛沙姆188。

本发明在配置培养基时，pH为6.2±0.2是指pH的范围在6.0到6.4之间均可实现本发明。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均无常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1

使用本发明研制的培养基，对乳酸菌进行培养，具体方法如下：

1)固体平板制备：按照配方为每1000mL培养基中包含胰酪胨5g，大豆胨5g，牛肉浸粉5g，酵母粉3g，葡萄糖20g，抗坏血酸棕榈酸酯1g，盐酸吡哆醛2.6mg，半胱氨酸盐酸盐0.5g，泊洛沙姆1881.2g，硫酸镁0.2g，MnSO₄.4H₂O 0.05g，β-甘油磷酸二钠19g，琼脂13g，余量为水，pH为6.2±0.2制备培养基。分别按照配方中各组分名称及含量称取，将上述培养基的各组分，加入到去离子水中，搅拌，加热至完全溶解，调节pH至6.2±0.2，高压灭菌后，待冷却至45℃～55℃，无菌操作，倾注平板，使培养基的厚度为4mm～5mm，待冷至室温，完全凝固后即可使用；

2)菌种的活化与培养：受试菌(包括德氏乳杆菌保加利亚亚种CICC6047、植物乳杆菌ATCC8014、两歧双歧杆菌ATCC11863和嗜热链球菌ATCC19258)分别在各自最适温度下活化2～3代，分别以1％接种量接种液体培养基(其中，乳杆菌、双歧杆菌用MRS液体培养基；金黄色葡萄球菌采用LB肉汤)，在各自最适温度下厌氧或好氧培养12h左右。采用标准比浊溶液测定菌液的OD值，使菌液浓度在(1.5～3.0)×10⁸cfu/mL范围。

3)接种培养：分别将上述制备的菌株，无菌操作划线接种于步骤1中制备的培养基上，然后将平皿倒置在培养箱(嗜热链球菌)或充N₂的厌氧罐中(乳酸杆菌属和双歧杆菌属)，于36℃±1℃培养18～20h，对生长缓慢者培养48h；

4)镜检：挑取菌落进行涂片镜检，乳杆菌属菌体形态多样，呈长杆状、弯曲杆状或短杆状；双歧杆菌菌体菌体形态多样，呈短杆状、纤细杆状或球形，可形成各种分支或分叉形态；嗜热链球菌菌体呈球形或球杆状，直径为0.5μm～2.0μm，成对或成链排列。

镜检结果表明：接种于固体平板上的德氏乳杆菌保加利亚亚种CICC6047、植物乳杆菌ATCC8014、两歧双歧杆菌ATCC11863和嗜热链球菌ATCC19258均有生长，说明所用的培养基可同时用于乳酸杆菌、双歧杆菌和嗜热链球菌的培养。

实施例2

本实施例中采用的培养基配方为每1000mL培养基中包含胰酪胨10g，牛肉浸粉5g，酵母粉3g，葡萄糖20g，抗坏血酸棕榈酸酯1g，盐酸吡哆醛2.6mg，半胱氨酸盐酸盐0.5g，泊洛沙姆1.2g，硫酸镁0.2g，MnSO4.4H2O0.05g，β-甘油磷酸二钠，19g，琼脂13g，余量为水，pH为6.2±0.2。

其余步骤同实施例1，镜检结果表明，接种于固体平板上的德氏乳杆菌保加利亚亚种CICC6047、植物乳杆菌ATCC8014、两歧双歧杆菌ATCC11863和嗜热链球菌ATCC19258均有菌落生长，说明所用的培养基可同时用于乳酸杆菌、双歧杆菌和嗜热链球菌的培养。

实施例3

本实施例中采用的培养基配方为每1000mL培养基中包含大豆胨10g，牛肉浸粉5g，酵母粉3g，葡萄糖20g，抗坏血酸棕榈酸酯1g，盐酸吡哆醇2.6mg，泊洛沙姆1.2g，硫酸镁0.2g，MnSO₄.4H₂O 0.05g，β-甘油磷酸二钠，19g，琼脂13g，余量为水，pH为6.2±0.2。

