CN105463056B - 白色念珠菌快速培养并显色的培养基及检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及白色念珠菌快速培养并显色的培养基、检测试剂盒及检测方法，属于微生物培养领域。本发明的显色培养基由能够快速培养白色念珠菌的各个组分构成，这些特定的组分构成的显色特性培养基能够快速鉴定白色念珠菌。为医学诊断提供了快速便捷的诊断途径。本发明所述的白色念珠菌快速培养并显色的培养基成本低、配置简单，所述方法能够快速、简便、准确地用于白色念珠菌的分离和鉴定。

Description

白色念珠菌快速培养并显色的培养基及检测方法
技术领域
本发明涉及微生物培养领域，特别是医学微生物标本、药品及医疗器械卫生检验样品、公共卫生监测样品和食品(包括化妆品)卫生检验样品中白色念珠菌的培养和鉴定。
背景技术
念珠菌是ー种腐物寄生菌，广泛存在于自然界。是人体正常菌群之一，平时主要生存于人体的口腔、皮肤、粘膜、消化道、阴道及其他脏器中。正常人群白色的带菌率可高达40％；从阴道粘膜分离出来的念珠菌为白色，而白色念珠菌(Candida albican)的致病性最強。白色念珠菌(简称白念，Candida albicans,CA)、热带假丝酵母菌(简称热带，Candida tropicalis,CT)和光滑假丝酵母菌(简称光滑，Candida glabrata,CG)是其中的主要致病菌，其分布广泛，感染类型多祥，已成为临床抗感染治疗的难点。
虽然目前PCR快速检测技术具有较好的准确性，但是由于PCR检测需要对仪器和设备有较高的要求，采购成本也高，并不适合大面积的推广。而目前对念珠菌的检测以传统方法为主，采取分离培养、镜检观察、生化鉴定等多个步骤，检测周期长，整个过程大约4-7天。
利用酶活性测定鉴别细菌是诊断微生物的一种有效手段，但过去由于底物种类较少、受PH影响较大、不稳定等缺点限制了这一技术的发展。随着对致病菌研究的深入，陆续发现了更多反映细菌属性的`特异性酶；通过化学合成技术合成的一系列新型酶底物，为这一技术的发展奠定了基础，因此，基于传统细菌培养理论，将人工合成的酶底物与支持细菌生长的多种营养物质相结合，开发出了显色培养基，使细菌在分离的同时得到有效鉴别，操作简便，大大提高了工作效率。
在分离与鉴别念珠菌属细菌的培养基方面，加拿大专利CA2634325描述了利用甜土豆浸粉、酵母浸粉为培养基基础的主要原料，在基础培养基中添加显色剂和荧光底物，通过观察菌落色泽(蓝色、黄色和白色)以及菌落是否产生荧光将念珠菌几个主要种区分开来，但一方面荧光不能通过肉眼直接观察，不太便利，另一方面浅黄色和乳白色不易分辨，这会导致在结果判断上出现偏差。日本专利JP2003310298，描述了一种通过5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-吡喃葡糖苷(X-gluc)底物将白色念珠菌和热带念珠菌与其它真菌区分开来的方法，但不能鉴别该属的其他种。
因此，本领域需要一种高效、快速、低廉、操作简便的方法，进行念珠菌的检测，特别是致病性较强的白色念珠菌的特异性快速培养的方法。
发明内容
本发明的目的在于，提供一种选择性高、检测周期短、成本低、可操作性强，适用于白色念珠菌的分离与鉴别。
本发明的另一个目的在于，提供快速、简便、高效地检测样本中念珠菌的方法。
本发明的还一个目的在于，提供本发明的白色念珠菌显色培养基或白色念珠菌检测试剂盒在制备用于检测白色念珠菌的诊断剂中的应用。
针对上述发明目的，本发明提供以下技术方案:
在一个实施方案中，本发明提供了一种白色念珠菌显色培养基，其由如下组分组成:
酵母粉20g，蛋白胨15g，氯化锂1g，多粘菌素B 0.5g，葡萄糖5g，4-甲基伞形酮-D-葡萄糖苷0.2g，5溴-6氯-3吲哚-β-D-葡萄糖苷0.1g，碳酸钠3.8g，琼脂20g，氯霉素0.5g，甘氨酸0.5g，谷胱甘肽2g，硫酸锌4g，pH 6.0，超纯水补足至1000ml。
另一方面，本发明提供检测白色念珠菌的方法，所述方法包括使用本发明的白色念珠菌显色培养基或检测试剂盒。
