CN105969685A - 一种可用于筛选粪便中具有抗癌活性微生物的方法 - Google Patents

Abstract

一种可用于筛选粪便中具有抗癌活性微生物的方法，是分离无癌症村健康人粪便中的肠道微生物，经体外和体内实验筛选出具有抗癌活性的微生物。本发明直接对无癌症村健康人粪便的微生物进行分离培养，筛选出具有抗癌活性的微生物，具有筛选量大，可定向筛选的优点，有助于更好的开发利用具有抗癌活性的微生物资源。

Description

一种可用于筛选粪便中具有抗癌活性微生物的方法

技术领域

本发明涉及一种可用于筛选粪便中具有抗癌活性微生物的方法，属于微生物生物技术与生物制药技术领域。

背景技术

人体肠道菌群，是指寄居在人体肠道内微生物群落的总称。人体肠道内有约100 万亿细菌，高达人体细胞数量的10 倍以上。虽然单个细菌很简单，且基因数远没有人类基因复杂，但是肠道菌群包含500至1000种不同的细菌，基因总数是人类的100多倍，每个人至少有160 种优势菌群。早期人们一直认为，肠道细菌除了在排便时作为病原体存在外，一直是肠道内无关紧要的细菌。近年来的研究逐渐揭示了肠道菌群的构成、数量、如何进入人体、如何辅助消化、如何影响肠道发育，以及肠道菌群失衡如何影响整体健康等。肠道菌群如此庞大，与人体的交互关系也如此密切，因此科学家们将其称为人体的另一个器官，甚至另一个自己。

早在2013年12月在“Science”杂志发表的十大科学进展中，肠道菌群与人体健康关系的研究就被列入其中。早期研究中，肠道微生物更多的被认为是和消化、营养作用联系在一起的。随着对肠道菌群的长期和细致研究，科学家们揭示了人体健康与肠道微生物间的复杂关系，发现肠道菌群失调与营养不良、肥胖症、糖尿病等疾病息息相关。而近年来，科学家们发现癌症的产生也与肠道菌群关系密切，甚至夺得了“Science”杂志发表的十大科学进展的名单上第一名的癌症免疫疗法的效果也受肠道微生物的影响。

肠道菌群的种类极为丰富，可以将其划分为三种类型，包括共生菌群、条件致病菌群和致病菌群。其中共生菌群，主要有拟杆菌、梭菌、双歧杆菌、乳酸杆菌。这些细菌占到了肠道菌群的99%以上，跟人体健康关系极为密切。它们辅助消化多种食物，并保护我们的肠道。现今双岐杆菌和乳酸菌制备而成的各种产品已经广泛应用于食品、医药等流域。益生元或益生素就是用于补充或者刺激双歧杆菌生长的一类产品。近年，全球科学家们将肠道菌群与癌症研究的方向细致到肠道菌群中某种或某类细菌与癌症的相关性方面上。动物研究表明共生的双歧杆菌不仅可以提高抗肿瘤免疫力，并且促进抗PD-L1肿瘤免疫疗法的效果，肠道中有某些拟杆菌存在的情况下，抗癌药才能发挥作用。

本发明在无癌症村健康人粪便中筛选具有抗癌活性的微生物的研究中，提供了一种从无癌症村健康人粪中筛选具有抗癌活性微生物的方法，并测定了所筛细菌的生长特性和抗癌作用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种筛选无癌症村健康人粪便中具有抗癌活性微生物的方法，该方法具有筛选量大，可定向筛选的优点，有助于更好的开发利用具有抗癌活性的微生物资源。

本发明所述方法步骤如下：

1、取样者的选择：样品取自无癌症村的健康老人，年龄在50-60岁之间，6个月内没有使用过抗生素；所述无癌症村为江西省宜春市的无癌症村。

2、样品的收集和保存：收集无癌症村健康人的新鲜粪便，转人厌氧环境，加入甘油，其体积为粪便和甘油总体积的50％，旋涡振荡器混匀，-8O ℃保存；

3、样品菌群的分离与鉴定：

（1）培养基的制备：配制BSM、MRS、改良的GAM固体培养基和BHI+5%脱脂乳的固体和液体培养基；其中BSM培养基用于培养双岐杆菌、MRS培养基用于培养乳酸菌、改良的GAM培养基用于培养拟杆菌、BHI+5%脱脂乳用于培养总菌。

