CN114591872B - 一种风干肠发酵剂及其应用以及风干肠的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种风干肠发酵剂及其应用以及风干肠的制备方法，涉及生物发酵技术领域。该风干肠发酵剂，包括植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)SL1和植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)SL1蛋白酶中的至少一种；该植物乳杆菌保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2022015，保藏日期为2022年1月5日，保藏地址为中国.武汉.武汉大学。该植物乳杆菌和其所分泌的蛋白酶，可以提升风干肠的食用品质，产品的pH、水分含量、水分分布、色泽、质构特性等均有显著的改善。

Description

一种风干肠发酵剂及其应用以及风干肠的制备方法
技术领域
本发明涉及生物发酵技术领域，特别是涉及一种风干肠发酵剂及其应用以及风干肠的制备方法。
背景技术
随着生活水平的不断提高，健康合理、营养均衡的理念已逐渐成为消费者的饮食标准，发酵肉制品具有极高的营养价值和独特的风味，因此其受到越来越多消费者的 青睐，成为居民日常膳食中的重要组成部分。发酵肉制品是原料肉在自然或人工控制 条件下，借助微生物发酵作用，产生的具有典型发酵风味、色泽和质地，且具有较长保存期的一类肉制品，我国的金华火腿、宣威火腿、腊肉腊肠以及欧美国家的干肠、 半干肠等均为发酵肉制品的重要组成。哈尔滨风干肠是一种极具我国北方地域特色的 发酵肉制品，其特有的原料、发酵剂和发酵条件等使得哈尔滨风干肠的质地风味明显 区别于其它发酵肉制品。而我国传统风干肠生产技术仍处于凭经验来控制风干肠质量 的阶段，未建立完善的生产体系与参数，这使得不同批次的产品的品质与风味出现波 动，生产周期变长，肉的发酵与成熟受到影响。
目前，国内外对于常见的发酵肉制品中的内源性蛋白酶的研究已经趋近于完善，内源性蛋白酶的活力及其对产品风味的影响已被广泛的研究。而对于分离自发酵肉制 品中的微生物蛋白酶的研究，目前仍不够深入，这可能既由微生物生长代谢的复杂性 所致，又与微生物的多样性有关。开发可促进哈尔滨风干肠发酵风味形成的微生物发酵剂，探究微生物蛋白酶的性质和其与底物的作用机制，探讨发酵风味形成的机理， 可为生产适合我国消费者口味与习惯的发酵肉制品提供一定的理论基础和技术指导。
发明内容
本发明的目的是提供一种风干肠发酵剂及其应用以及风干肠的制备方法，以解决上述现有技术存在的问题，接种植物乳杆菌SL1和其所分泌的蛋白酶，可以提升风干 肠的食用品质。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明提供一种风干肠发酵剂，包括植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)SL1和植物 乳杆菌(Lactobacillus plantarum)SL1蛋白酶中的至少一种；
所述植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)SL1保藏在中国典型培养物保藏中心， 保藏编号为CCTCC NO：M 2022015，保藏日期为2022年1月5日，保藏地址为中国. 武汉.武汉大学；
所述植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)SL1蛋白酶的制备方法包括以下步骤：
(1)所述植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)SL1发酵培养得到发酵液，之后离心得到上清液，对所述上清液进行盐析处理，得到粗酶液；
(2)所述粗酶液经阴离子交换层析和凝胶过滤分离纯化，得到所述植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)SL1蛋白酶。
本发明还提供上述的风干肠发酵剂在风干肠发酵中的应用。
本发明还提供一种风干肠的制备方法，包括如下步骤：
(1)猪肉加入辅料混合均匀后，加工成肉馅；
(2)在所述肉馅中加入上述的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)SL1和植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)SL1蛋白酶中的至少一种，混合均匀后灌入天然猪肠衣内，风干后发酵，即得所述风干肠。
进一步地，在步骤(2)中，当所述肉馅中加入植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum) SL1时，所述植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)SL1在所述肉馅中的浓度为107cfu/g。
进一步地，在步骤(2)中，当所述肉馅中加入植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum) SL1蛋白酶时，所述植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)SL1蛋白酶在所述肉馅中的 浓度为3mg/100g。
