CN113717896A - 发酵乳杆菌yzu-06及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种发酵乳杆菌YZU‑06及其应用。该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC 23394。本发明的发酵乳杆菌YZU‑06具有高BCAT活性，相对于其他菌株，在制备香肠时能够产生更多的风味物质，对加快及提高3‑甲基丁醛生成速率和含量以提高发酵香肠风味具有重要意义。可将腐生葡萄球菌CGMCC 3745和发酵乳杆菌YZU‑06复配用于发酵香肠中，腐生葡萄球菌CGMCC 3745将蛋白降解为氨基酸，发酵乳杆菌YZU‑06的支链氨基酸转氨酶可将由蛋白降解的支链氨基酸再降解产生3‑甲基丁醛，且外源添加亮氨酸可加快3‑甲基丁醛生成速率。

Description

发酵乳杆菌YZU-06及其应用

技术领域

本发明涉及微生物领域，具体地，涉及一种发酵乳杆菌YZU-06及其应用。

背景技术

发酵香肠成熟期间会发生一些生化和物理变化，这些变化决定最终产品的风味。这些变化主要是发酵引起的酸化，pH降低，初始菌群变化，硝酸盐还原为亚硝酸盐和亚硝基肌红蛋白的形成，肌原纤维蛋白和肌浆蛋白的增溶和胶凝，蛋白水解，脂解和氧化现象以及脱水。其中蛋白质水解是发酵香肠成熟过程中影响蛋白质降解的主要机制之一。发酵香肠的蛋白质水解主要归因于内源性酶或源自微生物的外源性酶。外源酶主要是乳酸菌、微球菌、凝固酶阴性葡萄球菌(CNS)和酵母等产生胞外酶。通过添加这些外源发酵剂可以生成大量不同大小的多肽和游离氨基酸，其中的支链氨基酸(BCAAs)更是发酵香肠中特征性风味的前体物质。以BCAAs为前体在菌株支链氨基酸转氨酶(BCAT)作用下生成3-甲基丁醛研究多集中在乳制品及发酵香肠中，增加其特征性风味。Leroy-setin等研究Staphylococcuscarnosus的支链氨基酸转氨酶，表明丙氨酸、蛋氨酸、赖氨酸转氨酶活性，但具有较高活性的亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸转氨酶活性，尤其是亮氨酸转氨酶可引起亮氨酸脱氨生成3-甲基丁醛。3-甲基丁醛与含硫化合物反应，可产生类似培根的风味，且3-甲基丁醛的阈值很低，对发酵肉制品的典型风味有重要影响，被作为产香性状量化的指标。

目前在发酵香肠中研究最广泛的主要是高蛋白酶活性菌株的筛选及围绕BCAT在发酵香肠等风味物质形成的影响，对于筛选高BCAT活性菌株的研究较少。

《Application of Lactobacillus fermentum HL57 and Pediococcusacidilactici SP979 as potential probiotics in the manufacture of traditionalIberian dry-fermented sausages》(S Ruiz-Moyano等)研究了发酵乳杆菌HL57和酸性乳球菌SP979在接种发酵香肠48d分解亮氨酸产生3-甲基丁醛含量比较，发酵乳杆菌HL57在48d产生3-甲基丁醛含量为2.23±1.89％，含量较低。

发明内容

本发明提供一种发酵乳杆菌YZU-06，该发酵乳杆菌具有高BCAT活性，能够快速且大量产生3-甲基丁醛等风味特性物质，从而助于发酵香肠良好风味形成。

为了实现上述目的，本发明一方面提供一种发酵乳杆菌YZU-06，该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101，保藏编号为CGMCC 23394。

本发明另一方面提供了上述的发酵乳杆菌YZU-06在提高肉制品3-甲基丁醛含量中的应用。

具体地，所述肉制品为发酵香肠、火腿。

进一步地，该发酵乳杆菌YZU-06和腐生葡萄球菌CGMCC 3475共同用于发酵香肠。

优选地，所述发酵乳杆菌YZU-06和所述腐生葡萄球菌CGMCC 3475的数量比为(2～3)：1。

发酵香肠中蛋白水解对于释放足够的支链氨基酸以形成完整的风味至关重要，以高蛋白酶的腐生葡萄球菌CGMCC3745与肌肉内源酶共同作用将肌肉蛋白降解为氨基酸。其中亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸的分解途径相类似，以亮氨酸为例，转运蛋白将亮氨酸运输到LAB细胞内，被BCAT转化成α-酮异己酸，在这一转化过程中，亮氨酸的氨基转移到α-酮戊二酸(α-KG)上，从而形成谷氨酸(Glu)。作为中间体的α-酮异己酸由α-酮酸脱羧酶(KADC)的非氧化性脱羧作用直接产生3-甲基丁醛。在腐生葡萄球菌CGMCC3745作用下支链氨基酸含量明显增加，在高转氨酶活性的发酵乳杆菌YZU-06作用下将支链氨基酸经转氨、脱羧途径生成3-甲基丁醛。