（2）培养方式：将粪便从-8O ℃的冰柜中取出，取少量粪便置于无菌的PBS中，按10¹～10⁸比例稀释；分别取100μL10²、10⁴、10⁶涂板，厌氧和需氧条件下培养48h。

（3）挑菌接种：于无菌超净工作台中根据平板中菌落的形态、大小、颜色、边缘整齐与否、隆起与否和降解乳糖与否，挑出单菌落接种于相应的液体培养基中。

（4）革兰染色：取10μL菌液，涂板于载玻片上，置于电子显微镜下观察菌的形态结构。

（5）测序：根据革兰染色的结果选出不同的细菌用于测序，以确定细菌的具体名称。

4、体外研究细菌的生长特性：(耐酸、耐胆盐、最适生长温度、抑菌实验)

（1）酸碱耐受测定：配制相应的液体培养基，设置PH为1 ,3，5，7，9五个梯度，分别接种1% 的菌液，培养48小时后进行活菌计数，确定各种细菌生长的最适PH；

（2）胆盐耐受测定：配制相应的液体培养基，设置胆盐浓度为0 ,0.10%，0.30%,0.50%四个梯度，分别接种1% 的菌液，培养48小时后进行活菌计数，确定各种细菌生长的胆盐耐受能力；

（3）最适生长温度测定：配制相应的液体培养基，设置培养温度分别为25 ℃、30 ℃、37 ℃、42 ℃四个梯度，分别接种1% 的菌液，培养48小时后进行活菌计数，确定各种细菌生长的最适温度。

（4）抑菌实验：牛津杯法测定

a、指示菌菌悬液的制备：取保存于-8O℃冰柜的大肠杆菌、乙型溶血链球菌、金黄色葡萄球菌，于LB液体培养基中37℃过夜活化。

b、所筛菌菌悬液的制备：将所筛菌接种于相对应的液体培养基中，37℃过夜活化。将菌液在10000rpm条件下离心5min，取上清液做抑菌实验。

c、实验方法:取50µL指示菌菌悬液均匀涂布于LB固体培养基上，并用镊子将无菌的牛津杯轻轻放入培养皿中，均匀地放置4只牛津杯，吸取一定浓度的益生菌菌悬液100µL注入的牛津杯中，过夜培养。注意不要将菌悬液溢出牛津杯外。

d、抑菌效果测定：测量抑菌圈的直径，对比抑菌效果。

5、体外实验筛选具有抗癌活性的微生物：

（1）细胞粘附实验：

a、HT-29细胞的培养：将HT-29细胞培养于含10%胎牛血清(使用前于56℃ 灭活

30 min)和1%双抗(青霉素和链霉素溶液)的DMEM培养基作为细胞培养基，在37℃、5% CO₂-95%空气的细胞培养箱中进行培养。用于黏附试验的细胞培养于细胞36 孔培养板

中，接种量为1×10⁵ cells/well，待单层细胞汇合之后，继续培养10−15 d，即可用于黏附试验。进行黏附实验前24 h，需要更换为无双抗DMEM 培养基。

b、粘附实验：取对数生长期的HT-29 细胞，胰酶消化后，以每孔1×10⁵个细胞种于12 孔培养板，实验组加入筛选得到的细菌菌悬液，对照组为不含细菌的培养液，每组设3 个重复孔，37℃、5% CO₂-95%空气的细胞培养箱中培养，分别于3 小时和6 小时吸出培养液及未粘附的细胞，粘附细胞以无菌PBS 轻轻洗2 次，0.2%胰蛋白酶消化后收集。细胞计数器测定细胞数目，计算细胞粘附率，细胞粘附率=（粘附细胞数/总细胞数）100%。