进一步地，在步骤(2)中，当所述肉馅中同时加入植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)SL1和植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)SL1蛋白酶时，所述植物乳杆 菌(Lactobacillus plantarum)SL1在所述肉馅中的浓度为107cfu/g，所述植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)SL1蛋白酶在所述肉馅中的浓度为3mg/100g。
进一步地，在步骤(2)中，所述发酵的发酵时间为9d。
本发明还提供一种根据上述的制备方法制备得到的风干肠。
本发明公开了以下技术效果：
植物乳杆菌SL1所产蛋白酶可与肌动蛋白发生反应，生成发酵肉制品风味物质前体。接种植物乳杆菌SL1和其所分泌的蛋白酶，风干肠的食用品质可得到一定程度的 提升，产品的pH、水分含量、水分分布、色泽、质构特性等均有显著的改善。
通过感官评定确定，通过混合接种植物乳杆菌SL1和其蛋白酶作用后的产品，总体可接受较强，肠体色泽红润，发酵风味浓郁，酸度适宜，口感较佳，因此其二者联 合使用可作为改善风干肠品质特性以及促进风味形成的肉品发酵剂。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些 实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据 这些附图获得其他的附图。
图1为植物乳杆菌SL1及其对应的蛋白酶在分解肌原纤维蛋白提取物过程中TCA-可溶性肽含量(mg/mL)的变化；不同上标字母a-i表示TCA-可溶性肽含量存在显著 差异(P＜0.05)；
图2为植物乳杆菌SL1及其对应的蛋白酶在分解肌浆蛋白提取物过程中TCA-可溶性肽含量(mg/mL)的变化；不同上标字母a-i表示TCA-可溶性肽含量存在显著差异 (P＜0.05)；
图3为接种植物乳杆菌SL1和蛋白酶的风干肠在发酵过程中pH的变化；
图4为接种植物乳杆菌SL1和蛋白酶的风干肠在发酵过程中水分含量(A)和水分活度(B)的变化；
图5为接种植物乳杆菌SL1和蛋白酶发酵后风干肠感官评定。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。 另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范 围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发 明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中 提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在 与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其 他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用 语，即意指包含但不限于。
以下实施例中所用菌株植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)SL1，分离于自然发 酵的哈尔滨风干肠中，并于2022年1月5日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编 号：CCTCC NO：M 2022015；保藏地址：中国.武汉.武汉大学。
实施例1
1.发酵培养
取菌株植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)SL1，活化后，接种于MRS培养基中，之后在温度为37℃，体系初始pH为5.0条件下，培养36h，得到发酵液。
2.蛋白酶纯化
2.1步骤1培养得到的发酵液于4℃下10000×g离心10min，收集上清液。用 20％-90％的不同饱和度硫酸铵溶液进行盐析并置于4℃冰箱过夜，隔天在4℃下10000 ×g离心15min后去上清液，得到粗酶液。
2.2采用阴离子交换层析(DEAE-Sepharose Fast Flow)柱对包含目的蛋白的粗酶液 进行纯化。在对DEAE-Sepharose Fast Flow预处理完成后进行装柱(3.0cm×40cm)， 用20mmol/LTris-HCl缓冲液(pH 7.0)对柱进行平衡，粗酶液每次的上样量为60mL， 用两个柱体积的20mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH 7.0)洗脱未结合蛋白，然后采用浓度 0-1.0mol/LNaCl Tris-HCl缓冲液(pH 7.0)线性洗脱层析柱上上结合的蛋白，最后用1 mol/LNaClTris-HCl缓冲液(pH 7.0)冲洗层析柱。流速1mL/min，每管收集10min， 以280nm紫外光在线跟踪洗脱液，通过酶标仪对所收集到的洗脱液组分进行酶活力分 析。
2.3用50mmol/L磷酸二氢钠-0.10mol/L氯化钠缓冲液(pH 7.0)平衡Seohadex G-75柱(1.6×80cm)，上样量由DEAE-Sepharose Fast Flow分离纯化出的具有蛋白酶 活力的收集液的管数决定(一般处于70-100mL之间)，并由平衡缓冲液洗脱，流速0.4 mL/min，每管收集时间为10min，以280nm紫外光在线跟踪洗脱液，通过酶标仪对所 收集到的洗脱液组分进行酶活力分析。经离子交换层析和凝胶过滤分离纯化后，植物 乳杆菌SL1所对应的酶液的蛋白浓度为0.16mg/mL，其比酶活力达到36.3U/mg，冻干， 备用。
3.TCA-可溶性肽含量的变化