进一步地，在发酵乳杆菌YZU-06和腐生葡萄球菌CGMCC 3475共同用于发酵香肠时添加外源支链氨基酸。

优选地，所述外源支链氨基酸为亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸中的一种或多种。

优选地，所述外源支链氨基酸在香肠中的用量为2～3mmol/kg。

本发明利用在发酵香肠外源添加支链氨基酸及高蛋白酶活性腐生葡萄球菌CGMCC3745和高转氨酶活性发酵乳杆菌YZU-06复配联合，可以使发酵香肠具有更好的感官品质及风味特性，具有快速利用亮氨酸产生3-甲基丁醛且提高其含量从而助于发酵香肠良好风味形成。

通过上述技术方案，本发明实现了以下有益效果：

1、本发明的发酵乳杆菌YZU-06具有高BCAT活性，相对于其他菌株，在制备香肠时能够产生更多的风味物质，对加快及提高3-甲基丁醛生成速率和含量以提高发酵香肠风味具有重要意义；

2、在制备香肠过程中，本发明还通过添加高蛋白酶活性的腐生葡萄球菌CGMCC3745将蛋白降解为氨基酸，发酵乳杆菌YZU-06的支链氨基酸转氨酶可将由蛋白降解的支链氨基酸再降解产生3-甲基丁醛，且外源添加亮氨酸可加快3-甲基丁醛生成速率，如在肌原纤维蛋白体系中48h可代谢BCAAs产生3-甲基丁醛含量较植物乳杆菌CGMCC 18217高近一倍。

附图说明

图1a是亮氨酸对L1、L2、L6、L8和L10菌株BCAT活性的影响；

图1b是异亮氨酸对L1、L2、L6、L8和L10菌株BCAT活性的影响；

图1c是缬氨酸对L1、L2、L6、L8和L10菌株BCAT活性的影响；

图2a是菌株L6的PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳图；

图2b是菌株L6在显微镜下观察的菌株形态(1000×)；

图2c是菌株L6的系统发育树；

图3a是空白对照肌原纤维蛋白降解过程中的SDS-PAGE图；

图3b是发酵乳杆菌YZU-06对照肌原纤维蛋白降解过程中的SDS-PAGE图；

图3c是植物乳杆菌CGMCC 18217对照肌原纤维蛋白降解过程中的SDS-PAGE图；

图3d是220kDa处蛋白质条带光密度的相对定量；

图3e是45kDa处蛋白质条带光密度的相对定量；

图3f是肌原纤维蛋白降解过程中总肽含量变化；

图4a是发酵乳杆菌YZU-06和植物乳杆菌CGMCC 18217肌原纤维蛋白降解过程中BCAAs代谢产物3-甲基丁醛的含量变化；

图4b是发酵乳杆菌YZU-06和植物乳杆菌CGMCC 18217肌原纤维蛋白降解过程中BCAAs代谢产物2-甲基丙醇的含量变化；

图4c是发酵乳杆菌YZU-06和植物乳杆菌CGMCC 18217肌原纤维蛋白降解过程中BCAAs代谢产物2-甲基丁醛的含量变化；

图5是香肠发酵28d后总肽含量；

图6是香肠发酵28d后风味组成；

图7是发酵香肠感官雷达图。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。

实施例1菌株筛选

具体筛选过程为：

1)先通过菌株的初筛、复筛、菌株分别BCAAs代谢产物的测定，菌株蛋白酶活性检测、基本发酵试验、菌株产酸能力和生长曲线测定等实验筛选得到5株乳酸菌。对5株乳酸菌进行BCAT活性检测，亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸对L1、L2、L6、L8和L10菌株BCAT活性的影响如图1a、图1b和图1c所示。图中不同小写字母(a-q)表示菌株在不同BCAAs浓度下差异显著(P<0.05)。