（2）细胞生长抑制实验：取对数生长期的HT-29细胞，调整细胞密度为1×10⁵ cells/well，接种于96孔板，每孔约200µL细胞悬液，置于37℃、5% CO₂-95%空气的细胞培养箱中培养24 h；①实验组：加入200µL细菌菌悬液；②空白组：加入等量的细胞培养液；各做3个重复孔，然后将培养板移入C0₂ 培养箱中孵育24后，各孔加入5 mg/ml MTT 溶液20 μl，同样条件继续孵育4 h 后终止培养。终止培养后小心吸弃孔内上清液，每孔加入150 μl/孔的二甲基亚砜（DMSO），震荡lO min，使结晶物充分溶解。选490 nm波长，以加细胞培养液而不加细胞的空白孔调零，用酶标仪测量每孔的OD值，取3 孔均值。按以下公式计算细胞生长抑制率：

细胞生长抑制率=(1-实验组OD_490nm／对照组OD_490nm)×100％

（3）Western blot 法测定细胞内TNF-α 、IL-1β、IL-6、IL-8、STAT3、p-STAT3蛋白的表达:

a、Raw264.7细胞的培养：复苏冻存细胞后，采用DMEM高糖培养基（含有10%FBS，100 U/mL青霉素，100mg/mL链霉素），37℃，5%CO₂培养箱饱和湿度下培养48h。生长状况良好的细胞每2-3d传代，0.25%胰酶+0.2消化2-3min，镜下观察细胞回缩变圆时终止消化，每次分3-5瓶。所有实验均采用对数生长期细胞。

b、蛋白表达水平的检测：取对数生长期的Raw264.9细胞，调整细胞密度为1×10⁵ cells/well，接种于96孔板，每孔200µL细胞悬液，再加入细菌菌悬液200µL，37℃，5%CO₂培养箱饱和湿度下培养48h。提取上述细胞经菌液作用48 小时后的总蛋白。将细胞用冷PBS 洗涤2 次，用50 µLRapa 裂解液（radioimmune precipitation assay buffer）裂解细胞，冰上30 钟后刮取细胞，以12000 rpm 4 ℃离心15 min，收集上清转移入新的1.5 mL 离心管中，BCA法测定蛋白浓度。取30 ug 蛋白样品经12% SDS -聚丙烯酰胺凝胶90 V 电压进行电泳分离，后电转移至硝酸纤维素滤膜上,用含有50 g/L 脱脂奶粉的T-BST [10 mM Tris-Cl(pH8.0), 150mM NaCl 和0.05% Tween20]封闭1 h，分别加入抗TNF-α 、IL-1β、IL-6、IL-8、STAT3、p-STAT3蛋白的抗体，4 ℃反应过夜, TBST 漂洗3 次，每次10 min。 HRP 标记的抗鼠IgG 二抗（15000）孵育1 h；TBST 漂洗3 次，用 Western blotting 印迹荧光检测试剂盒显示于 X 光片。结果用 Labwork 凝胶图像分析系统对胶片扫描，以内参的面积灰度值与实验组进行比较进行半定量分析。

6、体内建立癌症小鼠模型评价所筛选微生物的抗癌活性的强度：

（1）肿瘤模型的建立与分组：

纯系BALB／CA-n 裸鼠，10只，4～6 周龄，体重15～20 g，均为雌性，严格在SPF 条件下饲养，自由摄取水分和食物。随机将小鼠分为对应的模型组、对应的治疗组和空白组，每组10只。

取对数生长期的HT-29细胞，悬浮于100µL无菌PBS中，调整到细胞密度为5 ×10⁵ ，对模型组和治疗组裸鼠皮下注射，用尺子测量肿瘤的大小。空白组皮下注射无HT-29细胞的PBS。模型组和治疗组裸鼠均在细胞接种后48 h 后接受以下处理：

①模型组：100µL的PBS予以灌胃,隔天一次，共10 次。

②治疗组：含有5 ×10⁶个细菌的100µLPBS予以灌胃，隔天一次，共10 次。

③空白组：100µL 的PBS予以灌胃,隔天一次，共10 次。

每日测量肿瘤的大小和体重，并观察裸鼠的精神状况、皮肤、饮食及活动能力。

(2) ELISA 法测定血清中TNF-α 、IL-6、IL-8蛋白表达: 取每只裸鼠眼眶血0.2 ml，5000 rpm，10min 离心后吸出血清，-80 ℃保存，备用。实验开始时提前30 min从冰箱取出ELISA 试剂盒及待测标本，平衡至室温，在室温条件下使用，轻轻摇匀溶液，严格按照ELISA试剂盒步骤进行实验。