分别向肌原纤维提取液中加入植物乳杆菌SL1和其纯化后的蛋白酶，以不添加植物乳杆菌、蛋白酶的提取液为空白(Control)，分别在培养时间为0-96h的范围内测定 体系中的TCA-可溶性肽含量的变化。如图1所示，未添加植物乳杆菌和蛋白酶的空白 样品，在0-96h的发酵过程中TCA-可溶性肽的含量基本处于0.21mg/mL至0.60mg/mL 之间，未表现出明显的上升趋势，这说明未添加菌株和酶的空白对照样中肌原纤维蛋 白基本未发生降解。而在接种了植物乳杆菌SL1的肌原纤维蛋白中，发酵24h后其TCA- 可溶性肽的含量迅速上升至4.86mg/mL；在发酵至48h时接种植物乳杆菌的肌原纤维蛋白样品中的TCA-可溶性肽含量达到最大(4.99mg/mL)，显著高于其它发酵时间点 对应的TCA-可溶性肽的含量(P＜0.05)；24-96h时接种植物乳杆菌的样品中TCA-可 溶性肽的含量呈现出下降的态势(P＜0.05)，这可能是由于植物乳杆菌为了维持自身的 生长代谢，将分解自肌原纤维蛋白提取液的小分子多肽作为氮源加以利用，以此进一步合成相关的酶类等胞内胞外代谢产物。在24-96h的发酵时间内，添加植物乳杆菌蛋 白酶的肌原纤维蛋白体系内的TCA-可溶性肽含量缓慢提升且始终高于直接添加植物 乳杆菌的反应组，植物乳杆菌SL1在96h时TCA-可溶性肽含量达到了5.88mg/mL。 在反应最后阶段(72-96h)，蛋白酶组中TCA-可溶性肽的含量上升趋势逐渐放缓(P ＞0.05)，这不仅是因为蛋白酶活力在与底物作用的过程中活力逐渐丧失，也与肌原纤维蛋白底物的降解消耗有关。
以肌浆蛋白作为底物，向其提取液中加入植物乳杆菌SL1和其纯化后的蛋白酶，以不添加植物乳杆菌、蛋白酶的提取液为空白(Control)，分别在培养时间为0-96h的 范围内测定体系中的TCA-可溶性肽含量的变化。如图2所示，未添加植物乳杆菌和蛋 白酶的空白样品，在0-96h的发酵过程中TCA-可溶性肽的含量基本处于0.30mg/mL 至0.76mg/mL之间，总体未表现出明显的上升趋势，这表明肌浆蛋白自身不会发生剧 烈的降解。而在加入植物乳杆菌和其对应的蛋白酶并分别与底物肌浆蛋白作用24h后， 体系中TCA-可溶性肽含量剧增且与空白相比差异显著(P＜0.05)，这表明植物乳杆菌 和蛋白酶均对底物肌浆蛋白具有一定的分解能力。植物乳杆菌SL1在48h时体系TCA- 可溶性肽含量达到最大(7.09mg/mL)，并在48-96h时逐渐降低，这种变化与此前讨 论的以肌原纤维为底物时体系TCA-可溶性肽含量的变化趋势类似，可能是由于植物乳 杆菌的氮源代谢引起。此外，植物乳杆菌蛋白酶与底物作用体系中TCA-可溶性肽的含 量均显著高于同一发酵时间下对应的植物乳杆菌与底物的作用体系(P＜0.05)，这说明 植物乳杆菌蛋白酶相比植物乳杆菌菌株在对底物肌浆蛋白作用具有更强的专一性与稳定性。当96h时植物乳杆菌SL1所产蛋白酶水解肌浆蛋白导致TCA-可溶性肽的含量 分别升至9.12mg/mL。
4.植物乳杆菌SL1和其蛋白酶对肌原纤维蛋白、肌浆蛋白水解产生的游离氨基酸
4.1对肌浆蛋白水解产生的游离氨基酸
表1为模拟体系中植物乳杆菌SL1及所产蛋白酶水解肌浆蛋白产生游离氨基酸的含量。以未添加植物乳杆菌和蛋白酶的样品作为对照。未添加植物乳杆菌和蛋白酶的 样品在4d时体系内的总游离氨基酸含量(10.78mg/100mL)含量与0d(9.53mg/100 mL)相比，基本没有显著的变化(P＞0.05)；在向肌浆蛋白体系中接种了植物乳杆菌 SL1后，体系内总游离氨基酸含量上升至14.19mg/100mL；在肌浆蛋白体系中添加纯 化自植物乳杆菌SL1的蛋白酶并发酵反应4d后，体系内总游离氨基酸含量提高到18.45 mg/100mL，显著高于4d时未添加植物乳杆菌株和蛋白酶的空白对照(10.78mg/100mL) (P＜0.05)。总之，植物乳杆菌所产蛋白酶在模拟体系中对肌浆蛋白的分解及总游离氨 基酸的生成的促进作用，要强于其对应的植物乳杆菌。这可能是由于植物乳杆菌胞外酶经分离纯化后，特异性蛋白酶活力得以充分体现与表达，而植物乳杆菌在模拟体系 中以肌浆蛋白为底物进行发酵的过程中，所产胞外粗蛋白酶的比酶活力不及纯化后的 酶，且由于植物乳杆菌对底物的分解代谢处于动态过程中，因此体系内游离氨基酸并非全部来源于植物乳杆菌蛋白酶的酶解，这造成了模拟体系中接种的植物乳杆菌菌株 和植物乳杆菌蛋白酶对肌浆蛋白的利用程度和总游离氨基酸含量的差异。这种差异不 仅在总游离氨基酸含量上有所体现，在特定的氨基酸上也有具体表达。
表1
注：同一行标注不同的字母(a-g)表示差异显著(P<0.05)。
4.2对肌原纤维蛋白水解产生的游离氨基酸
表2为在模拟体系中，植物乳杆菌SL1及其对应的分离纯化后的蛋白酶水解肌原纤维蛋白后，体系内的游离氨基酸的含量。与4.1中水解肌浆蛋白产生的游离氨基酸相 比，水解肌原纤维蛋白生成的游离氨基酸含量远低于前者，这说明植物乳杆菌及其分 泌的蛋白酶对肌浆蛋白的水解能力要强于肌原纤维蛋白。
在0d和4d时以未添加植物乳杆菌和蛋白酶的肌原纤蛋白样品作为对照。其中在4d时未添加任何菌株和酶类的样品其总游离氨基酸含量达到8.15mg/100mL，高于0d 时的6.79mg/100mL(P＜0.05)，这说明肌原纤维蛋白即使在没有植物乳杆菌菌株和蛋 白酶的参与下也会自发部分降解。而在向肌原纤维蛋白体系中接种植物乳杆菌SL1后， 模拟体系中总游离氨基酸含量分别上升至10.24mg/100mL，明显高于4d时的对照8.15 mg/100mL(P＜0.05)，表明植物乳杆菌菌株可一定程度上分解代谢部分肌原纤维蛋白， 使得体系内的总游离酸氨基酸含量显著提升。在肌原纤维蛋白模拟体系中加入分离纯 化自植物乳杆菌SL1的蛋白酶并发酵4d后，体系内的总游离氨基酸含量则分别达到 14.00mg/100mL，显著高于在4d时未接种植物乳杆菌株和蛋白酶的空白对照组(8.15 mg/100mL)(P＜0.05)，此外，添加蛋白酶的肌原纤维蛋白体系在发酵4d后总游离氨 基酸含量也显著高于接种菌株的组分(P＜0.05)。这表明添加分离纯化的蛋白酶相比植 物乳杆菌菌株，可相对彻底的将底物肌原纤维蛋白分解为游离氨基酸。
