CN101270382A - 念珠菌、嗜血菌和支原体组合培养试剂盒及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种念珠菌、嗜血菌和支原体组合培养试剂盒及其应用，该试剂盒包括培养基、CO2发生片，所述的培养基包括念珠菌培养基、嗜血菌培养基、支原体培养基，所述的培养基的pH值为6.3±0.5，本发明用于念珠菌、嗜血菌和支原体的检测，也可用于男女性泌尿生殖道的微生态的评价，确诊细菌性、念珠菌性、支原体性的感染及其疗效的评价。与现有技术相比，本发明念珠菌、嗜血菌和支原体组合培养试剂盒具有操作简便、方法可靠、性质稳定、结果易于观察和判断等特点，提供一种更科学、更方便、更人性化、更准确的诊断工具，有利于生物或医疗实践和商品化运输，具有良好的社会及经济效益。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药用试剂盒，尤其是涉及念珠菌、嗜血菌和支原体组合培养试剂盒及其应用。
背景技术
念珠菌、嗜血菌和支原体是人类泌尿生殖道中危害人体健康的常见致病微生物，主要引起尿道炎、阴道炎、前列腺炎、宫颈炎、盆腔炎、不孕不育、新生儿感染等疾病。
目前，临床上对念珠菌、嗜血菌和支原体的检测主要采用培养基培养。这种培养方法在灵敏度、特异性、稳定性等方面存在着一定缺陷，对最终检测结果判断的准确性产生不良影响。
发明内容
本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种操作简便、方法可靠、性质稳定、结果易于观察和判断的念珠菌、嗜血菌和支原体组合培养试剂盒及其应用。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
念珠菌、嗜血菌和支原体组合培养试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括培养基、CO2发生片，所述的培养基包括念珠菌培养基、嗜血菌培养基、支原体培养基，所述的培养基的pH值为6.3±0.5。
所述的培养基的配方(每1000ml)包括：
基础基 600～800ml；
马或牛血清 50～200ml；
酵母提取物 2～8g；
尿素 2～10g；
L-精氨酸盐酸盐 1～5g；
酚红 0.1～0.8g；
复合生长因子 5～20ml；
抗生素 5～20ml；
葡萄糖 5～20g；
琼脂 10～12g；
所述的嗜血菌培养基的配方还包括血红蛋白或10％血清或2％卵黄10～30g/1000ml培养基。
所述的基础基的配方(每1000ml)包括牛心粉5～20g、蛋白胨1～10g、NaCl2～8g。
所述的复合生长因子包括1％DMEM、0.5％DNA和1％胱氨酸等。
所述的抗生素选自庆大霉素、氯霉素、万古霉素、多粘菌素、氟康唑、青霉菌素中的一种或几种。
一种念珠菌、嗜血菌和支原体组合培养试剂盒的应用方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
(1)取待检标本；
(2)将待检标本划线接种于念珠菌培养基、嗜血菌培养基和支原体培养基上；
(3)将培养基于30～37℃培养24～48小时，观察生长情况；
(4)结果分析：
a.培养基变色和肉眼可见典型念珠菌菌落，则念珠菌阳性，其中大的、绿色为白色念珠菌，兰灰色为热带念珠菌，粉红色为克柔念珠菌，其它念珠菌为白色至粉色；
b.培养基肉眼可见典型嗜血菌菌落，则嗜血菌阳性，其中加德纳菌、链球菌和淋病奈瑟菌等的菌落为肉眼可见、小的透明或半透明；
c.培养基由淡黄色变红色或紫红色，显微镜下放大40～100倍，看到棕褐色的解脲脲原体菌落和人型支原体的油煎蛋样菌落，则支原体阳性。
所述的待检标本包括人类泌尿生殖道分泌物、尿、前列腺液或精液等。
本发明用于念珠菌、嗜血菌和支原体的检测，也可用于男女性秘尿生殖道的微生态的评价，确诊细菌性、念珠菌性、支原体性的感染及其疗效的评价。
