CN111286474A - 副干酪乳杆菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一副干酪乳杆菌及其应用，涉及到微生物领域，基于目前存在的乳酸菌存在的品种少、产量低以及应用不广泛的问题，提供了一种新的具有抗菌效果的菌株，其中所述副干酪乳杆菌的保藏编号CCTCC NO:M 2016667。

Description

副干酪乳杆菌及其应用

技术领域

本发明涉及到微生物领域，尤其涉及到副干酪乳杆菌及其应用。

背景技术

新世纪以来，食品中化学防腐剂的大量使用严重威胁着人类健康，造成人体的过敏反应和体内菌群失衡。抗生素的滥用以及动物源食品中的药物残留导致的抗生素耐药性问题也对食品安全、公众健康和畜牧生产造成了重要影响。因此，寻找安全、高效、绿色的天然食品防腐剂和抗生素替代品成为发展食品工业、保障人类身体健康的世界趋势。而乳酸菌作为被公认为是安全的食品级微生物，由于自身及其细菌素的安全和益生特性，使其代替化学防腐剂达到食品防腐保鲜以及代替抗生素作为饲料添加剂展现出独特的优越性，成为近年来的研究热点。

乳酸菌细菌素因其良好的抗菌作用和易被酶解消化等特点，在食品防腐、生物医药和保健食品开发等领域具有应用广阔前景。但是目前唯一获准作为食品防腐剂使用的乳链球菌素Nisin对革兰氏阴性菌和霉菌的抑制效果比较差，而其他乳酸菌细菌素还存在品种少、产量低、应用不广泛等问题，因此寻找新型的广谱乳酸菌素，并对其进行细致的基础研究和开发应用研究，对于推动乳酸菌细菌素在食品工业的应用具有重要意义。

发明内容

本发明的一个目的在于提供一副干酪乳杆菌及其应用，其中所述副干酪乳杆菌具有广谱抗菌作用的乳酸菌优势菌株。

本发明的另一目的在于提供一副干酪乳杆菌及其应用，其中所述副干酪乳杆菌产生的抑菌物质中含有细菌素。

本发明的另一目的在于提供一副干酪乳杆菌及其应用，其中所述副干酪乳杆菌产生的抑菌物质适用于食品加工。

本发明的另一目的在于提供一副干酪乳杆菌及其应用，其中所述副干酪乳杆菌产生的抑菌物质对热稳定。

根据本发明的一方面，本发明提供了一副干酪乳杆菌，其所述副干酪乳杆菌的保藏编号CCTCC NO:M 2016667。

根据本发明的另一方面，本发明提供了一副干酪乳杆菌的应用，应用安全有效量的副干酪乳杆菌和/所述副干酪代谢产物，其中所述副干酪乳杆菌的保藏编号CCTCC NO:M2016667。

根据本发明的至少一个实施例，所述副干酪乳杆菌的代谢产物为蛋白质或者是多肽。

根据本发明的另一方面，本发明提供了一副干酪乳杆菌的应用，应用保藏编号CCTCC NO:M 2016667的副干酪乳杆菌于发酵。

根据本发明的至少一个实施例，所述副干酪乳杆菌在30～37℃环境下发酵。

根据本发明的另一方面，本发明提供了一副干酪乳杆菌的应用，应用保藏编号CCTCC NO:M 2016667的副干酪乳杆菌于抑菌。

根据本发明的至少一个实施例，副干酪乳杆菌应用于抑制致病菌鼠伤寒沙门氏菌CMCC 50015；或者单增李斯特氏菌LM1；或者是鼠伤寒沙门氏菌CMCC 50015；或者是枯草芽孢杆菌BAS2。

根据本发明的另一方面，本发明提供了一生产方法，其包括如下步骤：

在适合培养的条件下，对于保藏编号CCTCC NO:M 2016667的副干酪乳杆菌进行培养，从而获得培养产物。

根据本发明的至少一个实施例，所述副干酪乳杆菌在30～37℃环境下发酵。

根据本发明的至少一个实施例，所述副干酪乳杆菌以1％～3％的接种量发酵。

根据本发明的至少一个实施例，所述副干酪乳菌被保藏在-80℃甘油管。

根据本发明的至少一个实施例，所述副干酪乳菌在固体培养基进行活化，然后在液体培养基进行培养。

根据本发明的至少一个实施例，所述副干酪乳菌在液体培养基中37℃培养 24小时后，以接种量2％在更大容量的液体培养基中培养。

根据本发明的至少一个实施例，所述培养产物在40℃至100℃具有抑菌活性。

根据本发明的至少一个实施例，所述培养产物在酸性环境中具有抑菌活性。

根据本发明的至少一个实施例，所述培养产物对于致病菌鼠伤寒沙门氏菌CMCC50015、单增李斯特氏菌LM1、藤黄微球菌10209、蝇葡萄菌、鼠伤寒沙门氏菌CMCC 50015或者枯草芽孢杆菌BAS2具有抑菌活性。

根据本发明的另一方面，本发明提供了一细菌素，其通过保藏编号CCTCC NO:M2016667的副干酪乳杆菌生产。

根据本发明的至少一个实施例，所述细菌素应用于酸性环境的抑菌。

根据本发明的至少一个实施例，所述细菌素应用于食品生物防腐剂。

附图说明

图1是根据本发明的一个较佳实施例的乳酸菌分离培养基菌株生长状态的示意图。

图2是根据本发明的排除有机酸对抑菌活性的影响的示意图。

图3是根据本发明的一较佳实施例的菌株ZFM54的菌落形态的示意图。

图4是根据本发明的一较佳实施例的菌株ZFM54的革兰氏染色检验的示意图。

图5是根据本发明的一较佳实施例的ZFM54的16S rDNA扩增产物电泳图的示意图。

图6是根据本发明的一较佳实施例的菌株ZFM54的16S rDNA基因序列系统进化树的示意图。

图7是根据本发明的一较佳实施例的细菌素效价标准曲线图。

图8是根据本发明的一较佳实施例的副干酪乳杆菌ZFM54生长曲线与抑菌活性曲线示意图。

图9是根据本发明的培养温度对于副干酪乳杆菌ZFM54抑菌活性的影响示意图。

图10是根据本发明的不同接种量对于副干酪乳杆菌ZFM54抑菌活性的影响示意图。

图11A是根据本发明的XAD-16大孔树脂洗脱组分对指示菌藤黄微球菌 10209的抑菌活性示意图。

图11B是根据本发明的XAD-16大孔树脂洗脱组分对指示菌单增李斯特氏菌 LM1的抑菌活性示意图。

图11C是根据本发明的XAD-16大孔树脂洗脱组分对指示菌鼠伤寒沙门氏菌 CMCC50015的抑菌活性示意图。

图12是根据本发明的一较佳实施例的ZFM54副干酪乳杆菌素的 Tricine-SDS-PAGE图谱。

图13是根据本发明的一较佳实施例的ZFM54副干酪乳杆菌素的热稳定性的示意图。

图14是不同pH值对ZFM54副干酪乳杆菌素抑菌活性的影响的示意图。

图15是不同酶处理对ZFM54副干酪乳杆菌素抑菌活性的影响的示意图。

图16是ZFM54副干酪乳杆菌素对藤黄微球菌10209细胞膜的影响的示意图。

具体实施方式

以下描述用于揭露本发明以使本领域技术人员能够实现本发明。以下描述中的优选实施例只作为举例，本领域技术人员可以想到其他显而易见的变型。在以下描述中界定的本发明的基本原理可以应用于其他实施方案、变形方案、改进方案、等同方案以及没有背离本发明的精神和范围的其他技术方案。

本领域技术人员应理解的是，在本发明的揭露中，术语“纵向”、“横向”、“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“顶”、“底”、“内”、“外”等指示的方位或位置关系是基于附图所示的方位或位置关系，其仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此上述术语不能理解为对本发明的限制。