表2
注：同一行标注不同的字母(a-i)表示差异显著(P<0.05)。
5.植物乳杆菌及其蛋白酶对肌原纤维蛋白、肌浆蛋白水解产生的风味物质
5.1经植物乳杆菌及相应蛋白酶酶解后肌浆蛋白提取物中挥发性化合物的含量
植物乳杆菌SL1和其蛋白酶作用于肌浆蛋白后，生成的多种氨基酸不仅可对发酵风干肠的滋味产生促进，同时也对产品的风味起到重要的影响。为了深入探讨植物乳 杆菌菌株和植物乳杆菌蛋白酶对风味物质的影响，我们利用顶空固相微萃取气质联用 技术(SPME-GC-MS)，研究了含有肌浆蛋白的模拟体系中影响发酵气味的相关挥发性 物质，其经植物乳杆菌和相应蛋白酶作用后形成挥发性物质的情况如表3所示。
总体来讲，0d和4d的对照组相比，挥发性化合物的种类和含量基本未发生明显 的变化(P＞0.05)，而加入植物乳杆菌菌株后，相应的挥发性化合物的种类和含量均表 现出不同程度的变化。体系内生成的化合物主要可分为醇类、醛类、酮类、酯类、烷 烃类和呋喃类。植物乳杆菌对底物肌浆蛋白作用4d后，体系内醇类物质的种类含量相 比未接种菌株的对照组均有所增加(P＜0.05)。体系内的醇类物质主要有两个来源，部 分醇类(如己醇等直链醇)来自于脂质的自动氧化，其主要是由于肌浆蛋白在提取过程中残留了部分脂类物质，而这部分脂质在发酵4d后，自身发生了氧化。此外，在添 加植物乳杆菌蛋白酶的各肌浆蛋白组分中，也有醇类物质的生成。通过观察醛类物质 的种类与含量可知，0d与4d的对照组相比，醛类物质的种类未发生变化，己醛的含量有小幅的增加，庚醛的含量没出现显著的变化。而在接种了植物乳杆菌后，体系内 醛类含量均有所提升，且出现了壬醛、苯甲醛和苯乙醛等醛类物质。而在仅添加植物 乳杆菌蛋白酶的体系中，虽然也有相应的醛类物质的生成，但含量要低于接种植物乳 杆菌的组分(P＜0.05)。相关研究表明醛类物质的生成，主要是由于微生物对苯丙氨酸的代谢作用，在转氨酶的作用下，苯丙氨酸转化为苯丙酮酸，再经氧化进而转变为苯 甲醛。苯甲醛具有类似于杏仁味的特征风味，其可对产品的风味起到一定的提升作用。 此外，大部分醛类物质的生成需由支链氨基酸作为代谢底物进入植物乳杆菌的代谢体 系，而仅添加蛋白酶的组分中，底物肌浆蛋白虽然可以在酶作用下生成多种氨基酸， 但醛类风味物质的合成仍需植物乳杆菌的代谢作用方可奏效。因此仅添加植物乳杆菌 蛋白酶的组分中，醛类物质的含量相对较少。酮类物质的生成，则主要依靠微生物菌株对碳水化合物的代谢作用。因此其在蛋白酶反应组中的含量要远低于植物乳杆菌发 酵组。酸类物质的生成主要是由相应的醛类物质氧化和植物乳杆菌代谢碳水化合物产 生，因此接种植物乳杆菌的组别相对应用蛋白酶的组别，前者酸类物质的生成量要远 高于后者。对于酯类物质而言，在接种植物乳杆菌SL1的组分中，有少量的酯类物质 检出，这可能是由于蛋白酶中仍含有少量的酯酶。此外，各添加蛋白酶的组分中有呋喃类物质的检出，而接种菌株的组分中其含量相对较低。这可能是由于氨基酸的分解 会引起呋喃类物质的出现，而接种了菌株的组分中底物氨基酸大部分已进入了植物乳 杆菌的代谢，进而生成醛类等物质，而各植物乳杆菌所产蛋白酶仅能将肌浆蛋白底物 酶解，生成氨基酸和短肽等物质，这为氨基酸的进一步分解创造了有利的条件。
表3
5.2经植物乳杆菌及相应蛋白酶酶解后肌原纤维提取物中挥发性化合物的含量
在风干肠发酵过程中，植物乳杆菌SL1和其蛋白酶处于一个相对复杂的体系中。因此，在模拟体系中尽可能对复杂体系进行单一的还原便尤为重要。肌原纤维蛋白作 为存在于发酵体系中的另一种极为重要的底物蛋白，其对于挥发性化合物的影响也需 进一步的讨论。由表4可知，肌原纤维蛋白在各植物乳杆菌、蛋白酶体系中的变化趋 势与肌浆蛋白基本相似。
总体来看，以肌原纤维为底物时，植物乳杆菌和蛋白酶分解利用其蛋白生成的醇类、醛类、酮类、酸类等物质的含量，要略低于肌浆蛋白。从植物乳杆菌角度来看， 肌原纤维蛋白的利用难易度要高于肌浆蛋白，这可能是因为肌原纤维蛋白中包含了复 杂的蛋白体系和结构，植物乳杆菌对于大分子蛋白的分解利用能力相对较弱；从蛋白 酶方面来看，产自植物乳杆菌SL1的蛋白酶对于肌原纤维蛋白底物的酶解利用亦不及 肌浆蛋白。
表4
实施例2接种微生物菌株对风干肠品质及感官特性的影响
一、方法
1.1风干肠的制备
(1)原辅料：
瘦肉(猪臀肉，猪里脊)4.5kg，肥肉(猪背脂)0.5kg，50g麯酒(玉泉大麯)， 250g葡萄糖，15g味素，125g盐，0.5g亚硝酸钠，15g混合调料(混合调料包括： 肉桂、花椒、大料、茴香、白芷，砂仁、胡椒、豆蔻和丁香)。
(2)风干肠制作工艺流程
将活化好的植物乳杆菌SL1接种至MRS液体培养基中进行发酵培养，37℃培养12h。发酵液于4℃条件下，10000×g离心10min后，收集菌泥并测定其活菌含量。 首先取少量菌泥溶于无菌生理盐水中，并用该溶液稀释不同的梯度，适当选取2～3个 稀释度进行涂布于MRS固体培养基中于37℃培养24h，进行菌落计数，从而计算出最 初菌泥中的活菌含量。取1g菌泥(1010cfu/g)溶充分溶于5mL的生理盐水中，称为植 物乳杆菌SL1菌液，备用。
另外称取100mg分离自植物乳杆菌SL1的蛋白酶粉末(实施例1制备，酶活：36.30U/mg)加入5mL的娃哈哈纯净水中充分溶解，称为植物乳杆菌SL1蛋白酶溶液，备用。
