CN101948902B - 念珠菌显色培养基、检测试剂盒及检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及念珠菌显色培养基、检测试剂盒及检测方法，属于微生物诊断领域，特别是医学微生物标本、药品及医疗器械卫生检验样品、公共卫生监测样品和食品(包括化妆品)卫生检验样品中酵母菌的培养和鉴定。本发明的显色培养基由基础培养基、加入了念珠菌特异性酶的混合显色底物氨基己糖苷酶和碱性磷酸酶底物和抑菌剂组成。本发明的检测试剂盒由所述显色培养基、含酶底物5-溴-4-氯-3-吲哚基-N-乙酰基-β-D-氨基半乳糖苷的鉴定纸片A和含酶底物5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-吡喃葡糖苷的鉴定纸片B组成。本发明所述的念珠菌显色培养基和检测试剂盒成本低、配置简单，所述方法能够快速、简便、准确地用于念珠菌的分离和鉴定。

Description

念珠菌显色培养基、检测试剂盒及检测方法

技术领域

本发明涉及微生物诊断领域，特别是医学微生物标本、药品及医疗器械卫生检验样品、公共卫生监测样品和食品(包括化妆品)卫生检验样品中酵母菌的培养和鉴定，尤其是念珠菌属细菌的分离培养和该属白色念珠菌、热带念珠菌、克柔氏念珠菌和光滑念珠菌等重要菌株的鉴别，以及对白色念珠菌的鉴定。 

背景技术

念珠菌(Candida spp.，也称假丝酵母)是一类真菌，不仅广泛存在于自然界里，通常也存在于正常人口腔、上呼吸道、肠道及阴道，一般在正常机体中数量少，不引起疾病，当机体免疫功能或一般防御力下降或正常菌群相互制约作用失调，则本菌大量繁殖并改变生长形式(芽生菌丝相)侵入细胞引起皮肤、粘膜及内脏器官急性、亚急性及慢性炎症，称为念珠菌病。念珠菌一直是医学微生物检验的重要病原菌之一。鉴于其致病性及分布的广泛性，对其重视程度已逐渐延伸到预防医学范畴，如药品及医疗器械卫生、公共卫生和食品(包括化妆品)卫生等领域对其实施检验和监测。 

目前对念珠菌的检测以传统方法为主，采取分离培养、镜检观察、生化鉴定等多个步骤，检测周期长，整个过程大约4-7天，操作繁琐，已不能满足对念珠菌快速、便利检测的需要，而且当样本中杂菌较多时会影响真正目标菌的识别。尽管近年来已有分子生物学、免疫学技术的应用，但一方面不能直接检测目标菌，不排除假阳性结果的出现，当结果为阳性时，仍需要分离出目标菌进行验证或者配合治疗方案的制定(如抗生素敏感试验)来确定。另一方面，需要专业技术人员操作、需要添置设备等。 

利用酶活性测定鉴别细菌是诊断微生物的一种有效手段，但过去由于底物种类较少、受pH影响较大、不稳定等缺点限制了这一技术的发展。 随着对致病菌研究的深入，陆续发现了更多反映细菌属性的特异性酶；通过化学合成技术合成的一系列新型酶底物，为这一技术的发展奠定了基础，因此，基于传统细菌培养理论，将人工合成的酶底物与支持细菌生长的多种营养物质相结合，开发出了显色培养基，使细菌在分离的同时得到有效鉴别，操作简便，大大提高了工作效率。 