可以理解的是，术语“一”应理解为“至少一”或“一个或多个”，即在一个实施例中，一个元件的数量可以为一个，而在另外的实施例中，该元件的数量可以为多个，术语“一”不能理解为对数量的限制。

本发明提供了一副干酪乳杆菌及其应用，其中所述副干酪乳杆菌保藏于武汉大学的中国典型培养物保藏中心(保藏单位地址中国湖北省武汉市武昌区珞珈山街16号武汉大学，保藏时间为2016年11月23日)，保藏编号为CCTCC NO:2016667。所述副干酪乳杆菌成为ZFM54，拉丁文为Lactobacillus paracasei ZFM54。

本说明部分主要从三个方面阐明所述副干酪乳杆菌，第一部分是如何获取所述副干酪乳杆菌，第二部分是关于所述副干酪乳杆菌发酵，第三部分是关于所述副干酪乳杆菌产物的生物特性研究。

所述副干酪乳杆菌ZFM54的获取

材料与设备

菌种来源：本实施例中所筛菌种来源于浙江大学医学院附属妇产科医院初生婴儿粪便。抑菌实验所用指示菌为本实验室保藏的藤黄微球菌10209 (Micrococcus luteus10209)、金黄色葡萄球菌D48(Staphylococcus aureus D48)、单增李斯特氏菌LM1(Listeria monocytogenes LM1)、大肠杆菌DH5(Escherichia coli DH5)、鼠伤寒沙门氏菌CMCC 50015(Salmonella typhimurium CMCC 50015)。

培养基：(1)MRS培养基：牛肉膏10g，葡萄糖20g，蛋白胨10g，酵母提取物5g，柠檬酸三铵3g，磷酸氢二钾2g，无水乙酸钠5g，七水硫酸镁0.2g，硫酸锰0.05g，吐温801mL，溶于超纯水并定容至1L。调节培养基pH为6.5， 121℃高压灭菌15min。固体培养基在此基础上加入1.5％～2％(W/V)琼脂。筛选乳酸菌所用的培养基在此基础上额外添加2％的碳酸钙。

(2)LB培养基：氯化钠10g，蛋白胨10g，酵母提取物5g，超纯水溶解并定容至1L，调节培养基pH为7，121℃高压灭菌15min。固体培养基在此基础上加入1.5％～2％(W/V)琼脂，半固体培养基在此基础上加入1％～1.2％(W/V) 琼脂。

主要试剂：细菌微量生化鉴定管购于青岛海博生物技术有限公司；草酸铵结晶紫、加路哥式碘液、碳酸钙、琼脂糖、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、无水乙醇、盐酸、氢氧化钠、过氧化氢酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶、蛋白酶K、细菌基因组提取试剂盒购于生工生物工程(上海)股份有限公司。

主要仪器：表1实验主要仪器设备

Table 1List of main equipments

实验方法：

婴儿粪便中乳酸菌的分离：在无菌条件下，取初生婴儿粪便用1mL灭菌生理盐水稀释，振荡使其充分混匀后静置，取100μL上清涂布到添加有2％碳酸钙的MRS固体培养基平板上，倒置于37℃培养箱中厌氧培养36～48h。选取长势良好且有明显钙溶圈的单菌落分别接种于MRS液体培养基中培养并编号。菌液经过反复几次平板划线分离，挑取单菌落，进行革兰氏染色及过氧化氢酶测试，革兰氏染色阳性，过氧化氢酶阴性的菌落初步判定为乳酸菌。

菌种的活化及保藏：初步判定为乳酸菌的单菌落，接种到10mL MRS液体培养基中于37℃条件下培养24h，再以1％(v/v)的接种量进行两次传代培养。活化后编号保种，取700μL菌液加上300μL灭菌甘油于-80℃保藏菌株。

指示菌的培养：将保藏在-80℃甘油管中的各指示菌菌种，分别划线于LB 固体培养基平板上，在各自的最适温度下培养至出现明显单菌落，挑取单菌落接种于LB液体培养基中摇床振荡培养至对数期(约12h)。用无菌生理盐水调整菌体浓度至OD₆₀₀＝0.6，4℃保存备用。

产细菌素乳酸菌的初筛：将活化好的乳酸菌菌株按照1％(v/v)比例分别接种于10mL MRS液体培养基中，在37℃条件下静置培养24h后，4℃下8000r/min 离心20min获得上清液，发酵上清液采用牛津杯琼脂扩散法测试抑菌活性。选择抑菌效果最好的菌株，进行分类鉴定作后续研究。牛津杯法抑菌试验具体方法如下：

(1)将灭过菌的LB半固体培养基加热使其充分融化，轻轻振荡混匀，并置于55℃水浴锅中恒温防止琼脂凝固；

(2)将灭过菌的牛津杯间隔均匀地放置在一次性培养皿上；

(3)将指示菌在漩涡振荡器中振荡混匀，待LB半固体培养基冷却到45℃左右后按1％(v/v)的接种量将指示菌菌悬液加入到15mL半固体培养基中，充分混匀后倒入培养皿中，轻轻旋转平皿使其均匀覆盖平皿表面，注意不要将培养基倒入牛津杯中；

(4)待半固体培养基完全冷却凝固后，用灭菌的镊子将牛津杯小心拔出，制成带圆柱形孔洞的含菌平板；

(5)在每个孔洞中加入100μL待测样品后，将平板置于4℃冰箱使样品充分扩散4h，然后按照不同指示菌各自的最适培养条件培养12h；

(6)用游标卡尺测量抑菌圈的直径并记录。抑菌试验均做三组平行。

产细菌素乳酸菌的复筛：除了细菌素外，乳酸菌代谢产生的抗菌活性物质还包括一些有机酸和过氧化氢等物质，牛津杯法初筛只能筛选出能产生抑菌物质的乳酸菌，无法确定发挥抑菌作用的是哪种物质，因此需要排除有机酸、过氧化氢对指示菌的抑菌干扰作用。

排除有机酸的干扰：首先测定ZFM54发酵上清液的pH，然后用1M氢氧化钠溶液将发酵上清液调至pH5.0，以用乳酸和醋酸调至相同pH的无菌MRS 培养基为对照，对藤黄微球菌10209进行牛津杯琼脂扩散法抑菌试验，测量抑菌圈直径大小，比较抑菌活性区别。

排除过氧化氢的干扰：将发酵上清液浓缩两倍后调节pH值到原来的发酵上清pH值，配制浓度为5mg/mL的过氧化氢酶工作液(溶剂为pH7.0的PBS缓冲液)。按发酵上清浓缩液与过氧化氢酶工作液体积比为1∶1进行混合，在37℃水浴处理2h后采用牛津杯法测试其抑菌活性；同时用以1∶1混合的发酵上清浓缩液和pH7.0的PBS缓冲液作为空白对照，分别测量抑菌圈直径大小并比较区别。

细菌素类物质(多肽)的确定：配制胃蛋白酶、胰蛋白酶和蛋白酶K的酶溶液5mg/mL，将发酵上清液分别调到各蛋白酶的最适pH值(胃蛋白酶pH2.0、胰蛋白酶pH5.4、蛋白酶KpH7.6)，然后加入对应酶溶液使其终浓度为1mg/mL，在37℃水浴锅中处理2h，再调回发酵上清液初始pH值。以未经蛋白酶处理的发酵上清液为空白对照，采用牛津杯法进行抑菌试验，测量抑菌圈直径大小并比较区别。

菌种鉴定：根据《乳酸菌细菌分类鉴定及实验方法》和《伯杰氏系统细菌学手册》，对筛选得到的抗菌活性最优的菌株进行菌落菌体形态学鉴定和生理生化鉴定。同时基于16S rDNA基因进行分子生物学鉴定。

形态学鉴定：在MRS固体平板上划线分离乳酸菌，根据平板上长出的单菌落的菌落形状、颜色、透明度、边缘是否整齐、表面是否光滑等特征来初步判断该菌株类型，然后挑取符合乳酸菌菌落形态且有抑菌活性的菌落进行革兰氏染色，再用显微镜观察菌体的形态特征，并从颜色判断属于革兰氏阳性菌还是阴性菌。