其余步骤同实施例1，镜检结果表明，接种于固体平板上的德氏乳杆菌保加利亚亚种CICC6047、植物乳杆菌ATCC8014、两歧双歧杆菌ATCC11863和嗜热链球菌ATCC19258均有菌落生长，说明所用的培养基可同时用于乳酸杆菌、双歧杆菌和嗜热链球菌的培养。

实施例4

使用本发明研制的培养基，进行乳酸菌对抑制细胞壁合成类抗生素耐药性的检测，其实验方法如下：

1)固体平板制备：按照每1000mL培养基中包含细菌蛋白胨(Bacto ProteosePeptone货号：211684，美国BD公司)15g，牛肉浸粉4g，酵母粉5g，葡萄糖20g，抗坏血酸棕榈酸酯1g，盐酸吡哆醛2.6mg(盐酸吡哆醛可用吡咯醇或吡咯胺替换)，半胱氨酸盐酸盐0.5g，泊洛沙姆1.2g，硫酸镁0.2g，MnSO4.4H₂O 0.05g，β-甘油磷酸二钠19g，琼脂13g，余量为水，pH为6.2±0.2配置培养基，高压灭菌后，待冷却至45-55℃，无菌操作，倾注平板，使培养基的厚度为4～5mm，待冷至室温，完全凝固后即可使用；

2)受试菌和标准对照菌的活化与培养：受试菌(包括乳杆菌、双歧杆菌和嗜热链球菌)与标准对照菌(金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus，ATCC25923)各自36℃±1℃下活化2～3代，分别以1％接种量接种液体培养基(其中，乳杆菌、双歧杆菌用MRS液体培养基；嗜热链球菌采用M17肉汤培养基；金黄色葡萄球菌采用LB肉汤)，在36℃±1℃下厌氧或好氧培养12h左右。采用标准比浊溶液测定菌液的OD值，使菌液浓度在(1.5～3.0)×10⁸cfu/mL范围。

其中，具体所用菌株及菌株编号如下：乳酸乳球菌乳酸亚种ATCC11454、干酪乳杆菌ATCC393、鼠李糖乳杆菌ATCC7469、德氏乳杆菌保加利亚亚种CICC6047、植物乳杆菌ATCC8014、两歧双歧杆菌ATCC11863、嗜热链球菌ATCC19258、发酵乳杆菌ATCC9338。ATCC即美国模式培养物集存库(American type culture collection)的简写；CICC为中国工业微生物菌种保藏中心(Center of Industrial culture collection)简写。

3)接种：分别吸取受试菌与标准对照菌0.1mL，接种于步骤1中制备的培养基上，涂布均匀，放置10min，使培养基表面干燥；

4)药敏纸片贴放及培养：将标准药敏纸片贴放步骤1中制备的固体培养基表面，每皿4片，纸片外沿距平皿外沿15～20mm，纸片间距20mm，然后将平皿倒置在培养箱或充N₂的厌氧罐中，于36℃±1℃下培养18～20h，对生长缓慢者培养48h；

其中，所用的标准药敏纸片(购自杭州滨和微生物试剂公司)所用的抗生素及浓度如下：青霉素G10u/片、阿莫西林10ug/片、氨苄西林10ug/片、头孢噻肟30ug/片、头孢唑林30ug/片、头孢西丁30ug/片、亚胺培南10ug/片、多粘菌素B30ug/片、杆菌肽0.04ug/片。

5)结果分析：测量抑菌圈宽度并判断受试菌对抑制细胞壁合成类抗生素的敏感性测量受试菌与标准对照菌的抑菌圈宽度，按照判断标准得到受试菌抗生素的敏感性结果。

判断标准：敏感(S)：受试菌的抑菌圈宽度大于或等于标准对照菌的抑菌圈宽度，或者前者小于后者，但两者之差小于3mm。中度敏感(M)：受试菌的抑菌圈宽度大于3mm，但小于标准对照的抑菌圈宽度，且二者之差大于3mm。耐药(R)：抑菌圈的宽度小于或等于3mm。