在分离与鉴别念珠菌属细菌的培养基方面，加拿大专利CA2634325描述了利用甜土豆浸粉、酵母浸粉为培养基基础的主要原料，在基础培养基中添加显色剂5-溴-4-氯-3-吲哚基-N-乙酰基-β-D-氨基吡喃葡糖苷(5-Bromo-4-chloro-3-indolyl N-acetyl-β-D-glucopyranoside或X-N-acetyl-β-D-glucopyranoside)和荧光底物4-甲基伞形酮-N-乙酰基-β-D-氨基半乳糖苷(4MU-N-acetyl-β-D-galactosaminide)，通过观察菌落色泽(蓝色、黄色和白色)以及菌落是否产生荧光将念珠菌几个主要种区分开来，但一方面荧光不能通过肉眼直接观察，不太便利，另一方面浅黄色和乳白色不易分辨，这会导致在结果判断上出现偏差。日本专利JP2003310298，描述了一种通过5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-吡喃葡糖苷(X-gluc)底物将白色念珠菌和热带念珠菌与其它真菌区分开来的方法，但不能鉴别该属的其他种。Venitia M.Cooke(New Chromogenic Agar Medium for theIdentification of Candida spp.，Applied and Environmental Microbiology，Vol.68(7)：3622-3627，2002)描述了一种基于沙保罗培养基添加了测定白色念珠菌(C.albicans)和都柏林念珠菌(C.dubliniensis)的氨基葡糖苷酶活性的显色底物(VLPA-GlcNAc)来鉴别念珠菌属的显色培养基，白色念珠菌在该培养基上生长为呈红色点状的白色菌落，其他念珠菌则只能分为白色或粉色菌落而无法区分。A.Gaschet等(Evaluation of CandiSelect4，a newchromogenic medium for isolation and presumptive identification of Candidaspecies from clinical specimens，J.of Medical Mycology，V.18(2)，89-95，2008)描述了一种新的分离和鉴定临床标本中念珠菌属细菌的显色培养基CandiSelect4，该培养基和CHROMAgar Candida(科玛嘉公司)对念珠菌的分离效果一致，但二者对该属重要的白色念珠菌均不能获得完全满意的鉴定结果(少部分为假阳性结果)，也不能将都柏林念珠菌与白色念珠菌区 分开来，而且二者至少培养48h目标菌才能出现肉眼可分辨的色泽，最佳时间为72h。 

因此，本领域需要一种高效、快速、低廉、操作简便的方法，进行念珠菌的检测。 

发明内容

本发明的一个目的在于，提供一种选择性高、检测周期短、成本低、可操作性强，适用于多种检测样本中念珠菌的分离与鉴别，在分离的同时能即时区分该属主要致病真菌白色念珠菌、热带念珠菌、克柔氏念珠菌、光滑念珠菌等念珠菌的显色培养基和对白色念珠菌进行确证以及将都柏林念珠菌与白色念珠菌区分开的检测试剂盒。 

本发明的另一个目的在于，提供快速、简便、高效地检测样本中念珠菌的方法。 

本发明的还一个目的在于，提供本发明的念珠菌显色培养基或念珠菌检测试剂盒在制备用于检测念珠菌的诊断剂中的应用。 

针对上述发明目的，本发明提供以下技术方案： 

在一个实施方案中，本发明提供了一种念珠菌显色培养基，其包含： 

酵母粉        2～5重量份， 

麦芽浸粉      2～5重量份， 

蛋白胨        5～10重量份， 

葡萄糖        10～20重量份， 

琼脂          12～18重量份， 

氯霉素        0.02～0.06重量份， 

混合显色底物  1～2.5重量份(由氨基己糖苷酶和碱性磷酸酶底物1∶1(w/w)组成)， 

甘氨酸        0.5～4重量份，pH 6.2±0.2。 

在一个实施方案中，所述氨基己糖苷酶和碱性磷酸酶底物分别为5-溴-4-氯-3-吲哚基-N-乙酰基-β-D-氨基葡糖苷(5-bromo-4-chloro-3-indolylN-acetyl-β-D-glucosaminide)和5-溴-6-氯-3-吲哚基磷酸酯对甲苯胺盐(5-bromo-6-chloro-3-indolyl phosphate p-toluidine salt)。所述的氨基己糖苷 酶和碱性磷酸酶底物5-溴-4-氯-3-吲哚基-N-乙酰基-β-D-氨基葡糖苷可例如从sigma公司购得，而碱性磷酸酶底物5-溴-6-氯-3-吲哚基磷酸酯对甲苯胺盐可例如从Fluka公司购得。 