革兰氏染色及镜检步骤：

(1)制片：在干净的载玻片上滴一滴生理盐水，用接种环挑取单菌落与生理盐水混合均匀后进行涂片，涂抹成直径约为1cm的薄层；

(2)固定：将载玻片在酒精灯火焰上方快速来回通过一至两次进行加热固定；

(3)染色：在涂片区域上滴一滴草酸铵结晶紫，染色1min后用无菌水小心冲洗；

(4)媒染：加路哥式碘液一滴，作用1min后用无菌水冲洗，用擦镜纸吸干；

(5)脱色：倾斜载玻片，用滴管流加95％乙醇进行脱色，直至无紫色脱落，再用无菌水冲洗；

(6)复染：滴加0.5％的番红染色一滴，染色30s后，水洗；

(7)镜检：用擦镜纸吸干水，用油镜观察。

生理生化鉴定：

(1)七叶苷水解实验

有些细菌可以分解利用七叶苷产生七叶素，七叶素能够与培养基中的二价铁离子反应形成黑色的化合物。用细菌微量生化反应管来进行本实验，用接种环从平板上挑取已纯化培养的同一菌落接种于七叶苷试验的生化管。接种后静置于 37℃恒温箱中培养24h(用封口膜封口，封口膜用75％酒精擦拭灭菌)，若出现黑色说明七叶苷被水解，为阳性反应，否则为阴性反应。

(2)淀粉分解实验

将菌株从-80℃取出并在MRS固体培养基平板上划线活化，用接种环挑取单菌落接种于含有0.5％淀粉的MRS液体培养基中，静置于37℃恒温箱中培养24h。然后向培养液中加入几滴碘液摇匀，观察是否变色。若不变色表示淀粉完全水解，为阳性反应，如变成蓝色或蓝紫色则表明淀粉未完全水解，为阴性反应。

(3)糖醇发酵实验

该实验用各种糖的微量生化反应管来进行。用接种环从平板上挑取单菌落接种于葡萄糖微量生化反应管、果糖微量生化反应管、纤维二糖微量生化反应管、麦芽糖微量生化反应管、蔗糖微量生化反应管、蜜二糖微量生化反应管、棉籽糖微量生化反应管、乳糖微量生化反应管、甘露醇微量生化反应管和山梨醇微量生化反应管中，静置于37℃恒温箱中培养24h(用封口膜封口，封口膜用75％酒精擦拭灭菌)后观察结果。若反应管显色为黄色则说明产酸，为阳性反应，否则为阴性反应。

(4)过氧化氢酶实验

将菌株从-80℃取出并在MRS固体培养基平板上划线活化，置于37℃静置培养24h。然后挑取单菌落涂抹在载玻片上，在涂片区域上滴加几滴5％的过氧化氢溶液。若细菌可以产生过氧化氢酶，则过氧化氢被酶分解产生气泡，为阳性反应，否则为阴性反应。

(5)硫化氢实验

有些细菌能分解含硫的氨基酸如胱氨酸、半胱氨酸等并产生硫化氢。硫化氢能与培养基中的铁盐反应，生成黑色的硫化铁沉淀。用接种环从平板上挑取单菌落接种于硫化氢试验的微量生化反应管中，静置于37℃恒温箱中培养24h(用封口膜封口，封口膜用75％酒精擦拭灭菌)后观察结果，若显出黑色为阳性反应，否则为阴性反应。

(6)明胶水解实验

该实验用于检测细菌是否可以产生明胶酶将明胶水解成多肽。用微量生化反应管来进行本实验。用接种环从平板上挑取单菌落接种于明胶水解试验的微量生化反应管中，静置于37℃恒温箱中培养24h(用封口膜封口，封口膜用75％酒精擦拭灭菌)，观察明胶水解情况。

(7)细菌V-P实验

该实验用于检测细菌产生乙酰甲基甲醇的能力。某些细菌能够分解葡萄糖最终产生乙酰甲基甲醇。在碱性条件下，乙酰甲基甲醇被氧化成二乙酰，进而与培养基中的精氨酸等含胍基的物质结合形成红色化合物，即V-P试验阳性。用微量生化反应管来进行本实验，用接种环从平板上挑取单菌落接种于微量生化反应管。接种后静置于37℃恒温箱中培养24h(用封口膜封口，封口膜用75％酒精擦拭灭菌)，然后滴加VP甲液和乙液，显出红色为阳性反应，否则为阴性反应。

基于16S rDNA的分子生物学鉴定：

(1)乳酸菌基因组DNA的提取：

用Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒进行细菌全基因组的提取。实验开始前，按要求在PW Solution中加入相应量的异丙醇混合均匀，Wash Solution中加入相应量的无水乙醇混合均匀，并在瓶身上做好标签，在室温下密封保存。使用前检查Buffer Digestion是否出现沉淀，如有则在56℃下溶解后使用。

1)将保存在-80℃中的菌株取出于MRS固体培养基平板上划线活化，待长出菌落后挑取单菌落接种至10mL MRS液体培养基中并置于37℃恒温培养箱中培养24h；

2)将培养后的菌液于漩涡振荡器上震荡使细菌充分混匀，吸取1mL菌液于1.5mLEP管中，在8000r/min离心1min，弃上清。加入180μL溶菌酶溶液 (使用前将相应的溶解酶加入到Enzymatic lysis buffer中，配置成20mg/mL的溶解酶溶液)重悬菌液，并在37℃下水浴一小时。加入20μL Proteinase K溶液，震荡混匀。56℃水浴30min直至细胞完全裂解；

3)加入200μL Buffer BD，充分颠倒混匀；

4)加入200μL无水乙醇，充分颠倒混匀；

5)先将吸附柱放入收集管中，用移液器将溶液全部吸取到吸附柱中，并静置2min，12000r/min离心1min，倒掉收集管中废液；

6)将吸附柱放回收集管中，加入500μL PW Solution，10000r/min离心30s，倒掉收集管中的滤液；

7)将吸附柱放回收集管中，加入500μL Wash Solution，10000r/min离心 30s，倒掉收集管中的滤液。

8)将吸附柱放回收集管中，于12000r/min中离心2min，离去残留的WashSolution。打开吸附柱的盖子在室温下放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残留的WashSolution，以免影响基因组DNA的产量和后续实验；

9)取出吸附柱放入新的1.5mL EP管中，加入100μL CE Buffer静置3min， 12000r/min离心2min，收集DNA溶液，并于-20℃保存以备进一步实验。

(2)琼脂糖凝胶电泳：

1)制胶：称取0.2g琼脂糖，加入40mL 1×TAE溶液混合，并加热40s至琼脂糖完全溶解，室温下冷却至60℃左右加入1uL溴化乙锭充分混匀，倒入制胶槽中插入梳子，待其完全冷却凝固，小心将梳子拔出。

2)上样：将制好的胶放入电泳槽内，使得槽中的1×TAE溶液没过整块胶。取1uL 10×Loading buffer在塑料薄膜上，再取5uL提取好的DNA样品与 10×Loading buffer混合均匀，将样品小心打入凝胶孔中，再在边上的槽孔中加入 3uL 10000bp的DNA Marker。上样时小心枪头将胶戳破，注意不要有气泡。

3)电泳、成像：在80V恒压下电泳45min左右，待蓝色条带跑至整块凝胶的三分之二处即可结束电泳。取出凝胶并在凝胶成像仪中拍照查看结果。

(3)PCR扩增：

PCR扩增采用乳酸菌16S rDNA的通用引物，由生工生物工程(上海)有限公司合成。

27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)

1492R(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)

PCR扩增反应体系如下表2所示：

表2PCR扩增反应体系

Table 2PCR Mixture

表3PCR循环条件

Table 3PCR cycle conditions

PCR扩增后的产物使用SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒进行回收，乳酸菌 16S rDNA通用引物的合成以及PCR产物序列的测序都由生工生物工程(上海) 股份有限公司完成。