本发明的方法可以用于所有领域，包括医学微生物标本、药品及医疗器械卫生检验样品、公共卫生监测样品和食品(包括化妆品)卫生检验样品中白色念珠菌的检测和鉴定。在一个实施方案中，本发明的方法用于工业制品中的念珠菌的检测。
具体实施
方式
实施例1.培养基配制
按酵母粉20g，蛋白胨15g，氯化锂1g，多粘菌素B 0.5g，葡萄糖5g，4-甲基伞形酮-D-葡萄糖苷0.2g，5溴-6氯-3吲哚-β-D-葡萄糖苷0.1g，碳酸钠3.8g，琼脂20g，氯霉素0.5g，甘氨酸0.5g，谷胱甘肽2g，硫酸锌4g的配方称取各组分，定容至1000mL,配制成培养基，灭菌，倒平板，备用。
实施例2白色念珠菌培养实验
1.接种
将白色念珠菌ATCC10231、热带念珠菌、克柔氏念珠菌、光滑念珠菌、大肠杆菌接种于酵母肉汤，30℃培养48h，然后用接种环取一环划线接种于显色培养基上，翻转平板于30℃培养24h。
1.结果
2.
实施例3:本发明所述的白色念珠菌显色培养基与现有技术的培养基的灵敏度比较试验
1.本发明的显色培养基平板制备：按照实施例1的方法制备。
2.对照培养基平板制备
(I)沙保罗培养基(美国BD公司，货号:210950，以下简称SDA)
称取47g干粉(BD公司产品，编号:210950，酪胨5.0g，蛋白胨5.0g，葡萄糖20.0g，琼脂17.0g),加入1000mL蒸懼水，121℃高压15min,冷却至50℃,倒平板,备用。
(2)科玛嘉显色培养基(CHROMagar Candida培养基,来自法国bioM6rieux,以下简称CHR)
在可配制1000mL的干粉(蛋白胨10.0g，葡萄糖20.0g，混合显色剂2.0g，氯霉素0.5g,琼脂15.0g)中加1000mL蒸懼水，煮沸2min,冷却至50℃，倒平板，备用。
(3)念珠菌显色培养基：取酵母粉3.0g、麦芽浸粉3.0g,蛋白胨5.0g、葡萄糖20.0g,琼脂15g、氯霉素0.05g、混合显色底物2.0g、甘氨酸1.0gdjC 1000mL,加热融化后,调整pH为6.4,煮沸2min,冷却至50℃，倒平板，备用。
3.接种
将白色念珠菌ATCC10231接种于酵母肉汤，35℃培养24_48h，然后取少量培养液制成102菌悬液，然后进行10倍梯度稀释，取菌液0.1mL分别涂布于本发明的显色培养基平板以及以上制备的现有技术的培养基平板上，翻转平板于35℃培养24h，同时做另外一组，分别在于30℃培养24h。
4.结果分析
由此可以看出，本申请的培养基具有特异性的鉴定白色念珠菌的能力，白色念珠菌在该培养基上具有较快的生长速度，并且能够通过颜色快速的鉴定。
实施例4:本发明所述的白色念珠菌显色培养基与现有技术的培养基的准确性试验
将实施例3中培养出的单菌落，采用菌落PCR的方法，直接进行PCR鉴定，鉴定40个单菌落(具体方法参见熊延婧等，J of Wannan Medical college,2011,30(5)所述的方法)，鉴定结果如下：
本申请培养基：40个结果都是阳性，准确率100％；
沙保罗培养基：38个为阳性，准确率95％；
科玛嘉：38个为阳性，准确率95％；
念珠菌显色培养基：37个为阳性，92.5％。
由此说明，本发明的培养基具有较好的特异性，可以实现特异性的分别鉴定白色念珠菌。

Claims (3)

1.一种白色念珠菌快速培养并显色的培养基，其特征在于所述培养基包含以下成份：酵母粉20g，蛋白胨15g，氯化锂1g，多粘菌素B 0.5g，葡萄糖5g，4-甲基伞形酮-D-葡萄糖苷0.2g，5溴-6氯-3吲哚-β-D-葡萄糖苷0.1g，碳酸钠3.8g，琼脂20g，氯霉素0.5g，甘氨酸0.5g，谷胱甘肽2g，硫酸锌4g，pH 6.0，超纯水补足至1000ml。
2.白色念珠菌检测试剂盒，其包含权利要求1所述的白色念珠菌快速培养并显色培养基。
3.一种检测念珠菌的方法，所述方法使用权利要求1所述的白色念珠菌快速培养并显色培养基或权利要求2所述的白色念珠菌检测试剂盒，所述方法用于药品、食品和化妆品的检测。
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