优选地，根据本发明的显色培养基包含： 

酵母粉          3重量份， 

麦芽浸粉        3重量份， 

蛋白胨          5重量份， 

葡萄糖          20重量份， 

琼脂            15重量份， 

氯霉素          0.05重量份， 

混合显色底物    2重量份(由氨基己糖苷酶和碱性磷酸酶底物组成，同上) 

甘氨酸          1重量份。 

根据本发明的一个实施方案，本发明提供检测试剂盒，其包含本发明的念珠菌显色培养基。 

在一个实施方案中，本发明的检测试剂盒进一步包含鉴定纸片A和B，其中A为含酶底物5-溴-4-氯-3-吲哚基-N-乙酰基-β-D-氨基半乳糖苷(X-N-acetyl β-D-galactosaminide)的鉴定纸片；B为含酶底物5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-吡喃葡糖苷(X-gluc)的鉴定纸片。 

在一个优选的实施方案中，所述检测试剂盒由白色念珠菌显色培养基、鉴定纸片A和B组成， 

其中所述白色念珠菌显色培养基包含： 

酵母粉        2～5重量份， 

麦芽浸粉      2～5重量份， 

蛋白胨        5～10重量份， 

葡萄糖        10～20重量份， 

琼脂          12～18重量份， 

氯霉素        0.02～0.06重量份， 

混合显色底物  1～2.5重量份(由氨基己糖苷酶和碱性磷酸酶底物 组成，同上)； 

A为含酶底物5-溴-4-氯-3-吲哚基-N-乙酰基-β-D-氨基半乳糖苷的鉴定纸片； 

B为含酶底物5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-吡喃葡糖苷的鉴定纸片。 

在一个更优选的实施方案中，所述检测试剂盒由白色念珠菌显色培养基、鉴定纸片A和B组成， 

其中所述白色念珠菌显色培养基包含： 

酵母粉          3重量份， 

麦芽浸粉        3重量份， 

蛋白胨          5重量份， 

葡萄糖          20重量份， 

琼脂            15重量份， 

氯霉素          0.05重量份， 

混合显色底物    2重量份(由氨基己糖苷酶和碱性磷酸酶底物组成，同上)， 

甘氨酸          1重量份， 

A为含酶底物5-溴-4-氯-3-吲哚基-N-乙酰基-β-D-氨基半乳糖苷的鉴定纸片； 

B为含酶底物5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-吡喃葡糖苷的鉴定纸片。 

注：上述底物为商购获得，如sigma-aldrich，或自行合成。 

另一方面，本发明提供检测念珠菌的方法，所述方法包括使用本发明的念珠菌显色培养基或检测试剂盒。 

本发明的方法可以用于所有领域，包括医学微生物标本、药品及医疗器械卫生检验样品、公共卫生监测样品和食品(包括化妆品)卫生检验样品中念珠菌的检测和鉴定。在一个实施方案中，本发明的方法用于工业制品中的念珠菌的检测。在另一个实施方案中，本发明的方法不用于疾病的诊断。 

在一个实施方案中，本发明的方法进一步包括制备显色平板、制作鉴定纸片、样本处理、接种显色平板和进行鉴定试验的步骤。 

在一个优选的实施方案中，本发明的方法包括如下步骤： 

制备显色平板：将所述显色培养基干粉加入水中，加热融化，混合均匀后，调整pH6.2±0.2，煮沸，待冷至适于铺板的温度，倒平板，备用； 

样本处理； 

接种培养：将样品处理液、经过非选择性或选择性增菌的培养液涂布或划线接种于显色平板上，35℃±1℃培养24h-48h；和 

结果分析：若平板上出现淡绿色或绿色菌落，说明样本中存在白色念珠菌；出现深蓝色或青色菌落，说明样本中存在热带念珠菌；出现浅紫色或紫红色并且边缘为白色的扁平菌落，说明样本中存在克柔氏念珠菌；出现浅粉色或粉红色的光滑菌落，为光滑念珠菌或其他酵母菌。 