(4)16S rDNA同源性分析及系统发育树的构建：

测序得到的序列提交到NCBI的GenBank数据库进行BLAST分析，筛选与所测菌株16S rDNA序列同源性最高的菌株，提取它们的序列并用生物信息学软件MEGA 6.0构建系统发育树，进行系统发育分析从而确定分离到的乳酸菌菌株的种属关系。

结果和分析：

产细菌素乳酸菌的分离及初筛：

以浙江大学医学院附属妇产科医院初生婴儿的粪便为样品，筛选得到能产生钙溶圈的乳酸菌，如图1所示。挑选4株钙溶圈明显、菌落形态单一的单菌落接种于MRS液体培养基中，分别编号为S1、S2、S3、S4。

通过牛津杯琼脂扩散法检测这4株乳酸菌对大肠杆菌DH5、藤黄微球菌 10209等指示菌的抑菌活性，结果如表4所示。经试验发现菌株S4的发酵上清液抑菌活性最强，因此选定其作为后续实验的优势菌株，命名为ZFM54。

表4乳酸菌发酵液对指示菌的抑菌作用

Table 4The antibacterial activity by fermentation broth of theLactobacillus

注：牛津杯直径为8.0mm；“-”表示无抑菌圈

产细菌素乳酸菌的复筛：

经过初筛获得了一株具有较广泛抑菌谱的乳酸菌菌株ZFM54，为了避免乳酸菌代谢产生的一些有机酸、过氧化氢等物质对抑菌效果产生的干扰，确定是细菌素类物质发挥的抑菌作用，复筛实验对这些干扰因素做了逐一排除。

排除有机酸对抑菌活性的干扰：

用1M氢氧化钠溶液将乳酸菌ZFM54发酵上清液的pH调至5.0，用乳酸、醋酸将未接种的MRS液体培养基调节成pH5.0，以未调pH的发酵上清液(pH3.78) 为对照进行抑菌活性测试，指示菌为藤黄微球菌10209，结果如图2。抑菌实验结果发现发酵上清液pH调为5.0后抑菌圈比发酵原液抑菌圈透明度低，抑菌圈稍小，但仍然具有良好的抑菌活性。而pH调为5.0的乳酸MRS和醋酸MRS无抑菌圈出现，该实验结果说明发酵上清液中存在其他非酸性物质发挥抑菌作用。注意，图2中的标号1是ZFM54发酵上清液；标号2是pH5.0的发酵上清液；标号3是pH5.0的乳酸MRS；4是pH5.0的醋酸MRS。

排除H2O2对乳酸菌抑菌活性的干扰：用过氧化氢酶处理菌株ZFM54的发酵上清液，以发酵原液作对照，两者对藤黄微球菌的抑菌效果未见显著变化，抑菌圈大小和透明度几乎一样，由此排除H₂O₂所起的抑菌作用，进一步说明发酵上清液中存在其他抑菌活性物质。

蛋白酶处理对发酵上清抑菌活性的影响：菌株ZFM54发酵上清液经胃蛋白酶、胰蛋白酶和蛋白酶K处理后的抑菌活性如表5所示。经观察发现，菌株ZFM54 的抑菌物质对不同的蛋白酶呈现出不同的敏感性，在经过胰蛋白酶和蛋白酶K 处理之后，其抑菌圈直径明显的减小，丧失大部分抑菌活性；在经过胃蛋白酶的处理后其抑菌圈直径略有减小，且透明度降低，丧失小部分抑菌活性。由上述结果初步判断菌株ZFM54发酵上清液中的主要抑菌物质是一种蛋白质、多肽类物质或者不是单一的物质。

表5不同蛋白酶处理对菌株ZFM54抑菌活性的影响

Table 2-4Effects of protease on the antibacterial activity of strainZFM54

注：牛津杯直径为8.00mm；同列相同字母表示差异不显著(P＞0.05)，同列不同字母表示差异显著(P＜0.05)。

产细菌素乳酸菌的菌种鉴定：

菌落菌体形态学鉴定：

通过平板划线分离可以看到菌株ZFM54在MRS固体培养基平板上生长情况良好，菌落为圆形凸起状且边缘整齐，大小0.5～2.0mm，呈乳白色，表面光滑不透明，具有乳酸菌典型的生长特征(如图3)；革兰氏染色结果呈阳性；在光学显微镜下观察菌体形态发现呈杆状形态，无鞭毛，无芽孢(如图4)，菌落形态与革兰氏染色镜检结果与乳杆菌的特征符合。

细菌的生理生化鉴定：

细菌在生长繁殖的过程中会进行各种复杂的代谢反应，反应过程中都必须要有酶的催化。不同种类细菌代谢途径不同，会产生不同的酶来催化反应的进行，因而其代谢类型和产物都不同，所以可以用生物化学方法进行检测来鉴定细菌的种类。菌株ZFM54的生理生化试验结果见表6。

表6菌株ZFM54生理生化特征

Table 6Physiological and biochemical identification results of strainZFM54

注：“+”代表阳性；“－”代表阴性

菌株ZFM54经H₂O₂酶试验、淀粉水解试验、硫化氢产生试验、明胶液化试验后结果均为阴性，说明该菌在生长代谢过程中不能分泌产生淀粉酶来降解大分子物质，也不能产硫化氢和过氧化氢。多种糖类分解实验中，ZFM54可以发酵多种糖醇类如葡萄糖、果糖、麦芽糖、甘露醇、山梨醇等，结果呈阳性；但不可发酵蜜二糖、棉籽糖和阿拉伯糖等产酸，结果呈阴性。此外细菌可以分解七叶苷且V-P反应呈阴性，此结果和乳酸菌群的特征基本对应。综合以上形态学及生理生化特性，参考《乳酸细菌分类鉴定及实验方法》和《常见细菌系统鉴定手册》，初步认定菌株为ZFM54为副干酪乳杆菌。但由于副干酪乳杆菌与干酪乳杆菌中的某些亚种以及鼠李糖乳杆菌亲缘关系十分接近,很难利用传统的发酵特性做出区分，因此需要进一步结合16S rDNA方法进行鉴定。

乳酸菌的分子生物学鉴定：

(1)乳酸菌ZFM54基因组提取及16S rDNA的PCR扩增使用Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒提取乳酸菌ZFM54的总DNA，以乳酸菌ZFM54 的总DNA为模板，用乳酸菌16S rDNA通用引物进行PCR扩增，扩增产物在1％琼脂糖凝胶下电泳得到一条约为1500bp的条带，电泳结果见图5。乳酸菌ZFM54 的16S rDNA由生工生物工程(上海)有限公司进行测序。

(2)BLAST同源性比较及系统发育树的构建将测序得到的乳酸菌ZFM54 的16SrDNA序列提交至NCBI的GenBank数据库中进行BLAST比对，选择了 10个菌株的16S rDNA基因序列，应用MEGA6.0软件进行多重序列比对并构建系统发育树(见图6)。在系统发育树中，菌株ZFM54与副干酪乳杆菌在同一分支，结合细菌形态学和生理生化鉴定，该菌被鉴定为副干酪乳杆菌，并命名为 Lactobacillus paracasei ZFM54，简称ZFM54。

乳酸菌是人体肠道中重要的益生菌，其数量和组成对维持宿主的微生态平衡和提高免疫系统功能起着至关重要的作用。由于外源益生菌的生长环境与人体胃肠道的环境相差甚远，因而许多学者认为理想的益生菌最好来自于人体自身的胃肠道。研究发现婴儿粪便中含有益生菌，这些益生菌可以有效调节肠道菌群，并能增加小鼠肠道和人体粪便中短链脂肪酸的含量。