结果显示，5株菌中菌株L6对亮氨酸和异亮氨酸的BCAT活性最高(P<0.05)。此外，BCAAs浓度对菌株的BCAT活性也有显著的影响。以菌株L6对亮氨酸的BCAT活性在0～15mmol/L范围内逐渐增加，而当亮氨酸浓度从15mmol/L增加到20mmol/L时，BCAT活性的提高受到限制。结果表明，15mmol/L的亮氨酸是L6菌株BCAT活性的最适浓度。因此，菌株L6分别在15mM亮氨酸、10mM异亮氨酸和5mM缬氨酸时转氨酶活性最高。根据在BCAAs培养体系中对BCAAs利用能力和代谢产物含量测定，筛选得到菌株L6且具有蛋白酶活性。

2)后进行菌株YZU-06的16S rDNA鉴定，过程如下：

最终筛选出的菌株按照细菌基因组DNA纯化试剂盒，从MRS琼脂平板上挑取菌落提取DNA。选择引物进行PCR扩增：7F(5'-CAGAGTTTGATCCAGCCGCT-3')和1540R(AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3')。PCR反应体系(50μL)，引物2μL，模板DNA 2μL，2×Taq PCRMasterMix 25μL，超纯水21μL组成。PCR扩增处理：在94℃下预变性5min，在94℃下变性30s，在52℃下退火30s，在72℃下延伸1min，将这些步骤循环35次，然后在72℃下延伸7min。将PCR产物送至上海生工生物工程技术服务有限公司进行测序，然后与BLAST NCBI从GenBank获得的序列进行比(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)。

对分离得到的菌株L6进行16S rDNA序列的PCR扩增之后，在琼脂糖凝胶电泳，结果如图2a所示，从图中可以看出，1521bp处条带单一且明亮。将测序结果输入NCBI通过BLAST程序与GenBank基因库中的核酸序列进行对比，并且用MEGA程序分析并构建菌株L6的系统发育树，结果如图2c所示，通过对比可知，菌株L6与发酵乳杆菌相似度高达99.93％，这与生理生化鉴定结果一致。通过镜检图2b可知菌株L6为革兰氏阳性杆菌，排列状态为链状排列。综上，确定菌株L6为发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)，命名为发酵乳杆菌YZU-06。

实施例2发酵乳杆菌YZU-06的性能测定

下面通过与植物乳杆菌CGMCC 18217对照，来测定发酵乳杆菌YZU-06的性能。

(1)菌株降解肌原纤维蛋白能力

测试方法：对肌原纤维蛋白进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，以监测蛋白的水解情况。将540μL的肌原纤维蛋白样品与180μL的4×上样缓冲液(1％(w/v)溴酚蓝、200mM Tris-HCl pH 6.8、8％(w/v)SDS、40％(w/v)甘油和1％(v/v)β-巯基乙醇)，然后在95℃加热10min。冷却至室温后，将20μL样品加入由12.5％的分离胶，4％的浓缩胶组成的SDS-PAGE凝胶孔道上。SDS-PAGE在Mini-PROTEAN电泳系统上90V恒压模式下进行30min后，120V恒压模式下进行60min。结束后，将凝胶在含有0.1％(w/v)考马斯亮蓝G-250、45％(v/v)甲醇和10％(v/v)乙酸的溶液中染色40min，然后脱色加入10％(v/v)乙酸、10％(v/v)甲醇，直至观察到清晰蛋白条带。脱色结束后，使用成像仪对凝胶进行扫描，并使用软件Quantity One对蛋白条带的强度进行半定量，结果如图3a、3b和3c所。

空白对照、发酵乳杆菌YZU-06、植物乳杆菌CGMCC 18217在肌原纤维蛋白降解变化如图3a、3b和3c所示。空白对照、发酵乳杆菌YZU-06、植物乳杆菌CGMCC 18217对220kDa的肌球蛋白重链和45kDa的肌动蛋白的蛋白条带光密度进行相对定量如图3d和图3e所示。从图3d和图3e可以看出，空白对照组的肌原纤维蛋白几乎没有明显变化，而接菌处理组的肌原纤维蛋白条带降解显著，表明肌原纤维蛋白由于菌株产生的蛋白酶水解而发生降解。尤其是220kDa的肌球蛋白重链和45kDa的肌动蛋白等特征性蛋白条带显著降解，而发酵乳杆菌YZU-06则更倾向于水解45kDa处蛋白，因为该蛋白条带强度在接菌72h时差异显著(P<0.05)。此外，接菌72h时，发酵乳杆菌YZU-06处理组中低分子量10-28kDa蛋白条带强度要明显强于植物乳杆菌CGMCC 18217。因此，发酵结束时，发酵乳杆菌YZU-06处理组的总肽含量要显著高于植物乳杆菌CGMCC 18217处理组(P<0.05)，而在发酵的0-48h两个接菌处理组之间差异不显著(P>0.05，图3f)结果表明，发酵乳杆菌YZU-06对肌原纤维蛋白的降解能力略高于植物乳杆菌CGMCC 18217。

