CN113999793A - 一株发酵特性良好且具有产香功能的植物乳杆菌及其筛选方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一株发酵特性良好且具有产香功能的植物乳杆菌及其在发酵香肠模拟体系中的应用，来提升其风味品质。本发明中的植物乳杆菌保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为：CGMCC No.22506，保藏日期为2021年05月06日，分类命名为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)。该菌株分离自黑龙江省牡丹江市的传统风干肠，其发酵特性能够满足肉类发酵剂的要求，适用于肉类发酵。该菌株能够提升发酵香肠模拟体系中的游离氨基酸和挥发性化合物的含量，降低体系的pH，从而提升北方传统风干肠的风味和安全特性。

Description

一株发酵特性良好且具有产香功能的植物乳杆菌及其筛选 方法

技术领域

本发明属于微生物技术领域，涉及一株从风干肠中筛选出的发酵特性良好且具有产香功能的植物乳杆菌MDJ2(Lactobacillus plantarum MDJ2)及其筛选方法。

背景技术

风干肠是中国传统发酵肉制品之一，因其独特的口感和风味而深受广大消费者的欢迎。通常，风干肠主要由瘦肉和猪脂肪制成，与食盐、亚硝酸盐、酒、糖和香辛料混合均匀，然后灌入天然的猪肠衣中。香肠在通风良好的发酵室内储存10-15天自然发酵。自然发酵显著增加了微生物多样性，但由于环境、设备和发酵剂的不同，微生物差异很大，无法控制发酵的安全性和最终产品的品质。因此，不同批次的传统风干肠品质的一致性和安全性是亟待解决的热点问题。

合适发酵剂的使用可能是解决上述问题的有效途径之一。来源于发酵肉制品的原生发酵剂能够更好地适应肉类环境，并具有良好的发酵特性，如生长能力、产酸能力、耐高盐和低pH能力等。乳酸菌是发酵肉制品中最为常见的微生物，也通常作为发酵剂在发酵肉制品中使用。接种乳酸菌可降低发酵肉制品的pH，缩短发酵周期、改善组织结构，促进大分子物质的代谢，产生小分子物质，包括滋味物质、风味物质前体和挥发性风味物质，从而促进产品风味的形成，同时可抑制腐败微生物的生长，保证了发酵肉制品的安全性。

风味是消费者评价发酵肉制品的一个重要指标。风味物质及其前体物质通常是通过发酵过程中蛋白质和脂质的降解和代谢产生的，与微生物活动密切相关。乳酸菌能够促进蛋白质降解，蛋白质降解会产生多肽和游离氨基酸等前体物质，某些游离氨基酸通过微生物的转氨、脱氨和脱羧作用生成醛类、醇类、酯类和其他挥发性风味物质，从而促进产品的风味品质。基于此，乳酸菌接种发酵香肠可有效地提升发酵肉制品的风味，以期为发酵香肠的开发及品质提升提供理论依据。

发明内容

本发明的目的是选用一株发酵特性良好且具有产香功能的植物乳杆菌MDJ2，来提升发酵香肠的风味品质。

本发明的植物乳杆菌MDJ2(Lactobacillus plantarum MDJ2)为从发酵酸乳中提取并分离鉴定的菌种，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院中科院微生物研究所，其菌种保藏编号为：CGMCCNo.22506，保藏日期为2021年05月06日，菌种的分类命名为植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)。

本发明中的植物乳杆菌MDJ2具有以下生物学特性：

1、形态特征：植物乳杆菌MDJ2革兰氏染色结果为阳性，杆状，成短链状排列，无芽胞，无荚膜，无鞭毛。

2、菌落特征：植物乳杆菌MDJ2在MRS固体培养基上生长良好，菌落形态为白色、凸起、圆形，边缘光滑细密，直径约2-3mm。在液体培养基中均匀混浊生长。

保藏信息：

保藏单位全称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；

保藏单位简称：CGMCC；

保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院中科院微生物研究所；

保藏日期：CGMCC No.22506；

保藏日期：2021年05月06日。

附图说明

图1为接种植物乳杆菌MDJ2的发酵香肠模拟体系在发酵过程中的pH和乳酸菌数的变化。

具体实施方式

下面结合附图对本发明的技术方案作进一步的说明，但并不局限于此，凡是对本发明技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的保护范围中。

实施例1：传统风干肠样品的采集和乳酸菌的分离纯化

从北方5个地区(双鸭山、哈尔滨、鹤岗、黑河和牡丹江)采集传统风干肠样品，取10g绞碎的风干肠样品加入90mL浓度为0.85％(w/v)无菌生理盐水中，于摇床上震荡30min，经过10倍梯度稀释后，取100μL稀释液涂布于含有2％CaCO₃(w/v)的MRS琼脂平板上，置于微生物培养箱中37℃培养48h。选择平板中菌落个数在30-300的MRS琼脂平板，挑取平板上不同形态的且菌落周围存在透明的溶解圈的独立菌落，然后进一步在新的MRS琼脂平板上划线纯化，直至获得纯培养物，得到的菌株使用20％的甘油储藏在-80℃下备用。