1) 实验前20min从冰箱中取出试剂盒，平衡至室温（20℃-25℃）

2) 按照说明，配置TNF-α 、IL-6、IL-8capture antibody。

3) 包被：取出所需数量的板条，capture antibody按照1:180稀释，每孔加入100µL,轻轻拍打，包被过夜。

4) 洗板：甩尽孔内液体，每孔加满wash buffer，静置30 秒后甩尽液体，在厚吸水纸上拍干,重复4次，每次用滤纸吸干。

5) 封闭：用reagent diluent每孔加入100µL室温包被至少1小时。

6) 洗板：甩尽孔内液体，每孔加满wash buffer，静置30 秒后甩尽液体，在厚吸水纸上拍干,重复4次，每次用滤纸吸干。

7) 建立标准曲线：准备7个EP管，每管加入样品稀释液150µL，第1管加标准品150µL,混匀后用移液器吸出150µL移至第二管，如此反复作对倍稀释至第7管。每管吸出100µL按从高到低浓度加入孔内，第8孔加100µL reagent diluent做空白对照。

8) 加样：待测品孔中每孔加入待测样品100µL。

9) 将反应板37℃放置120min。

10) 洗板：同前。

11) 每孔中加入一抗工作液100µL。

12) 将反应板37℃放置120min

13) 洗板：同前。

14) 每孔中加入酶标抗体工作液100µL。

15) 将反应板37℃避光放置20min

16）洗板：同前。

17）每孔中加入底物工作液100µL，避光放置20min。

18）每孔中加入终止液50µL。

19）在450nm处测定吸光值。

20）蛋白浓度计算：以标准品浓度作横坐标，OD₄₅₀值作纵坐标，绘制标准曲线。通过检测到样品的OD 值从而得出蛋白的浓度。

（3）Western blot 法测定裸鼠内TNF-α 、IL-1β、IL-6、IL-8、STAT3、p-STAT3蛋白的表达：

提取裸鼠移植瘤组织的总蛋白，BCA法对蛋白质定量。取30 ug 蛋白样品经12% SDS-聚丙烯酰胺凝胶90 V 电压进行电泳分离，之后电转移至硝酸纤维素滤膜上, 用有50 g/L去脂奶粉的T-BST(10 mM Tris-Cl，pH 8.0； 150 mM NaCl,和0.05% Tween20)封闭1 h，分别加入抗TNF-α 、IL-1β、IL-6、IL-8、STAT3、p-STAT3 的一抗（1:1000），4 ℃孵育过夜, TBST洗涤3 次，每次10 min。HRP 标记的抗鼠IgG 二抗（1：1000）室温孵育1 h，TBST洗涤3 次，每次10 min。用 Western blotting 印迹荧光检测试剂

盒显示于 X 光片。结果用 Labwork 凝胶图像分析系统对胶片扫描，以内参的面积灰度值与实验组进行比较进行半定量分析。

7、确定有抗癌活性的微生物：综合上述结果，确定和筛选出具有抗癌活性的微生物。

本发明的有益效果：该方法具有筛选量大，可定向筛选的优点，有助于更好的开发利用具有抗癌活性的微生物资源。

具体实施方式

本发明所述方法步骤如下：

1、取样者的选择：样品取自无癌症村的健康老人，年龄在50-60岁之间，6个月内没有使用过抗生素；所述无癌症村为江西省宜春市的无癌症村。

2、样品的收集和保存：收集无癌症村健康人的新鲜粪便，转人厌氧环境，加入甘油，其体积为粪便和甘油总体积的50％，旋涡振荡器混匀，-8O ℃保存；

3、样品菌群的分离与鉴定：

（1）培养基的制备：配制BSM、MRS、改良的GAM固体培养基和BHI+5%脱脂乳的固体和液体培养基；其中BSM培养基用于培养双岐杆菌、MRS培养基用于培养乳酸菌、改良的GAM培养基用于培养拟杆菌、BHI+5%脱脂乳用于培养总菌。

（2）培养方式：将粪便从-8O ℃的冰柜中取出，取少量粪便置于无菌的PBS中，按10¹～10⁸比例稀释；分别取100μL10²、10⁴、10⁶涂板，厌氧和需氧条件下培养48h。

