CN111944732B - 一株戊糖片球菌及其在改善发酵果蔬风味品质中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)C53，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC No.20192。该菌株从东北酸菜中分离得到，产酸能力强，耐酸耐胆盐。本发明还公开了一种利用戊糖片球菌C53改善发酵果蔬风味品质的方法，包括步骤：将戊糖片球菌C53菌液接种在果蔬发酵体系中进行发酵，发酵体系的液体中戊糖片球菌C53的终浓度为106～108CFU/mL；所述果蔬与所述液体的重量体积比是1:(2～4)g/mL。将戊糖片球菌C53用于酸菜发酵，能显著提高酸菜的总酸和乳酸含量，提高氨基酸和挥发性风味物质含量，还能改善酸菜的滋味。
Description
技术领域
本发明属于食品领域，具体涉及一株戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)及其在改善酸菜风味品质中的应用。
背景技术
酸菜是东北地区普遍特有的一种发酵食品，其清爽可口、风味独特，通常由新鲜的大白菜在一定盐含量下经微生物自然发酵而成。酸菜的发酵主要由蔬菜表面附着的微生物主导，其中包含乳杆菌属、片球菌属、乳球菌属、明串珠菌属等。目前，酸菜的自然发酵能够满足生产的需要，但发酵周期较长、易受杂菌污染以及风味品质不稳定等问题，同时也阻碍了酸菜的标准化和工业化生产。
微生物接种是发酵食品常用的工艺改进方式。酸菜的接种发酵能够缩短发酵周期，改善产品风味品质，提高产品品质稳定性。而菌株是酸菜工艺优化和标准化生产的关键。乳酸菌是果蔬发酵中的主体优势微生物，常作为是食品工业中重要的发酵剂。乳酸菌不仅可以提高产品质量和营养价值，还可以改善食品风味，同时产生乳酸等有机酸，具有抑菌作用，还可以使环境酸化，进而有效抑制腐败菌的生长繁殖，减少异味的产生，从而提高产品的风味品质。此外，多数乳酸菌安全、健康、无毒害作用。但乳酸菌接种发酵酸菜风味往往不及自然发酵浓郁。因此，筛选能够增加酸菜风味的菌种具有重要的意义。
发明内容
为了克服现有技术的缺点，本发明提供一种利用戊糖片球菌改善发酵果蔬风味品质的方法。
为了达到上述目的，本发明提供了一株戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)C53，保藏号为CGMCC No.20192，于2020年07月06日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。所述戊糖片球菌C53是从发酵酸菜中分离筛选得来，具有产酸，耐酸等特性，采用细菌通用引物27F/1492R进行16S rDNA序列鉴定，为戊糖片球菌。
本发明同时提供了所述戊糖片球菌C53在改善发酵果蔬风味品质中的应用。
优选方式下，优选方式下，所述发酵果蔬为以白菜为原料发酵所得的酸菜；所述改善发酵果蔬风味包括，增加发酵果蔬中氨基酸的含量、增加挥发性风味物质的含量、增加有机酸的含量；所述挥发性风味物质为：醇类、醛类、烃类和腈类化合物；所述有机酸为酒石酸、苹果酸、乙酸、柠檬酸、琥珀酸。
一种利用戊糖片球菌C53改善发酵果蔬风味品质的方法，包括步骤：将108～1010CFU/mL戊糖片球菌C53菌液作为发酵剂，接种在果蔬发酵体系中进行发酵，发酵体系的液体中戊糖片球菌C53的菌落数终浓度为106～108CFU/mL；其中，所述果蔬与所述液体的重量体积比是1:(2～4)g/mL；可显著改善发酵果蔬风味。
优选方式下，所述发酵果蔬为酸菜，所述果蔬为白菜。
优选方式下，利用戊糖片球菌C53改善发酵果蔬风味品质的方法，包括步骤：
S1、原料预处理：
取新鲜白菜，自来水煮沸，放凉备用，得待腌制白菜；其中，可以根据容器的大小和实际生产需要将白菜切分成适当的大小；
S2、制作酸菜：
将NaCl溶解在水中，制备成NaCl溶液；将所述NaCl溶液与戊糖片球菌C53菌液混合，制得腌制液，所述腌制液中戊糖片球菌C53的浓度为107CFU/mL；将所述腌制液与步骤S1所述待腌制白菜置于灭菌容器中，14～16℃水封放置发酵28～32天，得酸菜；
其中，所述NaCl溶液中，NaCl和水的重量体积比是1:45～47g/mL；所述待腌制白菜与所述腌制液重量体积比是1:(2～4)g/mL。