在另一个优选的实施方案中，本发明的方法包括如下步骤： 

制备显色平板：将所述显色培养基干粉加入水中，加热融化，混合均匀后，调整pH6.2±0.2，煮沸，待冷至适于铺板的温度，倒平板，备用； 

鉴定纸片的制作：将滤纸片置于玻璃皿中,高压灭菌。用分析天平称取4mg合成底物溶于1ml蒸馏水中,用以浸透并均匀分布于滤纸片，置于35℃温箱烘干备用； 

样本处理：按各领域的规范处理方法，如医学微生物标本按《全国临床检验操作规程》中的方法处理；药品及医疗器械卫生检验样品按《中国药典》中规定的方法处理； 

接种培养：将样品处理液、经过非选择性或选择性增菌的培养液涂布或划线接种于显色平板上，35℃±1℃培养24h-48h； 

确证试验：将拟验证的菌落（淡绿色或绿色菌落）转接于制备好的YM平板上30±2℃培养18-24h。将鉴定纸片A和B分别放在玻片上，加1滴pH6.5磷酸盐缓冲液浸湿。以接种环取菌落涂于纸片上。35℃下孵育1h观察结果，菌落及周围显现绿色为阳性,无绿色者为阴性。 

结果分析：若在接种培养步骤中在显色平板上出现淡绿色或绿色菌落，而在确证实验结果是A和B均为阳性，说明样本中存在白色念珠菌；若A为阳性，B为阴性，说明样本中存在都柏林念珠菌；若A和B均为阴性，则为其他念珠菌。此外，如果显色平板上出现深蓝色或青色菌落，可能为热带念珠菌；出现浅紫色或紫红色并且边缘为白色的扁平菌落，可能为克柔氏念珠菌；出现浅粉色或粉红色的光滑菌落，可能为光滑念珠菌或其他酵母菌。 

在一个优选的实施方案中，根据本发明的方法，所述制备显色平板包括：每1000mL水中加入49g显色培养基干粉，加热融化，混合均匀后，调整pH 6.2±0.2，煮沸2min，待冷至约50℃，倒平板，备用，而所述样本处理可以按各领域规范方法进行处理，如医学标本按照全国临床检验操作规程。 

再一方面，本发明提供所述的念珠菌显色培养基或检测试剂盒在制备用于检测念珠菌的诊断剂中的应用。 

本发明针对现有技术的不足，利用细菌特异性酶，在基础培养基中添加组合式人工合成酶底物，当目标菌在培养基上生长时，底物被分解，发色基团使菌落着色，从而使目标菌得到初步区分，再通过确证实验使目标菌得到准确鉴别。首先，分析念珠菌属中主要菌种白色念珠菌、热带念珠菌、克柔氏念珠菌代谢过程中产生的特异性酶，根据主要念珠菌所产生的酶的差异，将对应底物进行组合，添加于可供念珠菌生长的基础培养基中，为保证培养基在鉴别念珠菌方面的特异性，添加了抑制目标菌以外的细菌生长抑菌剂，三者相结合组成念珠菌显色培养基。其中蛋白胨为念珠菌生长提供氮源；酵母粉和麦芽浸粉为念珠菌生长提供维生素和必要的生长因子；葡萄糖为念珠菌生长提供碳源；人工合成的混合酶底物被念珠菌代谢过程中产生的特异性酶降解后释放不同色素；甘氨酸为念珠菌快速和旺盛生长补充氮源；氯霉素广谱抑制其他细菌的生长。其次，本发明所述的检测试剂盒除显色培养基外还提供了进一步确定白色念珠菌的鉴定纸片A和B，通过显色底物5-溴-4-氯-3-吲哚基-N-乙酰基-β-D-氨基半乳糖苷和5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-吡喃葡糖苷测定疑似菌株的半乳糖苷酶活性和葡萄糖苷酶活性，提高了白色念珠菌鉴定结果的准确性，并且能够将都柏林念珠菌与白色念珠菌区分开来。 