本章实验通过钙溶圈、菌落形态学观察和革兰氏染色实验从初生婴儿粪便中分离到4株乳酸菌，利用牛津杯琼脂扩散法分别测试抑菌活性对4株乳酸菌进行了初筛，从中筛选到一株对藤黄微球菌10209、单增李斯特氏菌LM1等革兰氏阳性菌和大肠杆菌DH5、鼠伤寒沙门氏菌CMCC 50015等革兰氏阴性菌均有抑菌效果且抑菌活性最强的优势菌株ZFM54。由于乳酸菌发酵上清液中的抑菌物质除了细菌素外，还包括一些有机酸和H₂O₂等物质，仅通过牛津杯法抑菌试验不能说明是细菌素类物质发挥的抑菌作用，因此需要设计复筛实验来排除有机酸和H₂O₂的干扰。通过排除试验发现，菌株ZFM54的抑菌效果并不是由有机酸和 H₂O₂引起而是另有其它抑菌物质在起作用。通过胃蛋白酶、胰蛋白酶和蛋白酶K 处理菌株ZFM54发酵上清液发现：ZFM54发酵上清液中的抑菌物质对胰蛋白酶和蛋白酶K非常敏感，胃蛋白酶也可使其失去部分活性，因此初步鉴定ZFM54 中产生抑菌效果的物质应该是一类蛋白质或者是多肽。

不同的微生物在分解、利用糖类、脂肪类和蛋白类物质的能力不同，因此，细菌的生理生化反应是菌株鉴定的重要依据。本章实验中，结合形态学鉴定、生理生化鉴定和16SrDNA同源性分析，鉴定筛选出的ZFM54菌株为副干酪乳杆菌，命名为副干酪乳杆菌ZFM54(Lactobacillus paracasei ZFM54)。

副干酪乳杆菌ZFM54发酵产生抑菌物质

材料与设备：

实验菌种：

发酵菌种为副干酪乳杆菌ZFM54；指示菌为藤黄微球菌10209、单增李斯特氏菌LM1、金黄色葡萄球菌D48和鼠伤寒沙门氏菌CMCC50015。实验菌种及其培养条件见表7。

表7实验主要菌种

Table 7List of strains

培养基：

(1)MRS培养基：配方见上述的说明；

(2)LB培养基：配方见上述的说明。

主要试剂与耗材：

丙烯酰胺粉末、甲叉丙烯酰胺粉末、过硫酸铵(APS)、甲醇、甘油、四甲基乙二胺(TEMED)、十二烷基磺酸钠(SDS)、购自生工生物工程(上海) 股份有限公司；

异丙醇、乙醇、色谱级乙腈、三氟乙酸(TFA)、一次性使用无菌注射器(带针)、0.22μm水系/有机微孔过滤膜等购自浙江常青化工有限公司；

XAD-16大孔树脂、HiPrep^TMSP XL 16/10层析柱、Sephadex G-25交联葡聚糖凝胶柱填料购自北京慧得易公司；

BCA蛋白定量试剂盒购自江苏凯基生物技术股份公司。

主要仪器：

表8主要仪器

Table 8List of main equipments

相关溶液配制：

Tricine-SDS-PAGE所用溶液：

(1)AB-3母液(49.5％T，3％C mixture)：称取48g丙烯酰胺和1.5g甲叉丙烯酰胺溶解于100mL蒸馏水中，4℃避光保存；

(2)AB-6母液(49.5％T，6％C mixture)：称取46.5g丙烯酰胺和3g甲叉丙烯酰胺溶解于100mL蒸馏水中，4℃避光保存；

(3)凝胶缓冲液：称取36.3g Tris和0.3g SDS溶于100mL超纯水中，用 HCl调pH值至8.45；

(4)样品缓冲液：12％SDS，6％巯基乙醇，30％甘油，0.05％溴酚蓝，0.15M Tris-HCL(pH＝7.0)；

(5)10％APS：称取过硫酸铵1g用蒸馏水定容至10mL并置于棕色瓶中， 4℃保存半个月；

(6)10×阴极缓冲液：称取121.14g Tris，179.2g Tricine和10g SDS用蒸馏水溶解并定容至1L，用HCl调节pH至8.25；

(7)10×阳极缓冲液：称取121g Tris用蒸馏水溶解并定容至1L，HCl调节pH至8.9；

(8)固定液：量取50mL甲醇，10mL冰醋酸，称取0.7708g醋酸铵，加蒸馏水定容至100mL；

(9)染色液：称取0.25g考马斯亮蓝G-250，溶于100mL强脱中(乙醇 45mL，冰乙酸10mL，蒸馏水45mL)，用滤纸过滤；

(10)强脱色液：量取乙醇45mL，冰乙酸10mL，蒸馏水定容至100mL；

(11)弱脱色液：量取乙醇25mL，冰乙酸8mL，蒸馏水定容至100mL。

实验方法：

细菌素效价的测定：

(1)配制Nisin标准品溶液：准确称取Nisin标准品(10⁶IU/g)0.2g溶解于20mL0.02M的稀盐酸溶液中，得到浓度为1×10⁴IU/mL的Nisin标准样品溶液；

(2)用0.02M的稀盐酸溶液对1×10⁴IU/mL的标准样品溶液进行梯度稀释，获得终浓度分别为2000、1000、800、600、500、250、100和50IU/mL的标准品溶液；

(3)用牛津杯法对不同浓度的Nisin标准样品和细菌素进行抑菌实验，以藤黄微球菌10209为指示菌，设置三组平行实验；

(4)测量抑菌圈的直径大小，以Nisin标准溶液的不同效价的对数值为横坐标，以测得的抑菌圈的直径大小为纵坐标，绘制标准曲线，根据公式计算细菌素的效价。

副干酪乳杆菌ZFM54产抑菌物质最适发酵条件的确定：

发酵时间对ZFM54产抑菌物质的影响：

(1)用接种环将保藏在-80℃甘油管中的副干酪乳杆菌ZFM54在MRS固体培养基平板上进行划线活化，待平板上长出菌落后，挑取单菌落接种于10mL MRS液体培养基中，37℃静置培养24h后，按照1％(v/v)的接种量接种于800 mL的MRS液体培养基中，在37℃静置培养；

(2)在培养时间为0、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、 36、40、48、60h的时间点时依次取样，每次取出5mL发酵液，分别测试发酵液的OD₆₀₀。注意取样前摇匀发酵液，并以同批灭菌的MRS液体培养基作空白对照。将每次测完余下的样品在8000r/min下离心15min，取上清测试其pH和抑菌活性，抑菌活性检测采用牛津杯琼脂扩散法，以藤黄微球菌为抑菌检测的指示菌；

(3)做三组平行实验，数据取平均值，绘制副干酪乳杆菌ZFM54的生长曲线及抑菌物质产生曲线。

发酵温度对ZFM54产抑菌物质的影响：

将副干酪乳杆菌ZFM54以1％(V/V)的接种量接种于MRS液体培养基中，分别以30℃、34℃、37℃、40℃恒温静置培养24h后，测定其OD₆₀₀值和抑菌活性大小(以抑菌圈直径大小表示)，确定最适发酵温度。做三组平行实验。

接种量对ZFM54产抑菌物质的影响：

将副干酪乳杆菌ZFM54分别以1％、1.5％、2％、2.5％(V/V)的接种量接种到MRS液体培养基中，37℃恒温静置培养24h后，测定其OD₆₀₀值和抑菌活性大小(以抑菌圈直径大小表示)，确定最适的接种量。

发酵上清液的制备：

(1)用接种环蘸取保藏在-80℃甘油管中的L.paracasei ZFM54菌液后在 MRS固体培养基平板上采用三区划线法划线，37℃培养箱中倒置培养，待长出单菌落；

(2)用接种环挑取单菌落接种到10mL MRS液体培养基中，在37℃下静置培养12～16h至对数生长期；

(3)以2％的接种量将已活化的L.paracasei ZFM54接种到5L MRS液体培养基中，在37℃培养箱中静置培养36h，得到发酵液；

(4)将发酵液在8000r/min，4℃条件下离心20min获得L.paracasei ZFM54 的发酵上清液，测定发酵上清液的pH值，并将其在4℃保存备用。

结果与讨论：

细菌素效价的标准曲线：

以Nisin标准溶液效价的对数值为横坐标，抑菌圈直径为纵坐标，绘制细菌素效价标准曲线，如图7所示。Nisin效价的标准曲线方程为：y＝6.8527x+0.2516， R²＝0.9908表明该标准曲线的线性程度较好，可用于乳酸菌细菌素效价的测定。