(2)肌原纤维蛋白游离氨基酸(FAAs)含量分析

测试方法如下：

样品制备：将9mL菌液重悬于0.1M，pH 7.0的PBS中，加入1mL的混合反应液(含有15mmol/Lα-酮戊二酸、0.1mmol/L PLP、0.25mmol/LNAD+)以及菌株各自最佳的BCAAs浓度，37℃孵育24h。孵育结束后，在4℃，8000g条件下，离心10min，收集上清液以测定BCAAs含量。

检测条件：将样品用0.45μm的滤膜过滤，使用Agilent Hypersil ODS的4.0mm×250mm×5.0μm色谱柱注入全自动氨基酸分析仪，恒流为1.0mL/min，检测波长为338nm处使用紫外检测器(VWD)检测氨基酸。肌原纤维蛋白降解72h后游离氨基酸含量如表1所示。

表1肌原纤维蛋白降解72h后的游离氨基酸含量(mg/mL)

注：不同小写字母(a-c)表示不同处理组之间同一氨基酸具有显著性差异(P<0.05)。

从表1可以看出，72h后，接菌处理组总游离氨基酸含量显著高于对照组(P<0.05)。结合SDS-PAGE图3b、图3c中肌原纤维蛋白的降解结果，进一步验证接种植物乳杆菌CGMCC18217和发酵乳杆菌YZU-06显著促进肌原纤维蛋白的水解，产生更多的FAAs。接种发酵乳杆菌YZU-06培养72h后，其亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、谷氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸和赖氨酸含量显著高于未接种对照组(P<0.05)。此外，与植物乳杆菌CGMCC 18217相比，发酵乳杆菌YZU-06可以产生更高浓度的亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸。由于FAAs是风味物质的前体化合物，BCAAs是BCAT发生转氨反应的底物，因此发酵乳杆菌YZU-06具有很强的代谢产生BCAAs能力。

(3)BCAAs特征性代谢产物含量分析

测试方法：将2mL样品加入10μL内标的辛酸甲酯(87.70mg/mL)置于5mL的顶空瓶中。90℃加热2min后，不分流进样，使用30m×0.25mm×0.2μm的DB-WAX极性柱分离挥发性化合物，载气为氮气，恒流3.0mL/min，探测器温度维持190℃。初始温度40℃，维持4min，然后以5℃/min升温，直至130℃，随后以30℃/min至200℃，维持1min。用GC-MS(气相色谱-质谱联用仪)检测，检测到的质谱图用相应软件(Xcalibur)分析物质含量，结果如图4a、图4b和图4c所示。

从图中可以看出，两种菌株接种组均检测到BCAAs特征代谢产物2-甲基丙醛、2-甲基丁醛、3-甲基丁醛，而未接种的对照组未检测到。2-甲基丙醛和2-甲基丁醛的含量分别是缬氨酸和异亮氨酸的代谢产物，并且过程中均逐渐增加。发酵乳杆菌YZU-06处理组的BCAAs代谢产物的含量始终高于植物乳杆菌CGMCC 18217处理组。这可能是由于发酵乳杆菌YZU-06具有更高的蛋白酶活性，其水解肌原纤维蛋白产生更多的BCAAs，然后为菌株转氨反应提供足够的BCAAs。综上所述，筛选出的发酵乳杆菌YZU-06具有蛋白酶和BCAT活性能够有效降解肌原纤维蛋白并产生FAAs，从而形成典型的BCAAs特征性风味物质。说明发酵乳杆菌YZU-06作为发酵肉制品的发酵剂具有广阔应用前景。