本发明开发的念珠菌显色培养基和检测试剂盒，克服了目前应用较广的沙保罗培养基在分离念珠菌时不能区分念珠菌属各个种的缺点；与类似 产品相比，保证了检测结果的可靠性；优化后的培养基配方使念珠菌的生长速度加快，培养24h即出现菌落特征，在对念珠菌中重要的白色念珠菌、热带念珠菌、克柔氏念珠菌、光滑念珠菌检测过程中，准确、快速、高效。 

使用本发明的念珠菌显色培养基、检测试剂及检测方法操作简便，适用于医学微生物标本、药品及医疗器械卫生检验样品、公共卫生监测样品和食品(包括化妆品)卫生检验样品中念珠菌的检测，且价格低廉，具有很好的应用推广前景。 

具体实施方式

实施例1：本发明所述的念珠菌显色培养基营养能力评价 

1.培养基配制 

按表1中的配方称取各组分，配制成两种培养基，各加水1000mL，加热融化后，调整pH为6.2，煮沸2min，冷却至50℃，倒平板，备用。 

表1培养基组分(g/L) 

^*氨基己糖苷酶和碱性磷酸酶底物分别为5-溴-4-氯-3-吲哚基-N-乙酰 基-β-D-氨基葡糖苷和5-溴-6-氯-3-吲哚基磷酸酯对甲苯胺盐。 

2.接种 

将白色念珠菌(C.albicans，ATCC26278；10231)、热带念珠菌(C.tropicalis，ATCC 750，1369)、克柔氏念珠菌(C.krusei，ATCC 6258，34135)、光滑念珠菌(C.glabrata，ATCC 2001)接种于酵母霉菌肉汤(Yeast MoldBroth，BD产品，货号：271120)，35℃培养24-48h，然后用接种环取一环划线接种于显色培养基上，翻转平板于35℃培养48h。 

3.结果 

表2 4株念珠菌的生长状况和菌落色泽 

实施例2：本发明所述的念珠菌显色培养基应用条件测试 

1培养基配制 

按表2中的配方称取各组分配制培养基，加水1000mL，加热融化后，调整pH为6.2，煮沸2min，冷却至50℃，倒平板，备用。 

表3培养基3组分(g/L) 

^*氨基己糖苷酶和碱性磷酸酶底物分别为5-溴-4-氯-3-吲哚基-N-乙酰基-β-D-氨基葡糖苷和5-溴-6-氯-3-吲哚基磷酸酯对甲苯胺盐。 

2接种 

将白色念珠菌(C.albicans，ATCC26278；10231)、热带念珠菌(C.tropicalis，ATCC 750，1369)、克柔氏念珠菌(C.krusei，ATCC 6258，34135)、光滑念珠菌(C.glabrata，ATCC 2001)接种于酵母霉菌肉汤(Yeast MoldBroth，BD产品，货号：271120)，35℃培养24-48h，然后用接种环取一环划线接种于显色培养基上，每一种菌接种4块平板，分为2组(每组2块)，翻转平板，将第1组放置在25℃培养箱中、第2组放置在36℃培养箱中培养，48h后观察菌落形态。 

3结果 

表4不同温度下培养的念珠菌生长状况和菌落特征 

实施例3：本发明所述的念珠菌显色培养基与沙保罗培养基的灵敏度比较试验 

1.本发明的显色培养基平板制备 

取酵母粉3.0g、麦芽浸粉3.0g、蛋白胨5.0g、葡萄糖20.0g、琼脂15g、氯霉素0.05g、混合显色底物2.0g、甘氨酸1.0g、水1000mL，加热融化后，调整pH为6.4，煮沸2min，冷却至50℃，倒平板，备用。 

2.对照培养基平板制备 

(1)沙保罗培养基(美国BD公司，货号：210950，以下简称SDA) 