实施例2：乳酸菌的鉴定

使用细菌基因组DNA提取试剂盒对纯化后的乳酸菌进行基因提取，采用16S rDNA的通用引物进行PCR扩增，引物为：27F(5'-AACTGAGTTTGATCCTGGCTC-3')和1492R(5'-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3')。PCR扩增条件：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸90s，共30个循环；72℃再延伸10min。PCR扩增产物用1％的琼脂糖凝胶电泳检测，并使用凝胶回收试剂盒回收目标产物进行DNA测序。将测序结果在美国国家生物技术信息中心(national center of biotechnology information，NCBI)的GenBank数据中进行局部序列比对基本检索工具(basic local alignment search tool，BLAST)比对搜索，选取同源性较高的模式菌株的16S rDNA序列。菌株MDJ2被鉴定为Lactobacillus plantarum，即植物乳杆菌。

实施例3：植物乳杆菌MDJ2的发酵特性表征

1、耐食盐、耐亚硝酸盐和耐酸特性的乳酸菌的筛选：将MRS液体培养基分别加入6％NaCl、150mg/100mL NaNO₂和调pH至4.0，121℃灭菌20min，冷却备用。将活化后的植物乳杆菌MDJ2以2％(v/v)的接种量分别接种到三种筛选培养基和正常培养基中，37℃条件下培养24h后取发酵液，测定其OD_{600 nm}值。计算公式：存活率(％)＝[(OD_样品–OD_空白)/OD_对照–OD_空白]×100。从表1可以看出，植物乳杆菌MDJ2对6％NaCl、150mg/100mL NaNO₂和pH 4.0的耐受性分别为62.96％、76.66％和66.16％，具有良好的耐受性。

2、蛋白质和脂质水解试验：将活化菌株分别接种于含有1％(w/v)脱脂乳粉和0.1％三丁酸甘油酯的MRS琼脂培养基中，分别在37℃条件下培养48h和72h。观察菌落周围是否出现透明圈，有透明的水解圈的菌落被认为具有蛋白水解活性和脂质水解活性。从表1可以看出，植物乳杆菌MDJ2具有蛋白水解能力，不具有脂质水解能力。

3、抑菌试验：首先将指示菌培养物(金黄色葡萄球菌和大肠杆菌)0.1mL溶于琼脂倒在平板上，然后将牛津杯均匀放置在平板上。将菌株用液体培养基培养18h活化后，菌液6000×g离心10min，得上清液用牛津杯法做抑菌试验，37℃培养48h，测定抑菌圈直径(mm)。从表1可以看出，植物乳杆菌MDJ2能够抑制发酵肉制品常见的腐败微生物(金黄色葡萄球菌和大肠杆菌)，抑制效果良好。

表1植物乳杆菌的发酵特性表征

注：+表示阳性结果，-表示阴性结果。

实施例4：植物乳杆菌MDJ2应用于发酵香肠模拟体系

1、发酵剂的制备

将发酵特性良好的植物乳杆菌MDJ2接种到MRS肉汤培养基中进行发酵培养，37℃培养18h。发酵液于4℃条件下，10000×g离心10min，收集沉淀并使用无菌生理盐水洗涤两次。将制备好的发酵剂以10⁷CFU/g接种于发酵香肠模拟体系中。

2、发酵香肠模拟体系的制备

发酵香肠模拟体系是使用提取的肌原纤维蛋白、脂肪和其他辅料制备的。使用绞肉机将瘦肉和肥肉绞碎，瘦肉(猪臀肉)用来提取肌原纤维蛋白。辅料溶液(g/L)包括：NaCl(12.5)、葡萄糖(25.0)、亚硝酸钠(0.045)，味精(1.5)，白酒(5.0)和混合香辛料(4.0)。该溶液通过0.22μm滤膜进行灭菌。将肌原纤维蛋白沉淀(175.0g)、猪脂肪(75.0g)和500mL溶液(添加辅料)均质达到稳定均匀的状态。试验分为两组，试验组(接种植物乳杆菌MDJ2)和对照组(未接种)分别制备发酵香肠模拟体系。在温度为25±2℃的条件下发酵3天，测定模拟体系在发酵过程中的乳酸菌数和pH变化情况，并测定发酵末期的游离氨基酸含量和挥发性化合物含量。

从图1可以看出，植物乳杆菌在模拟体系中能够显著地增殖和生长，植物乳杆菌在发酵香肠模拟体系中产生了有机酸，能够显著地降低模拟体系的pH，保证产品的安全性。

3、发酵香肠模拟体系中游离氨基酸的测定

发酵香肠模拟体系样品(10.0g)于0.1mol/L HCl 1:5(w/v)均质30min，然后在0℃下10000×g离心20min，取上清液通过0.45μm的滤膜过滤。然后，将1.0mL液体转移到玻璃管并使用异硫氰酸苯酯(PITC)试剂进行衍生化。使用配备Accucore C18柱(3×150mm,2.6μm)的高效液相色谱系统分析氨基酸，检测波长为254nm，流速为1mL/min。通过比较每种氨基酸标准品的保留时间和峰面积来定性和定量体系中的每种氨基酸。