（3）挑菌接种：于无菌超净工作台中根据平板中菌落的形态、大小、颜色、边缘整齐与否、隆起与否和降解乳糖与否，挑出单菌落接种于相应的液体培养基中。

（4）革兰染色：取10μL菌液，涂板于载玻片上，置于电子显微镜下观察菌的形态结构。

（5）测序：根据革兰染色的结果选出不同的细菌用于测序，以确定细菌的具体名称。

4、体外研究细菌的生长特性：(耐酸、耐胆盐、最适生长温度、抑菌实验)

（1）酸碱耐受测定：配制相应的液体培养基，设置PH为1 ,3，5，7，9五个梯度，分别接种1% 的菌液，培养48小时后进行活菌计数，确定各种细菌生长的最适PH；

（2）胆盐耐受测定：配制相应的液体培养基，设置胆盐浓度为0 ,0.10%，0.30%,0.50%四个梯度，分别接种1% 的菌液，培养48小时后进行活菌计数，确定各种细菌生长的胆盐耐受能力；

（3）最适生长温度测定：配制相应的液体培养基，设置培养温度分别为25 ℃、30 ℃、37 ℃、42 ℃四个梯度，分别接种1% 的菌液，培养48小时后进行活菌计数，确定各种细菌生长的最适温度。

（4）抑菌实验：牛津杯法测定

a、指示菌菌悬液的制备：取保存于-8O℃冰柜的大肠杆菌、乙型溶血链球菌、金黄色葡萄球菌，于LB液体培养基中37℃过夜活化。

b、所筛菌菌悬液的制备：将所筛菌接种于相对应的液体培养基中，37℃过夜活化。将菌液在10000rpm条件下离心5min，取上清液做抑菌实验。

c、实验方法:取50µL指示菌菌悬液均匀涂布于LB固体培养基上，并用镊子将无菌的牛津杯轻轻放入培养皿中，均匀地放置4只牛津杯，吸取一定浓度的益生菌菌悬液100µL注入的牛津杯中，过夜培养。注意不要将菌悬液溢出牛津杯外。

d、抑菌效果测定：测量抑菌圈的直径，对比抑菌效果。

5、体外实验筛选具有抗癌活性的微生物：

（1）细胞粘附实验：

a、HT-29细胞的培养：将HT-29细胞培养于含10%胎牛血清(使用前于56℃ 灭活

30 min)和1%双抗(青霉素和链霉素溶液)的DMEM培养基作为细胞培养基，在37℃、5% CO₂-95%空气的细胞培养箱中进行培养。用于黏附试验的细胞培养于细胞36 孔培养板

中，接种量为1×10⁵ cells/well，待单层细胞汇合之后，继续培养10−15 d，即可用于黏附试验。进行黏附实验前24 h，需要更换为无双抗DMEM 培养基。

b、粘附实验：取对数生长期的HT-29 细胞，胰酶消化后，以每孔1×10⁵个细胞种于12 孔培养板，实验组加入筛选得到的细菌菌悬液，对照组为不含细菌的培养液，每组设3 个重复孔，37℃、5% CO₂-95%空气的细胞培养箱中培养，分别于3 小时和6 小时吸出培养液及未粘附的细胞，粘附细胞以无菌PBS 轻轻洗2 次，0.2%胰蛋白酶消化后收集。细胞计数器测定细胞数目，计算细胞粘附率，细胞粘附率=（粘附细胞数/总细胞数）100%。

（2）细胞生长抑制实验：取对数生长期的HT-29细胞，调整细胞密度为1×10⁵ cells/well，接种于96孔板，每孔约200µL细胞悬液，置于37℃、5% CO₂-95%空气的细胞培养箱中培养24 h；①实验组：加入200µL细菌菌悬液；②空白组：加入等量的细胞培养液；各做3个重复孔，然后将培养板移入C0₂ 培养箱中孵育24后，各孔加入5 mg/ml MTT 溶液20 μl，同样条件继续孵育4 h 后终止培养。终止培养后小心吸弃孔内上清液，每孔加入150 μl/孔的二甲基亚砜（DMSO），震荡lO min，使结晶物充分溶解。选490 nm波长，以加细胞培养液而不加细胞的空白孔调零，用酶标仪测量每孔的OD值，取3 孔均值。按以下公式计算细胞生长抑制率：