将购买的新鲜原料肉置于冰上运送至食品学院畜产品中试加工车间，剔除淋巴，筋腱，血管等结缔组织后将猪瘦肉清理干净，用筛孔为1.5cm的绞肉机绞制，并将肥肉切成1cm3的立方块，取4.5kg猪瘦肉和0.5kg肥肉混合均匀后，再加入(1)中的 其他原辅料进行拌馅，肉馅混合均匀后置于4℃发酵30min。然后将其分成均等的4 份，1份不接菌不加酶为对照组；1份添加上述5mL的植物乳杆菌SL1菌液，边添加 边搅拌，使菌株终浓度约为107cfu/g肉馅；1份添加上述5mL的植物乳杆菌SL1蛋白 酶溶液；另一份添加植物乳杆菌SL1菌泥和植物乳杆菌SL1的蛋白酶粉末的混合溶液 5mL，边添加边搅拌，最终该菌株的浓度为107cfu/g肉馅，该蛋白酶的浓度为3mg/100g 肉馅；边添加边搅拌，最终该蛋白酶的浓度为3mg/100g肉馅，将肉馅充分混均后用灌 肠机将其灌入天然猪肠衣内，灌制不可太满，保证每根风干肠的直径约为2.5cm，重 量约0.15kg。将灌制好的风干肠先置于相对湿度为30-50％，温度为25±2℃环境下 风干12h，然后再移至相对湿度为75-80％，相对温度为25±2℃的恒温恒湿培养箱中发酵，分别在0、3、6和9天取样，对各组分进行相关指标的测定。
1.2游离氨基酸分析
(1)游离氨基酸的提取
精确称取5.0g风干肠，加入25mL 5％的高氯酸，均质5min。用5％的高氯酸定 容至25mL，4℃静置2h后过滤，滤液在10000×g的条件下离心5min，上清液中游 离氨基酸含量待测定分析。
(2)游离氨基酸总量的测定
采用三硝基苯磺酸TNBS对游离氨基酸总量进行测定。
(3)游离氨基酸组成的分析
上清液经0.45μm滤膜过滤处理，取清液20μL进入氨基酸自动分析仪进行游离氨基酸的检测。
1.3发酵风干肠风味物质的测定
采用顶空固相微萃取-气质联用技术，进行挥发性化合物的分析。准确量取5.0mL的提取物，加入15mL样品瓶中，将样品瓶放入60℃的水浴中平衡30min，将已老化 好的萃取针头插入样品瓶中，用手柄将石英纤维头推出暴露到样品瓶顶空气体中，恒 温60℃萃取30min，用手柄将纤维头推回针头内，将萃取针头拔出，插入GC-MS进 样器中解析。
气相色谱条件：HP20m弹性石英毛细管柱，50m×0.25mm×0.25μm；进样口温度250℃；载气He，流速0.9mL/min，不分流；程序升温：起始温度65℃，保持3min， 然后以5℃/min的升温速度升温至135℃，再以12℃/min升温至250℃，保持10min。 质谱条件：电离方式为EI；电子能量为70e V；发射电流为350μA；离子源温度为200℃；接口温度250℃；质量范围33-450amu。
实验数据处理由Xcalibur软件系统完成，未知化合物经计算机检索同时与NIST谱库和Wiley谱库相匹配，仅当正反匹配度均大于800(最大值为1000)的鉴定结果才予以 报道。化合物相对含量确定：采用面积归一化法。
1.4风干肠品质特性的测定
(1)pH
取切碎的风干肠样品10.0g于250mL锥形瓶中，加90.0mL蒸馏水，4℃摇床震 荡30min，过滤后取滤液测定pH值。
(2)色差
选用色差计反射模式。仪器经自检及零点、标准校正后，试样铺满样品池底部置于载样台上进行测量，样品池底部不能有空隙。测定时需将样品池沿一个方向旋转三 次，测定三次，输出值为其平均值。
(3)水分含量
恒温干燥法，参照GB/T 5009.3-2003进行测定。
(4)水分活度
在室温下除去风干肠肠衣，将样品切碎，铺满样品盒底部，使用AquaLab智能水 分活度仪测定，待仪器稳定后读数。
(5)质构剖面分析(TPA)测试
通过TPA试验测定风干肠的硬度及弹性两个主要的参数。测试时将风干肠切成3cm长(直径2.5cm)的小段，选择P/100探头，在物性仪TPA模式下对肉块进行下压 试验。每个样品重复测试10次，取其平均值。设定参数如下：测试模式TPA，测试前 速度5mm/s，测试中速度2mm/s，测试后速度2mm/s，压缩形变50％。
1.5风干肠感官评定
由本实验室的教师和研究生组成10人感官评定小组，男女各半，将待检测风干肠样品蒸制20min后，切成0.5cm厚度进行感官评定。采用双盲法进行检验，即对样品进行密码编号(本研究采用三位随机数字)，检验样品也随机化。在测定前首先品尝某 样品进行“热身”训练。每次评定由每个评定成员单独进行，相互不接触交流，样品 评定之间用清水漱口。评定指标包括颜色、气味、滋味、酸味、口感和总体可接受性。对于颜色，7分为颜色红润，有光泽，1分为颜色暗黑无光泽；气味，7分为具有发酵 肉制品特有的风味，1分风味较差；对于滋味，7分为发酵肉制品浓郁的香味，1分为 滋味很差；对于酸味，7分为酸味很重，无法接受，1分为没有酸味；对于口感，7分 为肉质非常硬，1分为肉嫩；对于总体可接受性，7分为可接受性高，1分为可接受性 低。
1.6统计分析
每个试验重复三次，结果表示为平均数±SD。数据统计分析采用Statistix 8.1(分 析软件，St Paul，MN)软件包中Linear Models程序进行，差异显著性(P<0.05)分 析使用Tukey HSD程序，采用Sigmaplot 12.0软件作图。
二、实验结果
2.1采用植物乳杆菌SL1及其蛋白酶发酵处理后的风干肠中游离氨基酸的含量
游离氨基酸的种类与含量对发酵肉制品的滋味具有一定的提升作用，如甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸和脯氨酸等会呈现出甜味，而天冬氨酸、谷氨酸等则会对产品的鲜味 的表达起到促进。此外，某些支链氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸等)可进入微 生物菌体的代谢途径，进而生成等甲基酮、甲基醛和甲基酸等发酵肉制品所独有的特 征风味物质。