称取47g干粉(BD公司产品，编号：210950，酪胨5.0g，蛋白胨5.0g，葡萄糖20.0g，琼脂17.0g)，加入1000mL蒸馏水，121℃高压15min，冷却至50℃，倒平板，备用。 

(2)科玛嘉显色培养基(CHROMagar Candida培养基，来自法国bioMérieux，以下简称CHR) 

在可配制1000mL的干粉(蛋白胨10.0g，葡萄糖20.0g，混合显色剂2.0g，氯霉素0.5g，琼脂15.0g)中加1000mL蒸馏水，煮沸2min，冷却至50℃，倒平板，备用。 

3.接种 

将白色念珠菌(C.albicans，ATCC26278；10231)接种于酵母霉菌肉汤(Yeast Mold Broth，BD产品，货号：271120)，35℃培养24-48h，然后取0.1mL培养液加入到10mL 0.85％灭菌生理盐水制成10^-2菌悬液，然后进行10倍梯度稀释，取10^-4-10^-6浓度菌液各0.1mL分别涂布于本发明的显色培养基平板以及以上制备的沙保罗琼脂平板和科玛嘉显色培养基平板上，翻转平板于35℃培养36-48h。 

4.结果分析 

纯菌液涂布各平板结果见表5，对25-250cfu/mL的菌落数进行统计学分析，三者没有显著性差异(P＞0.05)，可以达到相同的检测限。 

表5白色念珠菌在各培养基上的菌落数(logcfu/mL) 

实施例4：本发明所述的显色培养基选择性分离效果 

1.本发明的显色培养基平板的制备 

取酵母粉3.0g、麦芽浸粉3.0g、蛋白胨5.0g、葡萄糖20.0g、琼脂15g、氯霉素0.05g、混合显色底物(氨基己糖苷酶和碱性磷酸酶重量比为1∶1)2.0g、甘氨酸1.0g、水1000mL，加热融化后，调整pH为6.4，煮沸2min，冷却至50℃，倒平板，备用。 

2.接种 

将白色念珠菌(C.albicans，ATCC26278；10231)、热带念珠菌(C.tropicalis，ATCC 750，1369)、克柔氏念珠菌(C.krusei，ATCC 6258，34135)、光滑念珠菌(C.glabrata，ATCC 2001)接种于酵母霉菌肉汤(Yeast MoldBroth，BD产品，货号：271120)，将铜绿假单胞菌接种于TSB培养基复活，35℃培养24-48h，然后各取0.1mL培养液加入到10mL 0.85％灭菌生理盐水制成约10^-2菌悬液，用无菌棉签沾取适量菌悬液在上述显色培养基表面上小区域(约1cm²)内轻轻滚动，再用接种环从小区域划线，翻转平板于35℃培养36-48h。 

3.结果分析 

培养48h后，易于辨别出绿色的白色念珠菌、蓝色的热带念珠菌和紫红色的克柔氏念珠菌，说明本发明所述的念珠菌显色培养基对重要念珠菌具有较好的选择功能并能体现出本发明所述培养基的特征。 

实施例5：本发明所述的念珠菌显色培养基、检测试剂盒特异性的验 证 

1.念珠菌显色培养基的配制 

取酵母粉3.0g、麦芽浸粉3.0g、蛋白胨5.0g、葡萄糖20.0g、琼脂15g、氯霉素0.05g、混合显色底物(氨基己糖苷酶和碱性磷酸酶重量比为1∶1)2.0g、甘氨酸1.0g、水1000mL，加热融化后，调整pH为6.4，煮沸2min，冷却至50℃，倒平板，备用。 