本发明的培养基使用的原料、蒸馏水无毒和无放射性，不含对人体有害的物质，并仅用于体外诊断，不与人体接触，不会对使用人员的身体健康造成任何危害。培养基生产、质控和包装过程中无污水、无污物、无放射性产生和排放，没有任何环保问题。
与现有技术相比，本发明念珠菌、嗜血菌和支原体组合培养试剂盒具有操作简便、方法可靠、性质稳定、结果易于观察和判断等特点，提供一种更科学、更方便、更人性化、更准确的诊断工具，有利于生物或医疗实践和商品化运输，具有良好的社会及经济效益。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例1
一种念珠菌、嗜血菌和支原体组合培养试剂盒，具体如下：
1.组成、配方与原理
1.1组成：培养基、CO2发生片
1.2配方：每升包括以下成分，pH为6.3±0.5(25±1℃)，固相加琼脂10～12g
基础基(含牛心粉10g、蛋白胨5g、NaCl5g) 700ml
马(或牛)血清 100ml
酵母提取物 4g
尿素 6g
L-精氨酸盐酸盐 3g
酚红 0.5g
复合生长因子 10ml
抗生素 10ml
葡萄糖 10g
嗜血菌培养基另加血红蛋白 20g
复合生长因子包括1％DMEM 3ml、0.5％DNA 3ml和1％胱氨酸4ml；念珠菌培养基的抗生素为庆大霉素，嗜血菌培养基的抗生素为万古霉素5ml和多粘菌素5ml，支原体培养基的抗生素为氟康唑4ml和青霉菌素6ml。
1.3原理：本发明培养基偏酸(pH6.3±0.5)，含有嗜血菌、念珠菌、解脲支原体与人型支原体生长的丰富营养，该培养基可用于淋病奈瑟菌(N.gonorrhoeae)、脑膜炎奈瑟菌(N.meningitis)、链球菌属Streptococcus、加德纳菌(Gardnerellavaginalis)和幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)的生长、分离培养和传代，还含尿素(解脲支原体鉴定的底物)和精氨酸(人型支原体鉴定的底物)、酚红指示剂，和抑菌剂(可抑制人体内大多数的细菌)。
当解脲支原体或人型支原体在该培养基中生长，就能分解尿素或精氨酸，产铵，使培养基pH上升(pH7.0或8.0以上)，变碱，酚红出现颜色变化，就可指示解脲支原体或人型支原体的生长。解脲支原体或人型支原体的分离、正确的鉴定须在固体培养基上，根据菌落特征进行。固体培养基除看颜色变化外(由淡黄色变红色或紫红色)，在显微镜下放大40～100倍，能看到棕褐色的解脲支原体菌落和油煎蛋样的人型支原体菌落。
嗜血菌在培养基上的出现肉眼可见的，无色(或红色)透明或不透明针尖样小菌落，加德纳菌、链球菌和淋病奈瑟菌等的菌落为肉眼可见、小的透明或半透明。
念珠菌在培养基上的菌落为白色或奶白色或显色等，大的、绿色为白色念珠菌，兰灰色为热带念珠菌，粉红色为克柔念珠菌，其它念珠菌为白色至粉色。
2.色泽：嗜血菌培养基为巧克力色、枣红色或淡黄色固体；念珠菌培养基、支原体培养基为黄色透明固体。
3.状态：固体，表面光滑平整，无气泡，无裂纹。
4.装量：
检测方法：打开被检样品盖子，用刻度吸管吸取液体(固体在微波炉中加热溶解后)并测其装量。
结果：培养基为2.5～4ml，层厚度为3ml，不多于或少于规定装量的10％。
5.pH值：偏酸(pH6.3±0.5)，适合念珠菌、嗜血菌和支原体生长的pH值为5.0-7.0。
6.特异性：选用泌尿生殖道中有代表性的常见菌：大肠埃希氏菌ATCC25922、金黄色葡萄球菌ATCC25923对培养基的特异性进行考核。
菌种：大肠埃希菌(ATCC25922)由中国医学细菌保藏管理中心提供
金黄色葡萄球菌(ATCC25923)由中国医学细菌保藏管理中心提供
设备：培养箱(36℃±1℃)，无菌吸管，营养琼脂平板，沙包弱培养基
方法：