经植物乳杆菌SL1和其蛋白酶分别对风干肠进行处理发酵后，我们对体系内17种游离氨基酸的组成和变化进行了测定，风干肠中所含游离氨基酸的组成与含量如表5 所示。
由表5可知，相比0d对照组，自然发酵9d后体系内的17种游离氨基酸的含量 均发生了明显的提升(P＜0.05)，其中尤其以谷氨酸(Glu)和甘氨酸(Ala)的变化最 为明显，分别从0d的21.31mg/100g和32.29mg/100g上升至9d时的403.14mg/100g 和101.30mg/100g。这说明风干肠的某些特征滋味和风味在自然发酵的条件下已在体系内有所形成。而在接种了植物乳杆菌SL1后，这两种氨基酸的含量在自然发酵9d的 基础上，进一步的表现出了上升的趋势。当体系未接种植物乳杆菌而是加入了植物乳 杆菌所产的蛋白酶时，谷氨酸(Glu)和甘氨酸(Ala)的含量也呈现上升态势且上升 幅度要明显高于接种植物乳杆菌菌株的组别(P＜0.05)。此外，加入蛋白酶的发酵组中， 丝氨酸(Ser)、亮氨酸(Leu)的含量相比9d的对照组和接种植物乳杆菌种的实验组 也有了显著提高(P＜0.05)，丝氨酸和亮氨酸的含量分别上升至50.54-58.43mg/100g 和42.83-52.15mg/100g。这些氨基酸是风味物质的前体，但同时也能够令产品生成一定的苦味。过量的苦味可使产品的风味、滋味等受到影响，而适度的苦味则有利于发酵 肉制品整体特征风味的形成。由表5可得，接种植物乳杆菌菌株和添加相关蛋白酶均 有利于发酵产品独特特征风味的形成。
表5
注：同一行标注不同的字母(a-h)表示差异显著(P<0.05)。
2.2风干肠中挥发性物质的分析
在发酵肉体系中，经过一定时间的发酵后体系内挥发性物质的种类与含量较模拟体系相比有了极大程度的丰富。这是由于在发酵体系中其底物成分相对复杂，除去常 见的肉蛋白外，还存在着脂质、添加物(盐类、糖类、香辛料等)及其它外源性物质； 从发酵过程中的反应进程来看，除植物乳杆菌自身代谢、蛋白酶酶解等反应外，体系 内还会发生水解、氧化等复杂的反应变化。但所有的变化并非独立存在，而是在某种程度上存在着内在的联系。如蛋白质可被蛋白酶在特定位点酶解，所生成的氨基酸一 方面生成小分子的风味物质，一方面其进入植物乳杆菌代谢循环，在促进菌体繁殖的 同时，还会在胞内酶的作用下生成相应的代谢产物，代谢产物一部分可作为产品风味 滋味的前体物质，同时也存在着具有抑菌、抗氧化、胞外脂肪酶、酯酶等胞外产物， 这部分产物亦可对发酵肉制品的安全性、功能特性及风味产生一定的促进或抑制作用。发酵肉制品的风味作为产品特性最直观的体现，因此对其在发酵过程中于产品内部形 成的种类与含量进行研究，便显得尤为重要。
醛类化合物相比其它化合物，其阈值相对较低，且其具有脂肪的香味，因此其对发酵肉制品的风味具有极大的影响。己醛会产生原生味、鲜香味及类醛的特征风味， 其主要来自ω-6不饱和脂肪酸，当己醛的含量较高时，会令体系呈现青草味，因此其在发酵体系中的含量需控制在一定范围之内。本实施例中0d时空白对照组(control)的 己醛的含量仅为6.32，9d时自然发酵对照组的含量便上升至69.13；而接种了植物乳 杆菌SL1和相应蛋白酶的实验组中其含量相比9d的对照组出现显著下降，而当菌种 和蛋白酶共同作用于发酵体系后，己醛的含量相比实验组有所上升但仍低于自然发酵 的对照组。庚醛与壬醛分别具有类似于油脂的气味和柑橘的清香味，由表5可知相比 自然发酵9d的对照，接种菌株和添加植物乳杆菌蛋白酶均可降低其在发酵体系内的含量；而当菌株和蛋白酶共同作用时，二者的含量相比对照组反而有所提升，这对相应 的特征风味加强起到了一定的促进作用。苯甲醛和苯乙醛具有强烈的甜橙香气和油脂 香味，单独在体系内应用蛋白酶会令二者的含量有所下降，植物乳杆菌SL1和蛋白酶 的共同作用却能使其含量得到了一定的提升。醛类物质的生成主要来自于发酵体系内 脂质的水解和氧化，它对产品的风味形成具有双面性——适当的水解和氧化可促进产 品的风味，而过度的氧化则可令体系产生酸败味。我们加入体系的蛋白酶中残留的脂 肪酶可加速脂质的水解，同时在发酵过程中脂质存在着氧化，而相关研究表明接种至 发酵体系中的植物乳杆菌SL1存在着抑制脂质氧化的能力，而这种抑制能力是建立在 菌种代谢活力的基础上，而蛋白酶的酶解产物又恰好可在一定程度上促进或抑制菌种的代谢进程。因此，在菌种和蛋白酶共同作用于体系后，不同的醛类物质相比对照出 现了升高或降低的趋势，故对发酵体系的整体风味起到了较好的控制作用。
大多数醇类化合物的阈值较高，而不饱和醇类的阈值相对较低且对发酵体系的芳香味具有一定的促进作用，由表6可知同时添加植物乳杆菌SL1和蛋白酶的实验组，其大部分醇类物质的含量要高于二者单独使用及9d时的对照组。酸类物质作为发酵风 干肠的一种极具特色和辨识度的风味物质，其在发酵体系内的含量也极其重要。在经 过植物乳杆菌与酶的协同作用后，体系内的各种酸类物质相比对照组均有不同程度的 提升。酮类化合物多数是由于不饱和脂肪酸的氧化、氨基酸降解和微生物氧化所产生， 其具有独特的芳香味，且随着碳链的增长而表现出更加强烈的芳香味，对产品的总体风味有着明显的提升与促进作用。在本研究中，2-庚酮与2-壬酮在植物乳杆菌和蛋白 酶共同作用体系中的含量相比空白有了小幅提升，而3-羟基-2-丁酮的含量则发生了较为明显的升高，风干肠的芳香味也因此而更加浓郁。此外，风干肠自然发酵9d后其酯 类化合物的含量相比0d有了显著的提升(P＜0.05)，且体系内出现了如葵酸乙酯、辛 酸乙酯等酯类化合物，但其它实验组与9d时的对照组相比，酯类化合物的含量并未 出现明显的提升。