表2不同香肠体系处理组的游离氨基酸的含量

注：同行中不同小写字母表示样品差异显著(P<0.05)。

n.d.：未检出。

从表2可以看出，发酵香肠模拟体系中接种植物乳杆菌能够提升谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、甲硫氨酸、半胱氨酸和异亮氨酸的含量。由于氨基酸是风味物质的重要前体物质，接种植物乳杆菌的试验组与对照组相比降低了模拟体系的总氨基酸含量，可能是其中的酶将体系中的氨基酸转化成风味物质，促进产品风味的形成。

4、挥发性化合物的测定

采用顶空固相微萃取的方法提取风干肠中的挥发性化合物。将两组发酵香肠模拟体系样品(3.0g)放入20mL顶空样品瓶中，加入4μL邻二氯苯作为内标物。在45℃条件下用50/30μm DVB/CAR/PDMS萃取头顶空吸附30min，然后立即将萃取头插入气质进样口，解析3min。挥发性化合物的测定使用气相色谱-质谱(GC-MS)系统(QP2020，岛津)，气相色谱条件：InertCap WaX毛细管柱(60m×0.25mm×0.25μm)；进样口温度为230℃；不分流模式进样；以氦气为载体，流速为1mL/min；程序升温：柱初温40℃，保持3min，以5℃/min升至200℃，再以10℃/min升至230℃，保持2min。质谱条件：离子源温度230℃；质量扫描范围45-500(m/z)。挥发性化合物的鉴定是通过对比NIST 17质谱库，取相似度大于90％作为鉴定结果，并且通过计算标准烷烃(C6-C20)的保留指数(LRI)，与文献报道结果相比较进行辅助鉴定。挥发性化合物的定量采用内标法，以溶于正己烷的邻二氯苯溶液作为内标物质，定量结果以μg/kg表示。

表3不同香肠处理组挥发性化合物的含量

注：同行中不同小写字母表示样品差异显著(P<0.05)。

n.d.：未检出。

从表3可以看出，植物乳杆菌的接种能够显著增加发酵香肠模拟体系中的醛类、酸类和酯类物质的含量。试验组和对照组中的酮类、醇类和其他类挥发性化合物的含量无显著性差异。综上所述，发酵特性良好的植物乳杆菌的接种对发酵香肠模拟体系的风味具有提升作用。

Claims (4)

1.一株发酵特性良好且具有产香功能的植物乳杆菌MDJ2(Lactobacillus plantarumMDJ2)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏编号为：CGMCCNo.22506。

2.权利要求1所述的植物乳杆菌MDJ2，其特征在于，从东北地区传统风干肠中分离得到，筛选方法是：(1)从东北5个地区(双鸭山、哈尔滨、鹤岗、黑河和牡丹江)采集传统风干肠样品，采用传统平板分离方法从样品中分离乳酸菌。(2)通过菌体形态和16S rDNA序列鉴定，确定共分离出37株乳酸菌。(3)通过对食盐、亚硝酸钠和酸的耐受性、抑菌能力、蛋白质水解和脂质水解能力对37株乳酸菌进行筛选。(4)将发酵特性良好的乳酸菌接种于发酵香肠模拟体系中进行发酵试验，并对发酵过程中的发酵香肠模拟体系进行游离氨基酸含量和挥发性化合物含量进行测定，获得一株发酵性能良好且具有提升风味作用的植物乳杆菌MDJ2。

3.如权利要求1所述的植物乳杆菌MDJ2发酵剂的制备，其特征在于：将植物乳杆菌MDJ2在MRS液体培养基中37℃培养18h，在4℃下10000×g离心10min，收集沉淀并使用无菌生理盐水洗涤两次待用。

4.权利要求1所述的植物乳杆菌MDJ2在发酵香肠模拟体系中的应用，其特征在于：(1)发酵香肠模拟体系是使用提取的肌原纤维蛋白、脂肪和其他辅料制备的。辅料溶液(g/L)包括：NaCl(12.5)、葡萄糖(25.0)、亚硝酸钠(0.045)，味精(1.5)，白酒(5.0)和混合香辛料(4.0)。该溶液通过0.22μm滤膜进行灭菌。将肌原纤维蛋白沉淀(175.0g)、猪脂肪(75.0g)和500mL溶液(添加辅料)均质达到稳定均匀的状态。(2)将权利要求3所制备的发酵剂接种到发酵香肠模拟体系中，接种量为10⁷CFU/g。(3)发酵香肠模拟体系在温度为25±2℃的条件下发酵3天。

Images