实施例3发酵乳杆菌YZU-06在发酵香肠中的应用

发酵香肠的制备过程为：每千克猪肉按肥、瘦为3:7的比例混合，加入糖7％、盐3％、味精0.2％、五香粉0.1％、生姜粉0.15％、大曲20mL/kg等辅料、水10％和菌株接种量为1×10⁷CFU/g，混合均匀后进行灌肠和结扎，最后进行发酵28d。发酵条件为：自然风干。12个处理组香肠选取时间分别是0d、7d、14d、21d、28d，每次每组取样各取50.0g，冷冻保存(-20℃)。

发酵香肠处理组设置：

第一组：不添加亮氨酸及不接种菌株的空白(CK)；

第二组：添加1mmol/kg的亮氨酸但不接菌的处理组(CK-1)；

第三组：添加3mmol/kg的亮氨酸但不接菌的处理组(CK-3)；

第四组：不添加亮氨酸但接种发酵乳杆菌YZU-06的处理组(G)；

第五组：添加1mmol/kg的亮氨酸及接种发酵乳杆菌YZU-06的处理组(G-1)；

第六组：添加3mmol/kg的亮氨酸及接种发酵乳杆菌YZU-06的处理组(G-3)；

第七组：不添加亮氨酸但接种植物乳杆菌CGMCC 18217的处理组(Z)；

第八组：添加1mmol/kg的亮氨酸及植物乳杆菌CGMCC 18217的处理组(Z-1)；

第九组：添加3mmol/kg的亮氨酸及植物乳杆菌CGMCC 18217的处理组(Z-3)；

第十组：不添加亮氨酸但接种发酵乳杆菌YZU-06和腐生葡萄球菌CGMCC 3475的比例为2:1的处理组(GQ)；

第十一组：添加1mmol/kg的亮氨酸及接种发酵乳杆菌YZU-06和腐生葡萄球菌CGMCC 3475的比例为2:1的处理组(GQ-1)；

第十二组：添加3mmol/kg的亮氨酸及接种发酵乳杆菌YZU-06和腐生葡萄球菌CGMCC 3475的比例为2:1的处理组(GQ-3)。

对上述各处理组的香肠进行了以下测定：

(1)发酵香肠总肽含量

总肽含量测定方法：2.5mL的肌原纤维蛋白发酵液加入5mL的12.5％(w/v)三氯乙酸，充分混合后静置10min沉淀蛋白，然后，4℃，10000g离心15min，离心后取上清液，采用Lowry试剂盒进行检测。

蛋白水解参数，发酵结束时香肠的TCA可溶性总肽的含量如图5所示。与对照组相比，接种复配菌株并添加亮氨酸的处理组GQ、GQ-1和GQ-3的总肽含量显著高于对照组(P<0.05)。总肽的增加反映蛋白酶的活性，主要是微生物的作用和肌肉内源酶的作用。复配接菌组的总肽含量较高，说明蛋白降解程度更高，这也与风味化合物的形成和口味改善有关。且在对香肠的滋味进行感官评价时，注意到GQ-1和GQ-3显示出比对照更优的滋味(如图6所示)。风味的形成是由于一些低分子量化合物作用，包括肽、氨基酸、醛、有机酸和氨。此外，像肽和氨基酸这样的化合物可能以一种复杂的协同方式对味道做出贡献，其味道特性超过纯化合物。

(2)发酵香肠游离氨基酸的测定及分析

游离氨基酸的测定方法：将样品用0.45μm的滤膜过滤，使用Agilent HypersilODS的4.0mm×250mm×5.0μm色谱柱注入全自动氨基酸分析仪，恒流为1.0mL/min，检测波长为338nm处使用紫外检测器(VWD)检测氨基酸，结果如表2所示。

表2发酵结束后香肠中游离氨基酸的含量(mg/100g)

注：不同小写字母(a-j)表示同一种氨基酸之间的显著性差异(P<0.05)。

游离氨基酸在发酵香肠制品的风味形成中起着重要作用，因为FAAs是诱导味觉化合物和其他风味化合物的前体物质。因此，在发酵结束后检测香肠的总FAAs浓度和FAAs组成。其中脯氨酸是苦味的主要来源，甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸的存在也会带来苦味。谷氨酸和天冬氨酸则主要赋予鲜味，甜味的呈味氨基酸有甲硫氨酸、丝氨酸，而丙氨酸、甘氨酸和脯氨酸也兼具甜味。