综上所述，植物乳杆菌SL1和其所产蛋白酶共同作用于风干肠发酵体系中，可对产品的特征风味起到一定的控制及促进作用。植物乳杆菌菌株在抑制某些脂质的过氧 化方面起到积极的作用，蛋白酶则对底物蛋白的分解、特征风味物质的形成和菌体特 异性活力与代谢过程有所控制。因此，二者共同作用于哈尔滨风干肠的发酵体系对风 味的形成有着重要的意义且存在着一定的可行性。
表6经植物乳杆菌SL1和植物乳杆菌蛋白酶处理后哈尔滨风干肠中挥发性化合物的含 量(峰面积AU×106)
2.3微生物菌株和蛋白酶对风干肠pH的影响
我们分别将植物乳杆菌SL1的菌株、其所产蛋白酶以及二者组合接种至各风干肠发酵组，以未添加任何菌株和蛋白酶的自然发酵组作为空白对照，以此探讨微生物菌 株和蛋白酶对风干肠pH的影响。
图3表示风干肠分别接种植物乳杆菌SL1和相应蛋白酶后，发酵过程中的pH变化趋势。由图3可知随着发酵时间的延长，对照组和实验组的pH均出现不同程度的下降。 其中空白对照组pH降低趋势相对较为平缓，仅从0d时的6.18将至9d的5.45左右。 而在添加了植物乳杆菌SL1所产蛋白酶的实验组中，9d时pH可达5.25，表明仅在发 酵体系内加入蛋白酶虽可在一定程度降低体pH但降幅不大；而在接种弯曲杆菌SL1 的实验组中，体系的pH从初始0d时的5.90迅速下降至4.74作用(9d)，这表示接种 植物乳杆菌菌株后有利于体系pH维持在相对较低的水平。而将蛋白酶和菌株共同接种 至发酵风干肠中后，pH在9d时降至4.5以下，菌株与蛋白酶的协同作用可令风干肠迅速发酵成熟，低pH体系不仅可赋予产品良好的品质，同时也可抑制腐败菌的生长， 保证产品的使用安全性。相比传统的发酵方法，接种植物乳杆菌发酵剂可一定程度改 善产品的特性，而植物乳杆菌发酵剂与蛋白酶协同作用，不仅可在一定程度上提高发 酵剂菌株繁殖的可控性，同时也能促进体系内底物蛋白的定向分解，提高利用率。
2.4微生物菌株和蛋白酶对风干肠色差的影响
表7接种植物乳杆菌SL1和蛋白酶的风干肠的色差值
同一列标注不同的字母(a-c)表示差异显著(P<0.05)
哈尔滨风干肠发酵9d后，产品的红度值、亮度值和黄度值如表7所示。在体系中 单加入植物乳杆菌蛋白酶后，产品的红度值、亮度值和黄度值没有发生明显的变化(P ＞0.05)。而在接种了植物乳杆菌SL1后，产品的红度值和亮度值出现了显著提高(P<0.05)，在植物乳杆菌SL1和蛋白酶协同作用的实验组中，相比单接种植物乳杆菌SL1 的产品其红度值和亮度值基本未发生明显的变化(P＞0.05)。红度值对于风干肠的颜色 来讲较为重要，其可在一定程度上提升产品的外观。植物乳杆菌SL1可有效提升产品 的红度值与亮度值，这可能是由于植物乳杆菌SL1可能会在发酵过程中分泌亚硝酸盐 还原酶，它能促进亚硝基血红蛋白的生成；而蛋白酶与发酵剂共同作用时风干肠时， 其红度值与亮度值不会受到影响。
2.5微生物菌株和蛋白酶对风干肠中水分的影响
水分是影响发酵肉制品品质和体系内微生物生长的重要因素之一。我们分别对哈尔滨风干肠发酵过程中水分含量和水分活度的变化进行了探讨。由图4A可知，随着 发酵时间的延长，对照组及各实验组中的水分含量均有不同程度的下降。其中植物乳杆菌SL1和蛋白酶混合接种的实验组的水分含量下降幅度最大，其从0d时的66.53％ 下降至9d时的38.63％；单独接种植物乳杆菌SL1和单独添加蛋白酶的实验组，其水 分含量则从0d时的65.74％分别减少至39.61％和42.52％。水分含量的降低主要与发酵 体系pH的变化有关，随着发酵进程的深入，肉制品中的某些蛋白质会发生酸变性，体 系出现凝胶化，水分析出，最终导致了蛋白质持水能力的下降。仅添加蛋白酶实验组的水分含量相比对照组也有所下降，这可能是由于酶作用于发酵体系中的某些底物蛋 白，对蛋白的结构进行破坏，进而同样引起了蛋白保水能力的降低。水分含量与水分 活度之间存在着一定的联系，二者在发酵体系内的变化趋势极其相似。如图4B所示， 植物乳杆菌SL1和其蛋白酶混合接种实验组的水分活度在发酵9d后最低，单独接种 植物乳杆菌和蛋白酶的实验组次之，经微生物和蛋白酶处理后的实验组，其水分活度 均要低于未接种任何菌株和蛋白酶的对照组。
2.6微生物菌株和蛋白酶对风干肠质构特性的影响
消费者在食用哈尔滨风干肠时的口感，可通过以测定其质构特征的方式加以衡量。 通常，我们采用质构剖面分析法(TPA)来模拟牙齿咀嚼肉制品时的触感并将相应指标以量化形式表达出来。质构分析的指标通常包括硬度、弹性、黏聚性、胶着性和咀嚼度。其可对自然发酵和微生物、蛋白酶作用下的风干肠的口感加以测定，同时亦能对 产品中底物蛋白质的降解与总体结构变化、产品所含水分和质地的情况有所反映。
接种了植物乳杆菌SL1和其蛋白酶的风干肠的质构特征如表8所示。经过自然发酵后，风干肠的硬度显著提高，且与添加蛋白酶的实验组相比差异不显著(P＞0.05)， 而接种植物乳杆菌SL1的产品硬度则明显高于单独添加蛋白酶实验组，而混合接种植 物乳杆菌和蛋白酶的实验组硬度值达到最高。风干肠硬度的增加，一是由于在发酵过 程中水分随空气散发；二则是因为植物乳杆菌在代谢过程中产酸诱导底物蛋白发生变 性，保水性下降；三则是由于植物乳杆菌蛋白酶对于底物蛋白的酶解作用，蛋白结构被破坏，进而导致水分的流失。此外，在植物乳杆菌SL1和蛋白酶的协同作用下，产 品的弹性相比空白对照组也有了显著的提高(P<0.05)。经微生物和蛋白酶的作用后， 风干肠的黏聚性、胶着性和咀嚼度与自然发酵9d时的产品相比虽有所提升，但升幅不 大。综上所述，接种植物乳杆菌SL1和应用蛋白酶，不仅不会对产品的质构特性产生 不良的影响，而且可在一定程度上提升和丰富风干肠的物性学特征。