(1)将测试所需细菌(大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌)分别接种于营养琼脂平板，经37℃24h培养后，用生理盐水配制成细菌悬液(浓度为2×106个菌/ml)，置4℃备用(6h内使用)；
(2)用无菌吸管分别吸取0.1ml大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌悬液，分别加入到被检培养基中，然后置培养箱(36℃±1℃)培养；
(3)培养24h后，取出观察结果；
(4)结果：大肠埃希菌生长，金黄色葡萄球菌不生长。
7.敏感性：选取3个念珠菌、淋病奈瑟菌和解脲脲原体的临床分离株，接种量约102CFU/ml～105CFU/ml时，固体培养基变色和能看到典型菌落，对培养基的敏感性进行考核。选择接种量在102CFU/ml～105CFU/ml，主要考虑以下因素：1)绝大多数临床样本淋病奈瑟菌的浓度在102CFU/ml～105CFU/ml；2)因为接种量为102CFU/ml左右时，接种量小，淋病奈瑟菌在微孔中的分布可能不均匀；接种量为105CFU/ml以上时，相对浓度较大，实验结果同样可能存在偏差。
8.准确性：
菌种：淋病奈瑟菌(CMCC29106)37℃48h培养物
解脲脲原体(ATCC27618)37℃24h培养物
白色念珠菌(ATCC10231)37℃48h培养物
设备：培养箱(36℃±1℃)，无菌吸管
方法：
(1)取被检培养基；
(2)用无菌吸管各吸取0.1ml念珠菌、淋病奈瑟菌和解脲脲原体上述菌种培养物加入到培养基中，然后置培养箱(36℃±1℃)培养；
(3)培养，取出观察结果；
(4)结果：培养已知的目标菌淋病奈瑟菌标准株(CMCC29106)48h培养基上应生长，菌落为无色(或红色)透明或半透明针尖样小菌落；培养已知的解脲脲原体(ATCC27618)37℃36h，固体培养基变色和能看到典型菌落；培养已知的白色念珠菌(ATCC10231)37℃36h，固体培养基变色和能看到典型菌落；用非目标菌金黄色葡萄球菌(ATCC25923)标准株等接种在培养基上不生长。
9.规格：20人份/每盒。
10.微生物要求：包装开封后，培养基无肉眼可见的混浊或菌落。将没有接种任何标本的培养基置35℃-37℃隔水恒温培养箱中培养48小时，确认生产过程没有造成污染，验证用户使用过程中的一般性操作不会造成杂菌污染培养基。
11.重复性(批内差)：控制产品的批内差，每一批产品随机抽样5人份，按产品要求检验，差异不大于SD±0.5。
12.批间差异要求：控制产品的批间差异，三批不同产品随机抽样5人份，按产品要求检验，差异不大于SD±0.5。
13.稳定性：本发明从生产日起，有效期为3个月。稳定性是试剂类产品的一项重要指标，本标准规定在保存期间和末对留样进行规定的试验，一方面可以检测试剂本身的长期稳定性，另一方面也可以检测试剂包装材料的长期稳定性，从而确保在保存期内试剂质量符合标准规定要求。
14.有效期：在2～8℃有效期为3个月。
实施例2
一种念珠菌、嗜血菌和支原体组合培养试剂盒，包括培养基、CO2发生片，培养基pH为6.3±0.5(25±1℃)。
所述的培养基的配方(每1000ml)包括：
基础基(含牛心粉20g、蛋白胨1g、NaCl2g) 600ml
马(或牛)血清 200ml
酵母提取物 2g
尿素 10g
L-精氨酸盐酸盐 1g
酚红 0.8g
复合生长因子 20ml
抗生素 20ml
葡萄糖 5g
琼脂 10g
嗜血菌培养基另加10％血清 20g
复合生长因子包括1％DMEM 5ml、0.5％DNA 7ml和1％胱氨酸8ml；念珠菌培养基的抗生素为氯霉素，嗜血菌培养基的抗生素为万古霉素6ml和多粘菌素14ml，支原体培养基的抗生素为氟康唑5ml和青霉菌素15ml。
上述念珠菌、嗜血菌和支原体组合培养试剂盒的应用方法，包括以下步骤：
(1)取待检标本，包括人类泌尿生殖道分泌物、尿、前列腺液或精液等；
(2)将待检标本划线接种于培养基念珠菌培养基、嗜血菌培养基和支原体培养基上；