表2是香肠成熟28d后游离氨基酸的具体浓度和总氨基酸含量。由表2可知，外源添加3mmol/kg的亮氨酸处理组在发酵28d后亮氨酸出现累积现象，即CK-3组亮氨酸浓度(25.53mg/100g)显著高于CK-1组和CK组，GQ-3组亮氨酸浓度(72.94mg/100g)显著高于GQ-1组和GQ组(P<0.05)，其中接菌组GQ-3不仅亮氨酸含量显著高于其他处理组，异亮氨酸和缬氨酸的含量也显著高于其他处理组(P<0.05)。因此复配接菌组GQ-3在添加3mmol/kg的外源亮氨酸，可以为产生3-甲基丁醛/醇/酸提供充足的底物。

在发酵香肠中，除支链氨基酸，还含有主要FAAs为谷氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、苏氨酸、精氨酸、丙氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸和脯氨酸。谷氨酸水平的增加可能是由于谷氨酰胺脱氨基，除有助于鲜味，还可以在BCAAs发生转氨作用时提供氨基受体α-酮戊二酸，促进特征性风味的产生。丙氨酸在所有处理组中均占较大比例，有助于产生甜味。在传统发酵的意大利香肠成熟过程中观察到丙氨酸和谷氨酸水平的增加。此外，苯丙氨酸可以通过细菌转化为苯丙酮酸，然后氧化为苯甲醛，这是发酵香肠中常见的另一种风味化合物。

从表中可知，12组香肠的总氨基酸含量由高到低依次是GQ-3>CK＝G>Z>G-3>G-1>Z-1>CK-3>Z-3>CK-1>GQ＝GQ-1。复配接菌组GQ-3的总FAAs含量最高(807.42mg/100g)，GQ(204.73mg/100g)和GQ-1(203.15mg/100g)的含量最低，CK具有较高的FAAs含量(593.68mg/100g)。肌肉蛋白的水解产生多肽，多肽进一步降解成更小的多肽和游离氨基酸，FAAs的减少可能是被细菌代谢。

(3)发酵香肠挥发性风味的测定及分析

测定方法：将2mL样品加入10μL内标的辛酸甲酯(87.70mg/mL)置于5mL的顶空瓶中。90℃加热2min后，不分流进样，使用30m×0.25mm×0.2μm的DB-WAX极性柱分离挥发性化合物，载气为氮气，恒流3.0mL/min，探测器温度维持190℃。初始温度40℃，维持4min，然后以5℃/min升温，直至130℃，随后以30℃/min至200℃，维持1min。用GC-MS(气相色谱-质谱联用仪)检测，检测到的质谱图用相应软件(Xcalibur)分析物质种类及含量，结果如表3、表4和图6所示。

表3发酵28d香肠中挥发性风味物质种类

对发酵28d后的香肠进行挥发性化合物的鉴定和定量如表3和图6所示。在对照和接菌的香肠中共鉴定出62种挥发物质，包括酯类22种、醛类8种、醛类11种、酸类8种、烷烃类4种、烯烃类5种、酮类2种和其他化合物2种。在发酵香肠中发现的大多数挥发物已经被许多其他研究报道。这些挥发性化合物主要来源于脂质氧化，氨基酸分解代谢，碳水化合物发酵，微生物活动产生和香辛料。此外，如表3所示，对照香肠中CK、CK-1和CK-3分别检测到32、47和43种化合物，但是接菌组至少49种化合物，说明接种发酵乳杆菌YZU-06和植物乳杆菌CGMCC 18217，特别是发酵乳杆菌YZU-06和腐生葡萄球菌CGMCC 3475的复配影响挥发性化合物的产生。图5是各处理组发酵28d的风味组成图，含量最高的是酯类占比约59.62％-76.57％，然后是其他类10.30％-18.09％，醇类4.72％-9.36％，烯烃类2.81％-5.17％，醛类1.48％-3.19％，酮类0.16％-1.65％，烷烃类0.29％-1.65％和酸类0.22％-0.82％。

表4香肠发酵28d后的挥发性物质含量(％)