副干酪乳杆菌ZFM54产抑菌物质的最适发酵条件的确定：

发酵时间对ZFM54产抑菌物质的影响：

将活化好的副干酪乳杆菌ZFM54以1％接种量接种在MRS液体培养基中，在37℃下培养60h，以时间为横坐标，OD₆₀₀值、pH值和抑菌圈直径为纵坐标绘制生长曲线和抑菌活性变化曲线，结果如图8所示。由图8可知，ZFM54在 0-6h时OD₆₀₀值变化较小，说明菌体生长缓慢，处于延滞期。6h后，ZFM54进入对数生长期，菌体生长旺盛，菌体密度快速上升，与此同时发酵液的pH迅速下降，12h后开始产生抑菌活性物质，到对数生长末期的20h，开始大量产生抑菌活性物质。20h后菌体生长变缓，逐渐进入稳定期，pH值小幅度下降，随后基本稳定在3.75左右，抑菌活性在36-48h达到最大值。副干酪乳杆菌ZFM54 的生长曲线未见明显的衰亡期出现。

发酵温度对ZFM54产抑菌物质的影响：

将副干酪乳杆菌ZFM54以1％(V/V)的接种量接种于MRS液体培养基，在不同的温度(30、34、37、40℃)下培养时，其生长和抑菌活性的变化情况如附图9所示。

从图中可以看出，副干酪乳杆菌ZFM54在30～37℃生长良好，40℃时菌体密度显著下降。而37℃培养时，OD₆₀₀值最高，且抑菌活性也明显优于其他培养温度，因此后续实验选择37℃作为副干酪乳杆菌ZFM54产细菌素的最佳发酵培养温度。

接种量对ZFM54产抑菌物质的影响：

将副干酪乳杆菌ZFM54分别按1％、1.5％、2％、2.5％(V/V)的接种量接种于MRS液体培养基，于37℃培养时其生长和抑菌活性的变化情况如附图10 所示。

如图10所示，随着接种量的增加，菌体密度呈现下降趋势，推测可能是由于接种量的增大，培养基的营养不足，使副干酪乳杆菌之间产生生长的竞争，然而在接种量为2％时抑菌活性最高。有文献报道，细菌素在不利生长条件下反而有更高的细菌素产量，所以推测出现这种情况可能是因为细菌素的产生是一种应激调节，对不适于其最佳生长环境的一种应激反应。但总的来说，细菌素的产生是一个复杂的代谢过程，可能受多种因素的影响。根据不同接种量发酵的试验结果，我们选择2％的接种量作为副干酪乳杆菌ZFM54产细菌素的最佳发酵接种量。

XAD-16大孔树脂吸附层析：

本实验将5L发酵上清液(pH为3.78)全部流经XAD-16大孔树脂吸附柱，经过超纯水平衡后，分别用30％、50％、70％、100％异丙醇洗脱，收集上清流出液及各梯度洗脱液，用旋转蒸发仪在37℃，80r/min条件下除去有机溶剂，浓缩洗脱液。用牛津杯琼脂扩散法检测各梯度洗脱液的抑菌活性。如图11A至图11C 所示，仅上清流出液和30％异丙醇洗脱液对藤黄微球菌10209、鼠伤寒沙门氏菌 CMCC 50015和单增李斯特氏菌LM1有较好的抑菌活性，50％、70％、100％异丙醇洗脱液均未检测到抑菌活性。图11A至图11C中标号A对应流出液，标号 B对应为50％异丙醇，标号C对应为30％异丙醇，标号D对应为70％异丙醇，标号E对应为100％异丙醇。

Tricine-SDS-PAGE测定分子量：

将经过纯化后的ZFM54副干酪乳杆菌素进行Tricine-SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，经过考马斯亮蓝染色后得到条带见图12，ZFM54副干酪乳杆菌素的分子量约为5kDa，属于一种小肽类细菌素。纯化的方式可以有多种，比如说

ZFM54细菌素的生物学特性

材料与设备：

实验菌种：

实验所需菌种及其培养条件见表9。

表9实验主要菌种

Table 9List of main strains

培养基：

(1)MRS培养基：配方见第一部分内容；

(2)LB培养基：配方见第一部分内容；

(3)Czapek’s培养基：准确称量蔗糖30g，硝酸钠3g，七水硫酸镁0.5g，氯化钾0.5g，四水硫酸亚铁0.01g，磷酸氢二钾1g，用超纯水定容至1L。

主要试剂：

DisC₂(5)、DMSO、葡萄糖、硫酸镁、氯化钾、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠购自生工生物工程(上海)股份有限公司，Lipid II为荷兰乌特勒支大学Eefjan Breukink教授所赠。

主要仪器：

表10主要仪器与设备

Table 10List of equipments

相关溶液的配制：

(1)0.05％(W/V)醋酸缓冲液：准确量取100mL超纯水，弃去47.66μL 超纯水，加入47.66μL无水乙酸，混匀。

(2)荧光泄漏缓冲液的配置：22.5mL 20％葡萄糖、1mL 0.5M硫酸镁、4mL 2.5M氯化钾、10mL pH 7的磷酸缓冲液。将以上溶液混合后定容到100mL，再将pH调为7，并过0.22μm滤膜，置于4℃待用。

(3)0.1mM DisC₂(5)荧光探针：准确称取0.0052g DisC₂(5)粉末溶于1mL 二甲基亚砜(DMSO)中，得到浓度为10mM的荧光探针溶液，取1mL加DMSO 定容到100mL，即得到浓度为0.1mM的DisC₂(5)荧光探针。

实验方法：

抑菌谱的测定：

选取几株乳酸菌及食品中易产生污染的一些腐败菌和致病菌，包括革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌和真菌共17种作为指示菌，对ZFM54副干酪乳杆菌素进行抑菌活性测试。指示菌活化培养，使用前将指示菌菌体密度调节到10⁶CFU/mL 左右。采用牛津杯琼脂扩散法进行抑菌活性测试，测量抑菌圈直径大小从而确定该细菌素的抑菌谱。

细菌素MIC的测定：

最小抑菌浓度的定义是：加入某种抗菌物质在体外培养细菌24小时后，能抑制培养基内细菌的可见生长的最低浓度。MIC是反映抗菌物质的抗菌活性大小的一个重要指标。本实验采用96微孔板法测定ZFM54副干酪乳杆菌素的最小抑菌浓度，各指示菌活化后接种至适宜液体培养基中，培养至指数生长初期 (OD₆₀₀＝0.5)。用培养基稀释指示菌菌悬液，将OD₆₀₀调节至0.05作为测试起始菌液。

在96孔板中依次加入100μL各指示菌，将冻干的ZFM54抗菌物质粉末用 0.05％醋酸重溶并逐级稀释，按50μL体积加入到相应的96孔板中，形成抗菌物质终浓度梯度：7μg/mL、6μg/mL、5.5μg/mL、5μg/mL、4.75μg/mL、4.5μg/mL、 4.25μg/mL、4μg/mL、3.5μg/mL、3μg/mL。以150μL灭菌培养基和150μL起始菌液作空白对，每组做三个平行。加样完成后，将96孔板置于各指示菌的适宜培养条件下培养，每隔1小时用酶标仪检测一次OD₆₀₀值，并记录，共检测24 小时。

与起始OD₆₀₀值相比，培养24小时后指示菌的OD₆₀₀值不发生明显增加的最低浓度即为ZFM54副干酪乳杆菌素对指示菌的MIC。

ZFM54副干酪乳杆菌素的热稳定性研究：

将ZFM54副干酪乳杆菌素溶液(15μg/mL)分别在40℃、50℃、60℃、70℃、 80℃、90℃和100℃温度下处理30min，处理完毕后于4℃保存，以未经热处理的ZFM54副干酪乳杆菌素为对照，以M.luteus 10209作为指示菌，用牛津杯法检测抑菌活性。设置三组平行实验。