细胞生长抑制率=(1-实验组OD_490nm／对照组OD_490nm)×100％

（3）Western blot 法测定细胞内TNF-α 、IL-1β、IL-6、IL-8、STAT3、p-STAT3蛋白的表达:

a、Raw264.7细胞的培养：复苏冻存细胞后，采用DMEM高糖培养基（含有10%FBS，100 U/mL青霉素，100mg/mL链霉素），37℃，5%CO₂培养箱饱和湿度下培养48h。生长状况良好的细胞每2-3d传代，0.25%胰酶+0.2消化2-3min，镜下观察细胞回缩变圆时终止消化，每次分3-5瓶。所有实验均采用对数生长期细胞。

b、蛋白表达水平的检测：取对数生长期的Raw264.9细胞，调整细胞密度为1×10⁵ cells/well，接种于96孔板，每孔200µL细胞悬液，再加入细菌菌悬液200µL，37℃，5%CO₂培养箱饱和湿度下培养48h。提取上述细胞经菌液作用48 小时后的总蛋白。将细胞用冷PBS 洗涤2 次，用50 µLRapa 裂解液（radioimmune precipitation assay buffer）裂解细胞，冰上30 钟后刮取细胞，以12000 rpm 4 ℃离心15 min，收集上清转移入新的1.5 mL 离心管中，BCA法测定蛋白浓度。取30 ug 蛋白样品经12% SDS -聚丙烯酰胺凝胶90 V 电压进行电泳分离，后电转移至硝酸纤维素滤膜上,用含有50 g/L 脱脂奶粉的T-BST [10 mM Tris-Cl(pH8.0), 150mM NaCl 和0.05% Tween20]封闭1 h，分别加入抗TNF-α 、IL-1β、IL-6、IL-8、STAT3、p-STAT3蛋白的抗体，4 ℃反应过夜, TBST 漂洗3 次，每次10 min。 HRP 标记的抗鼠IgG 二抗（15000）孵育1 h；TBST 漂洗3 次，用 Western blotting 印迹荧光检测试剂盒显示于 X 光片。结果用 Labwork 凝胶图像分析系统对胶片扫描，以内参的面积灰度值与实验组进行比较进行半定量分析。

6、体内建立癌症小鼠模型评价所筛选微生物的抗癌活性的强度：

（1）肿瘤模型的建立与分组：

纯系BALB／CA-n 裸鼠，10只，4～6 周龄，体重15～20 g，均为雌性，严格在SPF 条件下饲养，自由摄取水分和食物。随机将小鼠分为对应的模型组、对应的治疗组和空白组，每组10只。

取对数生长期的HT-29细胞，悬浮于100µL无菌PBS中，调整到细胞密度为5 ×10⁵ ，对模型组和治疗组裸鼠皮下注射，用尺子测量肿瘤的大小。空白组皮下注射无HT-29细胞的PBS。模型组和治疗组裸鼠均在细胞接种后48 h 后接受以下处理：

①模型组：100µL的PBS予以灌胃,隔天一次，共10 次。

②治疗组：含有5 ×10⁶个细菌的100µLPBS予以灌胃，隔天一次，共10 次。

③空白组：100µL 的PBS予以灌胃,隔天一次，共10 次。

每日测量肿瘤的大小和体重，并观察裸鼠的精神状况、皮肤、饮食及活动能力。

(2) ELISA 法测定血清中TNF-α 、IL-6、IL-8蛋白表达: 取每只裸鼠眼眶血0.2 ml，5000 rpm，10min 离心后吸出血清，-80 ℃保存，备用。实验开始时提前30 min从冰箱取出ELISA 试剂盒及待测标本，平衡至室温，在室温条件下使用，轻轻摇匀溶液，严格按照ELISA试剂盒步骤进行实验。