对抑制细胞壁合成类抗生素的敏感性检测结果见下表1。

表1抑制细胞壁合成类抗生素在本实施例培养基上的耐药性试验结果

由上述表1结果得出按照本发明实施例4配制的培养基可用于抑制细胞壁合成类抗生素对乳酸菌的耐药性测定。

实施例5

利用乳酸菌对抑制抑制蛋白质合成类抗生素进行耐药性的检测，其实验方法按照实施例4中所述方法进行。

其中，所用的培养基采用每1000mL培养基中包含胰酪胨5g，大豆胨5g，牛肉浸粉5g，酵母粉3g，葡萄糖20g，抗坏血酸棕榈酸酯1g，盐酸吡哆醛2.6mg，泊洛沙姆1880.8g，硫酸镁0.2g，MnSO₄.4H₂O 0.05g，β-甘油磷酸二钠19g，琼脂13g，余量为水，pH为6.2±0.2进行配置。

所用的标准药敏纸片所用的抗生素及浓度如下：阿米卡星30ug/片、庆大霉素10ug/片、卡那霉素30ug/片、链霉素、四环素30ug/片、甲硝唑10ug/片、阿奇霉素30ug/片、红霉素15ug/片、林可霉素2ug/片、克林霉素30ug/片、氯霉素30ug/片。

对比实验：同时采用MRS培养基进行上述实验检测。MRS培养基的配方按照GB4789.35-2010进行配置。

抑制蛋白质合成类抗生素在本实施例培养基与MRS培养基上的耐药性试验结果见下表2。

表2抑制蛋白质合成类抗生素在本实施例所用培养基(A)与MRS培养基(B)的耐药性试验结果

注：A为本实施例培养基配方的检测结果，B为采用MRS培养基的检测结果。

由上述表2结果得出按照本发明实施例5配制的培养基测定抑制蛋白质合成类抗生素对乳酸菌的耐药性，灵敏度高于MRS培养基的测定结果。

实施例6

利用乳酸菌对抑制核酸、细胞质膜合成干扰氧化还原酶类抗生素进行耐药性的检测，其实验方法按照实施例4中所述方法进行。

其中，所用的培养基采用每1000mL培养基中包含胰酪胨10g，牛肉浸粉5g，酵母粉3g，葡萄糖20g，抗坏血酸棕榈酸酯1g，盐酸吡哆醛2.6mg，半胱氨酸盐酸盐0.5g，泊洛沙姆1.2g，硫酸镁0.2g，MnSO₄.4H₂O 0.05g，β-甘油磷酸二钠19g，琼脂13g，余量为水，pH为6.2±0.2。

所用的标准药敏纸片所用的抗生素及浓度如下：环丙沙星5ug/片、氧氟沙星5ug/片、复方新诺明纸片SMZ/TMP 23.75ug/1.25ug/片、多粘菌素B 30ug/片、呋喃妥因300ug/片。

对比实验：同时采用MC培养基进行上述实验检测。MC培养基的配方按照GB4789.35-2010进行配置。

检测结果见表3。

表3抑制核酸、细胞质膜合成干扰氧化还原酶类抗生素在本发明培养基(A)与MC培养基(B)的耐药性试验结果

由上述表3结果得出按照本发明实施例6配制的培养基测定抑制核酸、细胞质膜合成干扰氧化还原酶类抗生素对乳酸菌的耐药性测定，结果与MC培养基测定结果一致。

实施例7

利用乳酸菌对抗生素进行耐药性的检测，其实验方法按照实施例4中所述方法进行。

其中，所用的培养基采用每1000mL培养基中包含胰酪胨5g，大豆胨10g，酵母粉4g，葡萄糖15g，抗坏血酸棕榈酸酯1g，盐酸吡哆醛2.6mg，半胱氨酸盐酸盐0.5g，泊洛沙姆1881.2g，硫酸镁0.2g，MnSO₄.4H2O 0.05g，β-甘油磷酸二钠15g，琼脂13g，余量为水，pH为6.2±0.2。

所用的标准药敏纸片所用的抗生素及浓度如下：青霉素G 10u/片、阿莫西林10ug/片、氨苄西林10ug/片、头孢噻肟30ug/片、环丙沙星5ug/片、氧氟沙星5ug/片、复方新诺明纸片SMZ/TMP 23.75ug/1.25ug/片、多粘菌素B30ug/片、庆大霉素10ug/片、链霉素10ug/片、氯霉素30ug/片。