表8接种植物乳杆菌SL1和蛋白酶发酵后的风干肠质构分析
注：同一行标注不同的字母(a-c)表示差异显著(P<0.05)；control(0d)为发酵前的对照组。
2.7微生物菌株和蛋白酶对风干肠感官特性的影响
感官评定是对发酵风干肠产品品质最为直观的体现。我们分别从产品的气味、滋味、颜色、总体可接受性、口感和酸味六个方面对产品的感官特性进行评定。由图5 的雷达图可知，自然发酵的空白对照样品其各感官评定得分相对较低，而添加了蛋白 酶的风干肠中，其气味、酸味和滋味的感官评定得分有了明显的提升，这与我们之前 的研究结果较为一致，而口感、颜色和总体可接受性的评分提升幅度不大，尤其是颜 色的得分，几乎没有提升。接种了植物乳杆菌SL1的样品，各感官评价指标的得分均 有所提升，其中产品的口感、颜色与总体可接受性的得分相比仅添加蛋白酶的产品， 提升尤为明显。当植物乳杆菌SL1和蛋白酶共同作用时，产品酸味、气味和滋味的得 分进一步提升，雷达图中六项评定指标的得分逐渐趋向平衡。这说明此处理组的产品最受消费者的欢迎，其肠体色泽饱满红润，发酵风味浓郁，酸度得当，口感宜人。因 此，植物乳杆菌SL1和蛋白酶混合发酵，可作为一种改善哈尔滨风干肠品质特性、加 速成熟、完善特征风味形成的肉品发酵剂。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案 做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (8)

1.一种风干肠发酵剂，其特征在于，包括植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)SL1和植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)SL1蛋白酶中的至少一种；
所述植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)SL1保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2022015，保藏日期为2022年1月5日，保藏地址为中国.武汉.武汉大学；
所述植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)SL1蛋白酶的制备方法包括以下步骤：
(1)所述植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)SL1发酵培养得到发酵液，之后离心得到上清液，对所述上清液进行盐析处理，得到粗酶液；
(2)所述粗酶液经阴离子交换层析和凝胶过滤分离纯化，得到所述植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)SL1蛋白酶。
2.一种如权利要求1所述的风干肠发酵剂在风干肠发酵中的应用。
3.一种风干肠的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)猪肉加入辅料混合均匀后，加工成肉馅；
(2)在所述肉馅中加入权利要求1所述的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)SL1和植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)SL1蛋白酶中的至少一种，混合均匀后灌入天然猪肠衣内，风干后发酵，即得所述风干肠。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，在步骤(2)中，当所述肉馅中加入植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)SL1时，所述植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)SL1在所述肉馅中的浓度为107cfu/g。
5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，在步骤(2)中，当所述肉馅中加入植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)SL1蛋白酶时，所述植物乳杆菌(Lactobacillus  plantarum)SL1蛋白酶在所述肉馅中的浓度为3mg/100g。
6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，在步骤(2)中，当所述肉馅中同时加入植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)SL1和植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)SL1蛋白酶时，所述植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)SL1在所述肉馅中的浓度为107cfu/g，所述植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)SL1蛋白酶在所述肉馅中的浓度为3mg/100g。
7.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，在步骤(2)中，所述发酵的发酵时间为9d。
8.一种根据权利要求3-7任一项所述的制备方法制备得到的风干肠。
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