(3)将培养基于30～37℃培养24～48小时，观察生长情况；
(4)结果分析：
a.培养基变色和肉眼可见典型念珠菌菌落，则念珠菌阳性，其中大的、绿色为白色念珠菌，兰灰色为热带念珠菌，粉红色为克柔念珠菌，其它念珠菌为白色至粉色；
b.培养基肉眼可见典型嗜血菌菌落，则嗜血菌阳性，其中加德纳菌、链球菌和淋病奈瑟菌等的菌落为肉眼可见、小的透明或半透明；
c.培养基由淡黄色变红色或紫红色，显微镜下放大40～100倍，看到棕褐色的解脲脲原体菌落和人型支原体的油煎蛋样菌落，则支原体阳性。
实施例3
一种念珠菌、嗜血菌和支原体组合培养试剂盒，包括培养基、CO2发生片，培养基pH为6.3±0.5(25±1℃)。
所述的培养基的配方(每1000ml)包括：
基础基(含牛心粉5g、蛋白胨10g、NaCl8g) 800ml
马(或牛)血清 50ml
酵母提取物 8g
尿素 2g
L-精氨酸盐酸盐 5g
酚红 0.1g
复合生长因子 5ml
抗生素 5ml
葡萄糖 20g
琼脂 12g
嗜血菌培养基另加2％卵黄 5g
复合生长因子包括1％DMEM 2ml、0.5％DNA 1ml和1％胱氨酸2ml；念珠菌培养基的抗生素为氯霉素，嗜血菌培养基的抗生素为万古霉素1ml和多粘菌素4ml，支原体培养基的抗生素为氟康唑2ml和青霉菌素3ml。
Claims (7)
1.念珠菌、嗜血菌和支原体组合培养试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括培养基、CO2发生片，所述的培养基包括念珠菌培养基、嗜血菌培养基、支原体培养基，所述的培养基的pH值为6.3±0.5。
2.根据权利要求1所述的念珠菌、嗜血菌和支原体组合培养试剂盒，其特征在于，所述的培养基的配方(每1000ml)包括：
基础基 600～800ml；
马或牛血清 50～200ml；
酵母提取物 2～8g；
尿素 2～10g；
L-精氨酸盐酸盐 1～5g；
酚红 0.1～0.8g；
复合生长因子 5～20ml；
抗生素 5～20ml；
葡萄糖 5～20g；
琼脂 10～12g；
所述的嗜血菌培养基的配方还包括血红蛋白或10％血清或2％卵黄10～30g/1000ml培养基。
3.根据权利要求2所述的念珠菌、嗜血菌和支原体组合培养试剂盒，其特征在于，所述的基础基的配方(每1000ml)包括牛心粉5～20g、蛋白胨1～10g、NaCl2～8g。
4.根据权利要求2所述的念珠菌、嗜血菌和支原体组合培养试剂盒，其特征在于，所述的复合生长因子包括1％DMEM、0.5％DNA和1％胱氨酸等。
5.根据权利要求2所述的念珠菌、嗜血菌和支原体组合培养试剂盒，其特征在于，所述的抗生素选自庆大霉素、氯霉素、万古霉素、多粘菌素、氟康唑、青霉菌素中的一种或几种。
6.一种念珠菌、嗜血菌和支原体组合培养试剂盒的应用方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
(1)取待检标本；
(2)将待检标本划线接种于念珠菌培养基、嗜血菌培养基和支原体培养基上；
(3)将培养基于30～37℃培养24～48小时，观察生长情况；
(4)结果分析：
a.培养基变色和肉眼可见典型念珠菌菌落，则念珠菌阳性，其中大的、绿色为白色念珠菌，兰灰色为热带念珠菌，粉红色为克柔念珠菌，其它念珠菌为白色至粉色；
b.培养基肉眼可见典型嗜血菌菌落，则嗜血菌阳性，其中加德纳菌、链球菌和淋病奈瑟菌等的菌落为肉眼可见、小的透明或半透明；
c.培养基由淡黄色变红色或紫红色，显微镜下放大40～100倍，看到棕褐色的解脲脲原体菌落和人型支原体的油煎蛋样菌落，则支原体阳性。
7.根据权利要求6所述的一种念珠菌、嗜血菌和支原体组合培养试剂盒的应用方法，其特征在于，所述的待检标本包括人类泌尿生殖道分泌物、尿、前列腺液或精液等。
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