注：“nd”表示未检出，不同小写字母(a-l)表示同一物质不同处理组之间差异显著(P<0.05)。

如表4所示，由支链氨基酸代谢产生及衍生的挥发性风味物质，氨基酸代谢在风味形成中也起着重要作用，微生物发酵促进发酵香肠中肌肉蛋白转化为游离氨基酸。其中的BCAAs可以通过微生物的转氨酶转化为α-酮酸。作为重要的中间体，α-酮酸可以直接或者间接代谢产生相应的醛，例如，2-甲基丙醛来自缬氨酸，3-甲基丁醛和2-甲基丁醛来自亮氨酸和异亮氨酸。这些化合物会产生麦芽味水果味和汗味。而这些醛由醇脱氢酶及醛脱氢酶转化为相应的醇、酸、酯类等。在上表中其他相关挥发性风味物质由于在发酵香肠研究中没有太大差异所以不做过多赘述。与对照相比，接菌的香肠中氨基酸代谢产生的化合物含量较高，特别是复配接菌组。GQ-3组的3-甲基丁醛的含量是17.54μg/kg，GQ-1组的2-甲基丁醛的含量(6.97μg/kg)显著高于其他处理组(P<0.05)，单菌株发酵的2-甲基丙醛的含量是G-3组(7.74μg/kg)显著高于其他处理组(P<0.05)。从各接菌组内比较可知，添加外源亮氨酸增加3-甲基丁醛产生的含量，CK-3组的3-甲基丁醛含量为5.74μg/kg显著高于CK-1组和CK组(P<0.05)。同样的现象也出现在接菌发酵的香肠中，无论是单菌还是复配发酵，随着添加亮氨酸的浓度增加产生的3-甲基丁醛的含量也逐渐增加。

(4)发酵香肠的感官评价

方法：感官评价人员是由12名食品专业的人员组成(6男6女)，具体的评分标准表5所示，评价结果如图7所示。

发酵香肠的品质最终取决于消费者的接受度，对发酵28d的香肠进行感官分析(如图7所示)，包括色泽，形态，香味和滋味。在香肠香味评分结果中，接菌组表现出良好的风味显著高于对照组(P<0.05)。根据滋味评分可以得到，接菌组滋味显著高于对照组(P<0.05)。对照组的感官评分低于接菌组，可能是外源添加亮氨酸并且接菌可以促进水解蛋白质，产生肽、游离氨基酸，这些都是发酵风味和滋味所必需的。此外，通过酸诱导的蛋白质变性可以改善香肠结构。感官结果并结合上述挥发性风味分析结果，发酵剂和亮氨酸的添加对香肠感官品质显著提高尤其是复配菌株GQ-3不仅产生更高含量特征性风味，并且在色泽、香味和滋味的评价优于其他处理组。

由以上描述可以看出，经筛选得到高转氨酶活性的发酵乳杆菌YZU-06在蛋白降解、游离氨基酸含量，BCAAs特征性代谢产物都具有明显的优势；与腐生葡萄球菌CGMCC3475联合应用于发酵香肠，添加亮氨酸的复配组在较短时间内产生游离氨基酸、提高特征性风味物质含量等也得到了验证，同时感官评价方面起到明显的促进作用，所以本研究结果不仅提高发酵香肠的品质，还赋予其独特且更浓郁的风味。

以上结合实施例详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。

SEQUENCE LISTING

<110> 扬州大学

<120> 发酵乳杆菌YZU-06及其应用

<130> 1

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

cagagtttga tccagccgct 20

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

aggaggtgat ccagccgca 19

Claims (8)

1.一种发酵乳杆菌YZU-06，其特征在于，该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC 23394。

2.一种权利要求1所述的发酵乳杆菌YZU-06在提高肉制品3-甲基丁醛含量中的应用。

3.根据权利要求2所述的发酵乳杆菌YZU-06的应用，其特征在于，所述肉制品为发酵香肠、火腿。

4.根据权利要求2所述的发酵乳杆菌YZU-06的应用，其特征在于，该发酵乳杆菌YZU-06和腐生葡萄球菌CGMCC 3475共同用于发酵香肠。

5.根据权利要求4所述的发酵乳杆菌YZU-06的应用，其特征在于，所述发酵乳杆菌YZU-06和所述腐生葡萄球菌CGMCC 3475的数量比为(2～3)：1。

6.根据权利要求4所述的发酵乳杆菌YZU-06的应用，其特征在于，在发酵乳杆菌YZU-06和腐生葡萄球菌CGMCC 3475共同用于发酵香肠时添加外源支链氨基酸。

7.根据权利要求6所述的发酵乳杆菌YZU-06的应用，其特征在于，所述外源支链氨基酸为亮氨酸。

8.根据权利要求6或7所述的发酵乳杆菌YZU-06的应用，其特征在于，所述外源支链氨基酸在香肠中的用量为2～3mmol/kg。

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