ZFM54副干酪乳杆菌素的pH稳定性研究：

将ZFM54副干酪乳杆菌素溶液(15μg/mL)分别用1mol/L的HCl和NaOH 溶液调节pH为2.0、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0，以M.luteus 10209为指示菌，用牛津杯法检测抑菌活性。设置三组平行实验。

ZFM54副干酪乳杆菌素的酶敏感性研究：

将ZFM54副干酪乳杆菌素溶液(15μg/mL)的pH调节到各种酶的最适pH，分别加入胃蛋白酶(pH2.0)、胰蛋白酶(pH5.4)、木瓜蛋白酶(pH7.0)、蛋白酶K(pH7.6)、溶菌酶(pH6.5)、α-淀粉酶(pH6.5)、脂肪酶(pH6.0)、核糖核酸酶(pH7.5)，使酶终浓度为1mg/mL，混匀后37℃水浴2h，将溶液调回初始pH值，以未经蛋白酶处理的副干酪乳杆菌素溶液为对照，采用牛津杯法检测对M.luteus 10209的抑菌活性。设置三组平行实验。

荧光泄漏试验：

前面章节的研究发现ZFM54副干酪乳杆菌素对革兰氏阳性菌中的藤黄微球菌10209(M.luteus 10209)和革兰氏阴性菌中的鼠伤寒沙门氏菌CMCC 50015(S.typhimurium CMCC 50015)的抑菌效果最好，因此分别以M.luteus 10209和S.typhimurium CMCC 50015为指示菌，用细胞膜荧光探针 3,3'-Diethylthiadicarbocyanine iodide[DisC₂(5)]^[111]进行荧光泄露实验。具体操作如下：

(1)将活化后的指示菌以1％的接种量接种到20mL的LB液体培养基，于 37℃的摇床中培养至指数生长期(即OD_600nm＝0.6～0.8)；

(2)在4℃，4000r/min离心30min后弃去上清，用10mL荧光泄露专用缓冲液洗涤菌体沉淀两次，然后用2mL同一缓冲液将菌体重悬，置于冰上备用；

(3)打开仪器和软件，在参数界面设置激发波长(Excitaton Wavelength,Ex) 为650nm，发射波长(Emission Wavelength,Em)为670nm，扫描自动结束时间为20min；

(4)在荧光比色皿中加入2mL荧光泄露专用缓冲液并调零；

(5)按顺序向荧光比色皿中加入2mL荧光泄露专用缓冲液，20μL菌液，将荧光比色皿放入荧光分光光度计中，放入转子搅拌均匀，加入2.5μL 0.1mM 的DisC₂(5)探针后，马上点击Start开始检测；

(6)等待荧光响应值不再下降，趋于稳定后，分别向荧光比色皿中加入终浓度为对指示菌一个MIC浓度的ZFM54副干酪乳杆菌素溶液，以加入同样体积的1％Triton X-100溶液作为阳性对照，以加入同样体积的0.05％(W/V)醋酸缓冲液作为阴性对照，观察荧光响应值变化；

(7)每组设置3个平行，重复三次试验，确保试验的准确性。

ZFM54副干酪乳杆菌素与Lipid II结合实验：

目前根据文献报道已知Lipid II是Nisin在细胞膜上的作用靶点，所以选择Nisin作为阳性对照，探究Lipid II是否可以与ZFM54副干酪乳杆菌素结合。

样品准备：取ZFM54副干酪乳杆菌素与Lipid II混合，使混合液中ZFM54 抗菌物质的终浓度为20μg/mL，Lipid II的终浓度为1mM；取Nisin与Lipid II 混合，使混合液中Nisin的终浓度为10μM，Lipid II的终浓度为1mM；以M. luteus 10209作为指示菌，用牛津杯法进行抑菌活性检测。重复三次实验并观察抑菌圈情况。

结果与讨论：

ZFM54副干酪乳杆菌素的抑菌谱及最小抑菌浓度：

表11ZFM54副干酪乳杆菌素的抗菌谱及最小抑菌浓度

Table 11Inhibition spectrum and MIC of ZFM54

对纯化获得的ZFM54副干酪乳杆菌素进行抑菌谱和最小抑菌浓度测定，结果见表11。由表中结果可知，ZFM54副干酪乳杆菌素对多种革兰氏阳性菌、阴性菌均有抑制作用，抑菌谱较广，且对多数食源性致病菌有较好抑菌作用，特别是对食品中常见的致病菌鼠伤寒沙门氏菌CMCC 50015和单增李斯特氏菌LM1 有较强的抑制作用，所以具有作为食品生物防腐剂的潜在应用价值。在革兰氏阳性菌中，对藤黄微球菌10209和蝇葡萄菌的抑菌效果最好，MIC为3.00μg/mL；在革兰氏阴性菌中，对鼠伤寒沙门氏菌CMCC 50015和枯草芽孢杆菌BAS2的抑菌效果最好，MIC为3.50μg/mL。

ZFM54副干酪乳杆菌素的热稳定性：

经不同温度处理ZFM54副干酪乳杆菌素30min后的抑菌活性如图13所示。可以看到，ZFM54副干酪乳杆菌素经过40℃、50℃、60℃、70℃、80℃，30min 处理后，效价与未热处理的对照组相比无明显变化，抑菌活性基本保持不变。经过100℃处理30min之后，可以看到抑菌圈直径有所减小，但仍保持了72％的抑菌活性。说明副干酪乳杆菌ZFM54所产细菌素具有良好的热稳定性。

ZFM54副干酪乳杆菌素的pH稳定性：

ZFM54副干酪乳杆菌素在不同pH环境中对藤黄微球菌的抑菌效果如图14 所示。从图中可以看出，随着pH值的升高，抑菌活性呈现减弱趋势，在pH为 5的环境中，抑菌活性显著降低，而当pH＞5时完全丧失抑菌活性，分析其原因推测可能是pH影响了肽链上氨基质子化程度，另一方面较高的pH可能影响了副干酪乳杆菌素对指示菌菌体表面的吸附作用，从而影响其抑菌作用的发挥。从以上结果可知，pH值对ZFM54副干酪乳杆菌素的活性具有显著影响，其在酸性环境中才能保持稳定状态，具有良好的抑菌活性，这与许多乳酸菌细菌素特性相似。

ZFM54副干酪乳杆菌素的酶敏感性：

ZFM54副干酪乳杆菌素经过8种不同类型的酶处理，剩余的抑菌活性结果如图15所示。由图可知，ZFM54细菌素类物质经过不同的蛋白酶处理后抑菌活性有不同程度的下降，对胰蛋白酶和蛋白酶K非常敏感，丧失大部分抑菌活性；对胃蛋白酶较敏感，对木瓜蛋白酶敏感度一般；对α-淀粉酶、溶菌酶、脂肪酶和核糖核酸酶A不敏感。总体敏感程度为：胰蛋白酶>蛋白酶K>胃蛋白酶>核糖核酸酶A>溶菌酶>脂肪酶>α-淀粉酶。

ZFM54副干酪乳杆菌素对细胞膜完整性的影响：

如果细菌素能破坏敏感菌的细胞膜则势必会引起细菌细胞膜质子动力势的耗散，因此我们利用荧光泄露试验的方法来探究ZFM54副干酪乳杆菌素的抑菌机理是否是造成“膜孔洞”。DisC₂(5)是一种对膜电势敏感的亲脂性阳离子荧光染料，可根据膜电位梯度分布在细胞和周围环境中，逐渐与膜结合并进入聚集在磷脂双分子层，发生荧光淬灭。当有可渗透膜的物质打破膜电势差，胞内DisC₂(5) 排出，在发射波长(Em)670nm和激发波长(Ex)650nm条件下，荧光信号会逐渐增强。通过在指示菌菌液中加入荧光染料DisC₂(5)来监测ZFM54副干酪乳杆菌素作用后的藤黄微球菌10209细胞膜电势差的变化情况来说明细胞膜是否有破损。而Triton X-100(聚乙二醇辛基苯基醚)作为一种表面活化剂，可以增强细胞膜的通透性，因此将1％Triton X-100作为阳性对照。结果如图16所示。