对比实验：同时采用M17培养基进行上述检测实验。

采用的M17培养基的配方：植质蛋白胨5.0g，酵母提取物5.0g，聚蛋白胨5.0g，抗坏血酸0.5g，牛肉浸膏2.5g，β-甘油磷酸二钠19g，琼脂15g，量取1.0mol/L MgSO₄·7H₂O1.0mL，蒸馏水1000mL。制法：将除琼脂以外的其它成分加入水中加热溶解，调pH7.0，再加入琼脂煮沸溶解，121℃灭菌15min，冷却备用。

检测结果见表4。

表4本实施例的培养基(A)与M17培养基(B)测定乳酸菌耐药性的效果

由上述表4结果得出按照本发明实施例7配制的培养基与M17培养基对乳酸菌的耐药性测定，结果一致或灵敏于M17培养基。

Claims (10)

1.一种用于乳酸菌耐药性测定的通用培养基，其特征在于，每1000mL的培养基包括：蛋白胨7～15g，牛肉浸粉3～7g，酵母粉2～4g，葡萄糖15～25g，抗坏血酸棕榈酸酯0.8～1.2g，维生素B6为2.6mg，半胱氨酸盐酸盐0.5～1g，泊洛沙姆1.0～2.0g，硫酸镁0.1～0.3g，MnSO₄.4H₂O 0.05g，β-甘油磷酸二钠15～25g，琼脂15～20g，余量为水，pH为6.2±0.2。

2.如权利要求1所述的通用培养基，其特征在于，所述蛋白胨为胰酪胨、大豆胨、细菌蛋白胨或胰酪胨和大豆胨的混合物。

3.如权利要求1所述的通用培养基，其特征在于，所述维生素B6为吡哆醇、盐酸吡哆醛或吡哆胺。

4.如权利要求1所述的通用培养基，其特征在于，所述泊洛沙姆为泊洛沙姆188。

5.如权利要求1所述的通用培养基，其特征在于，所述蛋白胨为胰酪胨5g和大豆胨5g；所述牛肉浸粉为5g，所述酵母粉为3g，所述葡萄糖为20g，所述抗坏血酸棕榈酸酯为1g，所述维生素B6为盐酸吡哆醛，所述半胱氨酸盐酸盐为0.5g，所述泊洛沙姆为1.2g，所述硫酸镁为0.2g，所述β-甘油磷酸二钠为15～19g，所述琼脂为13g。

6.一种用于测定乳酸菌对抗生素耐药性实验的方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)平板制备：称取如权利要求1-5中任一项通用培养基的各组分，加入到去离子水中，搅拌，加热至完全溶解，调节pH至6.2±0.2，高压灭菌后，待冷却至45℃～55℃，无菌操作倒平板，备用；

2)受试菌和标准对照菌的活化与培养：受试菌与标准对照菌分别在各自最适温度下活化2～3代，分别以0.5～1.5％接种量接种液体培养基，在最适温度下厌氧或好氧培养12h左右，采用标准比浊溶液测定菌液的OD值，使菌液浓度在1.5×10⁸～3.0×10⁸cfu/mL范围；

3)接种：分别吸取受试菌与标准对照菌0.1mL，接种于所述步骤1制备的培养基上，涂布均匀，放置7～15min，使培养基表面干燥；

4)药敏纸片贴放及培养：将标准药敏纸片贴放所述步骤1制备的固体培养基表面，每皿4片，纸片外沿距平皿外沿15～20mm，纸片间距20mm，然后将平皿倒置在培养箱或充N₂的厌氧罐中，于最适温度下培养18～20h，对生长缓慢者培养48h；

5)结果分析：测量抑菌圈宽度并判断受试菌对抗生素的敏感性测量受试菌与标准对照菌的抑菌圈宽度，判断受试菌抗生素的敏感性结果。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述受试菌包括乳杆菌、双歧杆菌和/或嗜热链球菌。

8.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述标准对照菌为金黄色葡萄球菌。

9.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述最适合温度为36℃±1℃。

10.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述判断的标准为：当受试菌的抑菌圈宽度大于或等于标准对照菌的抑菌圈宽度，或者前者小于后者，但两者之差小于3mm判为敏感；当受试菌的抑菌圈宽度大于3mm，但小于标准对照的抑菌圈宽度，且二者之差大于3mm为中度敏感；当抑菌圈的宽度小于或等于3mm，为耐药。