1) 实验前20min从冰箱中取出试剂盒，平衡至室温（20℃-25℃）

2) 按照说明，配置TNF-α 、IL-6、IL-8capture antibody。

3) 包被：取出所需数量的板条，capture antibody按照1:180稀释，每孔加入100µL,轻轻拍打，包被过夜。

4) 洗板：甩尽孔内液体，每孔加满wash buffer，静置30 秒后甩尽液体，在厚吸水纸上拍干,重复4次，每次用滤纸吸干。

5) 封闭：用reagent diluent每孔加入100µL室温包被至少1小时。

6) 洗板：甩尽孔内液体，每孔加满wash buffer，静置30 秒后甩尽液体，在厚吸水纸上拍干,重复4次，每次用滤纸吸干。

7) 建立标准曲线：准备7个EP管，每管加入样品稀释液150µL，第1管加标准品150µL,混匀后用移液器吸出150µL移至第二管，如此反复作对倍稀释至第7管。每管吸出100µL按从高到低浓度加入孔内，第8孔加100µL reagent diluent做空白对照。

8) 加样：待测品孔中每孔加入待测样品100µL。

9) 将反应板37℃放置120min。

10) 洗板：同前。

11) 每孔中加入一抗工作液100µL。

12) 将反应板37℃放置120min

13) 洗板：同前。

14) 每孔中加入酶标抗体工作液100µL。

15) 将反应板37℃避光放置20min

16）洗板：同前。

17）每孔中加入底物工作液100µL，避光放置20min。

18）每孔中加入终止液50µL。

19）在450nm处测定吸光值。

20）蛋白浓度计算：以标准品浓度作横坐标，OD₄₅₀值作纵坐标，绘制标准曲线。通过检测到样品的OD 值从而得出蛋白的浓度。

（3）Western blot 法测定裸鼠内TNF-α 、IL-1β、IL-6、IL-8、STAT3、p-STAT3蛋白的表达：

提取裸鼠移植瘤组织的总蛋白，BCA法对蛋白质定量。取30 ug 蛋白样品经12% SDS-聚丙烯酰胺凝胶90 V 电压进行电泳分离，之后电转移至硝酸纤维素滤膜上, 用有50 g/L去脂奶粉的T-BST(10 mM Tris-Cl，pH 8.0； 150 mM NaCl,和0.05% Tween20)封闭1 h，分别加入抗TNF-α 、IL-1β、IL-6、IL-8、STAT3、p-STAT3 的一抗（1:1000），4 ℃孵育过夜, TBST洗涤3 次，每次10 min。HRP 标记的抗鼠IgG 二抗（1：1000）室温孵育1 h，TBST洗涤3 次，每次10 min。用 Western blotting 印迹荧光检测试剂

盒显示于 X 光片。结果用 Labwork 凝胶图像分析系统对胶片扫描，以内参的面积灰度值与实验组进行比较进行半定量分析。

7、确定有抗癌活性的微生物：综合上述结果，确定和筛选出具有抗癌活性的微生物。

Claims (2)

1.一种可用于筛选粪便中具有抗癌活性微生物的方法，其特征是:

（1）取样者的选择：样品取自无癌症村的健康老人，年龄在50-60岁之间，6个月内没有使用过抗生素；

（2）样品的收集和保存：收集无癌症村健康人的新鲜粪便，转人厌氧环境，加入甘油，其体积为粪便和甘油总体积的50％，旋涡振荡器混匀，-80 ℃保存；

（3）样品菌群的分离与鉴定：培养基的配制，培养，挑菌接种，革兰染色，测序验证；

（4）体外研究细菌的生长特性：酸碱耐受实验酸，胆盐耐受实验，最适生长温度的确定，抑菌实验；

（5）体外实验筛选具有抗癌活性的微生物：细胞粘附实验，癌症细胞生长抑制实验，western blot法检测炎症因子的表达水平；

（6）体内建立癌症小鼠模型评价所筛选微生物的抗癌活性的强度：癌症模型的建立，ELISA 法测定血清中TNF-α ，IL-6、IL-8蛋白表达，western blot法检测炎症因子的表达水平；

（7）确定有抗癌活性的微生物：综合上述结果，确定和筛选出具有抗癌活性的微生物。

2.根据权利要求1所述的一种可用于筛选粪便中具有抗癌活性微生物的方法，其特征在于：所述无癌症村为江西省宜春市无癌症村。