从图16中可以看出，在荧光泄露缓冲液和菌液的混合液中加入DisC₂(5)后，荧光发生淬灭，荧光强度响应值迅速减小并趋于稳定。随后加入使其终浓度达到指示菌MIC的ZFM54副干酪乳杆菌素后，荧光信号值开始上升，最后也趋于平稳。当不添加任何可渗透膜的物质，只加入相同量的溶解ZFM54副干酪乳杆菌素的0.05％醋酸溶液时，荧光在淬灭后没有增强的趋势，一直处于稳定状态。当加入1％Triton X-100时，荧光响应值迅速上升，最后趋于平稳。因此，可以说明ZFM54副干酪乳杆菌素能够迅速渗透藤黄微球菌10209的细胞膜，打破膜电势差，导致DisC₂(5)泄露，使荧光信号迅速加强。

对ZFM54副干酪乳杆菌素的抑菌谱和最小抑菌浓度(MIC)进行了测定，结果发现副干酪乳杆菌ZFM54所产细菌素对大部分革兰氏阳性菌和阴性菌都有抑制作用，但对真菌不具有抗菌效果。在革兰氏阳性菌中，ZFM54副干酪乳杆菌素对几种葡萄球菌和单增李斯特氏菌均有较好的抗菌作用，其中对藤黄微球菌的抗菌效果最好，最小抑菌浓度为3.00μg/mL。革兰氏阴性菌中，ZFM54副干酪乳杆菌素对4种沙门氏菌也有很好的抑制作用，其中对鼠伤寒沙门氏菌的抗菌效果最好，最小抑菌浓度为3.50μg/mL。从结果来看，ZFM54副干酪乳杆菌素具有广谱抗菌性，弥补了大多数细菌素对革兰氏阴性菌抑菌效果差的不足，并且其对食源性致病菌沙门氏菌的良好抑菌作用，使其在食品安全领域具有重大的应用价值。

为了更好的指导ZFM54副干酪乳杆菌素作为食品防腐剂的应用，我们选取与食品加工生产中密切相关的不同条件变化，考察了温度、pH和酶对其抑菌活性的影响。热稳定性研究中发现，ZFM54副干酪乳杆菌素对热稳定，40～80℃处理30min后抑菌活性基本不变，90℃、100℃热处理30min后抑菌活性有所下降，但仍保持了72％以上的抑菌活性。由于热加工是食品加工中常用的方法，而副干酪乳杆菌ZFM54所产生的细菌素具有很好的热稳定性，使其在食品防腐方面被赋予了巨大的优势和发展潜力。大多数细菌素在酸性环境中稳定，在研究不同 pH环境对ZFM54副干酪乳杆菌素抑菌活性的影响时，发现其抑菌活性随pH值的升高而逐渐减弱，在pH为5的环境中，抑菌活性显著降低，而当pH＞5时完全丧失抑菌活性，说明pH值对ZFM54副干酪乳杆菌素的活性具有显著影响，其更适合应用于酸性物质的防腐。Jianyin Miao等从L.paracasei subsp.tolerans FX-6菌株中分离出的新型细菌素在中性和碱性条件下也具有强抑菌作用，葛青萍等分离纯化L.paracasei HD1.7所产生的细菌素并研究其特性发现其在 pH2.0～6.0有很强的抑菌效果，pH＞6时没有抑菌效果，说明细菌素对pH的稳定性存在菌株特异性。酶敏感性研究发现，ZFM54副干酪乳杆菌素经过不同的蛋白酶处理后抑菌活性有不同程度的下降，对胰蛋白酶和蛋白酶K非常敏感，对胃蛋白酶较敏感，对木瓜蛋白酶敏感度一般。对α-淀粉酶、溶菌酶、脂肪酶和核糖核酸酶A不敏感。

通过荧光泄露试验和与LipidⅡ结合抑菌试验来探究ZFM54副干酪乳杆菌素的抑菌机理。结果表明：经ZFM54副干酪乳杆菌素处理的指示菌细胞膜发生破损，细胞的通透性增大。而LipidⅡ未对ZFM54副干酪乳杆菌素的抑菌活性造成影响，说明LipidⅡ不是ZFM54副干酪乳杆菌素在细胞膜上的特异性作用靶点。

本领域的技术人员应理解，上述描述及附图中所示的本发明的实施例只作为举例而并不限制本发明。本发明的目的已经完整并有效地实现。本发明的功能及结构原理已在实施例中展示和说明，在没有背离所述原理下，本发明的实施方式可以有任何变形或修改。

Claims (20)

1.一副干酪乳杆菌，其特征在于，所述副干酪乳杆菌的保藏编号CCTCC NO:M 2016667。

2.根据权利要求1所述的副干酪乳杆菌，其中所述副干酪乳杆菌来源于婴儿粪便。

3.一副干酪乳杆菌的应用，其特征在于，应用安全有效量的副干酪乳杆菌和/所述副干酪代谢产物，其中所述副干酪乳杆菌的保藏编号CCTCC NO:M 2016667。

4.根据权利要求3所述的副干酪乳杆菌的应用，其中所述副干酪乳杆菌的代谢产物为蛋白质或者是多肽。

5.一副干酪乳杆菌的应用，其特征在于，应用保藏编号CCTCC NO:M 2016667的副干酪乳杆菌于发酵。

6.根据权利要求5所述的副干酪乳酸菌素的应用，其中所述副干酪乳杆菌在30～37℃环境下发酵。

7.一副干酪乳杆菌的应用，其特征在于，应用保藏编号CCTCC NO:M 2016667的副干酪乳杆菌于抑菌。

8.根据权利要求6所述的副干酪乳杆菌的应用，其中副干酪乳杆菌应用于抑制致病菌鼠伤寒沙门氏菌CMCC 50015；或者单增李斯特氏菌LM1；或者是鼠伤寒沙门氏菌CMCC50015；或者是枯草芽孢杆菌BAS2。

9.一生产方法，其特征在于，包括如下步骤：

在适合培养的条件下，对于保藏编号CCTCC NO:M 2016667的副干酪乳杆菌进行培养，从而获得培养产物。

10.根据权利要求9所述的生产方法，其中所述副干酪乳杆菌在30～37℃环境下培养。

11.根据权利要求10所述的生产方法，其中所述副干酪乳杆菌以1％～3％的接种量发酵。

12.根据权利要求9所述的生产方法，其中所述副干酪乳菌被保藏在-80℃甘油管。

13.根据权利要求12所述的生产方法，其中所述副干酪乳菌在固体培养基进行活化，然后在液体培养基进行培养。

14.根据权利要求13所述的生产方法，其中所述副干酪乳菌在液体培养基中37℃培养24小时后，以接种量2％在更大容量的液体培养基中培养。

15.根据权利要求9所述的生产方法，其中所述培养产物在40℃至100℃具有抑菌活性。

16.根据权利要求9所述的生产方法，其中所述培养产物在酸性环境中具有抑菌活性。

17.根据权利要求9所述的生产方法，其中所述培养产物对于致病菌鼠伤寒沙门氏菌CMCC 50015、单增李斯特氏菌LM1、藤黄微球菌10209、蝇葡萄菌、鼠伤寒沙门氏菌CMCC50015或者枯草芽孢杆菌BAS2具有抑菌活性。

18.一细菌素，其特征在于，通过保藏编号CCTCC NO:M 2016667的副干酪乳杆菌生产。

19.根据权利要求18所述的细菌素，其中所述细菌素应用于酸性环境的抑菌。

20.根据权利要求18所述的细菌素，其中所述细菌素应用于食品生物防腐剂。

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