2.接种 

将白色念珠菌(C.albicans，ATCC26278；10231)、热带念珠菌(C.tropicalis，ATCC 750，1369)、克柔氏念珠菌(C.krusei，ATCC 6258，34135)、光滑念珠菌(C.glabrata，ATCC 2001)、高加索乳念珠菌(C.kefyrATCC66028)、葡萄牙念珠菌(C.lusitaniae，ATCC 34449)、近平滑念珠菌(C.parapsilosis，ATCC22019)、都柏林念珠菌(C.dubliniensis，CCCCM IDC8a)接种于酵母霉菌肉汤(Yeast Mold Broth，BD产品，货号：271120)，35℃培养24-48h，然后用接种环取一环划线接种于显色培养基上，翻转平板于35℃培养36-48h，大肠杆菌、金黄色葡萄球菌接种于TSB培养基复活，以同样方式接种显色培养基上培养。 

3.确证实验 

5-溴-4-氯-3-吲哚基-N-乙酰基-β-D-氨基半乳糖苷可购自英国glycosynth公司； 

5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-吡喃葡糖苷可购自美国Sigma公司。 

鉴定纸片A和B的制备：将滤纸片A和B置于玻璃皿中，高压灭菌；用分析天平称取5-溴-4-氯-3-吲哚基-N-乙酰基-β-D-氨基半乳糖苷和5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-吡喃葡糖苷各4mg分别溶于1ml蒸馏水中；用5-溴-4-氯-3-吲哚基-N-乙酰基-β-D-氨基半乳糖苷溶液浸透并均匀分布于滤纸片A，得到鉴定纸片A，而用5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-吡喃葡糖苷溶液浸透并均匀分布于滤纸片B，得到鉴定纸片B；将鉴定纸片A和B置于35℃温箱烘干备用； 

将拟验证的菌落(淡绿色或绿色菌落)转接于制备好的YM平板上(BD产品，货号：271210)30±2℃培养18-24h。将鉴定纸片A和B分别放在 玻片上，加1滴pH 5.5磷酸盐缓冲液浸湿。以接种环取菌落浓涂于纸片上。35℃下孵育30min观察结果，菌落及周围显现绿色为阳性，无绿色者为阴性。 

4.结果及分析 

白色念珠菌为浅绿色或绿色菌落；热带念珠菌为深蓝色或青色菌落；克柔氏念珠菌为浅紫色或紫红色并且边缘为白色的扁平菌落；光滑念珠菌为浅粉色或粉红色的菌落，其他酵母菌为乳白色菌落。说明念珠菌显色培养基具有较好的特异性。 

表6念珠菌显色培养基特异性实验 

虽然已经对本发明的具体实施方案进行了描述，但是本领域技术人员应认识到，在不偏离本发明的范围或精神的前提下可以对本发明进行多种改变与修饰。因而，本发明意欲涵盖落在权利要求书及其同等物范围内的所有这些改变与修饰。 

Claims (6)

1.念珠菌显色培养基，其特征在于所述培养基由以下成分组成：

混合显色底物，其由氨基己糖苷酶的底物和碱性磷酸酶的底物组成，1～2.5重量份，和

甘氨酸   0.5～4重量份，pH6.2±0.2。

2.如权利要求1所述的念珠菌显色培养基，其特征在于所述培养基由以下成分组成：

混合显色底物，其由氨基己糖苷酶的底物和碱性磷酸酶的底物组成，2重量份，和

甘氨酸   1重量份，pH6.2±0.2。

3.念珠菌检测试剂盒，其包含权利要求1或2所述的念珠菌显色培养基，还进一步包含鉴定纸片A和B，其中鉴定纸片A为含酶底物5-溴-4-氯-3-吲哚基-N-乙酰基-β-D-氨基半乳糖苷的鉴定纸片，而鉴定纸片B为含酶底物5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-吡喃葡糖苷的鉴定纸片。

4.一种检测念珠菌的方法，所述方法使用权利要求1或2所述的念珠菌显色培养基或权利要求3所述的念珠菌检测试剂盒检测工业制品。

5.如权利要求4所述的方法，所述方法用于药品、食品和化妆品的检测。

6.权利要求1或2所述的念珠菌显色培养基或权利要求3所述的念珠菌检测试剂盒在制备用于检测念珠菌的诊断剂中的应用。