优选方式下，所述戊糖片球菌C53菌液的制备方法为：挑取戊糖片球菌C53单菌落，接种至2mL MRS肉汤培养基中，37℃、耗氧、静置培养24h，得菌液A；然后取10μL所述菌液A接种至50mL MRS肉汤培养基中，37℃、耗氧、静置培养12h，得菌液B；将所述菌液B置于10000r/min离心10min后收集菌体，将菌体用质量分数为0.85％氯化钠水溶液稀释，制备成108～1010CFU/mL的菌悬液；其中，所述MRS肉汤培养基成分为：蛋白胨10.0g/L、牛肉浸粉8.0g/L、酵母浸粉4.0g/L、葡萄糖20.0g/L、磷酸氢二钾2.0g/L、柠檬酸氢二铵2.0g/L、乙酸钠5g/L、硫酸镁0.2g/L、硫酸锰0.04g/L、吐温80 1.0g/L，余量为水，5℃的pH值为5.7±0.2。
优选方式下，所述灭菌容器的灭菌方法为：将容器洗净，置于沸水中加热灭菌20min。
优选方式下，所述利用戊糖片球菌C53改善发酵果蔬风味品质的方法，包括步骤：
S1、原料预处理：
新鲜的白菜，挑选出有杂质、虫眼、腐烂的菜叶丢弃，一个白菜按重量平均切成四份备用；
自来水煮沸，放凉备用，得待腌制白菜；
S2、制作酸菜：
将容器清洗干净，沸水灭菌20min，得灭菌容器；将36g食盐溶解于1680mL水，得NaCl溶液；将所述NaCl溶液与109CFU/mL的戊糖片球菌C53菌液混合，制得腌制液，所述腌制液中戊糖片球菌C53菌的终浓度为107CFU/mL；将1680mL所述腌制液、步骤S1所述待腌制白菜600g置于所述灭菌容器中，15℃水封放置发酵30天，得酸菜；
其中，所述戊糖片球菌C53菌液的制备方法为：挑取戊糖片球菌单菌落，接种至2mLMRS肉汤培养基中，37℃、耗氧、静置培养24h，得菌液A；随后取10μL所述菌液A接种至50mLMRS肉汤培养基中，37℃、耗氧、静置培养12h，得菌液B；将所述菌液B置于10000r/min离心10min后收集菌体，将菌体用质量分数为0.85％氯化钠水溶液稀释，制备成109CFU/mL的菌悬液。
本发明的有益效果是：本发明提供的戊糖片球菌，可用改善发酵蔬菜的风味品质，具有非常广泛的应用前景。
利用戊糖片球菌接种发酵能够显著提高酸菜中乳酸的含量，提高氨基酸的含量，尤其是苏氨酸、丝氨酸、谷氨酸、脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸、组氨酸等。另外，戊糖片球菌接种发酵能改善酸菜风味，提高醇类、醛类、烃类和腈类化合物含量。还能改善酸菜滋味，增加酸味和咸味，减少苦味和鲜味。接种戊糖片球菌发酵酸菜能够提高酸菜的品质，改善酸菜的风味与滋味。
附图说明
图1为不同pH条件下戊糖片球菌C53的生长曲线；
图2为不同浓度胆盐条件下戊糖片球菌C53的生长曲线；
图3为本发明对比例1和实施例2酸菜的理化性质；
图4为本发明对比例1和实施例2酸菜的挥发性风味物质含量。
具体实施方式
下面通过具体实施实例对本发明做进一步说明。
本发明的第一个目的在于提供一株戊糖片球菌，从酸菜中分离筛选得来，具有产酸，耐酸等特性，菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，分类命名为戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)，保藏号为CGMCC No.20192。
本发明的第二个目的是提供上述戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)C53在增强发酵果蔬风味品质方面的应用。
上述戊糖片球菌分离自发酵酸菜，采用细菌通用引物27F/1492R进行16S rDNA序列鉴定，为戊糖片球菌。
为达到上述目的，本发明提供了一株菌戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)C53，作为发酵剂，菌株浓度为108～1010CFU/mL。所述戊糖片球菌C53菌液的制备方法为：挑取戊糖片球菌C53单菌落，接种至2mL MRS肉汤培养基中，37℃、耗氧、静置培养24h；然后取10mL菌液接种至50mL MRS肉汤培养基中，37℃、耗氧、静置培养12h；10000r/min离心10min后收集菌体，将菌体用质量分数为氯化钠0.85％水溶液稀释，制备成108～1010CFU/mL的菌悬液。
其中，所述MRS肉汤培养基成分为：蛋白胨10.0g/L、牛肉浸粉8.0g/L、酵母浸粉4.0g/L、葡萄糖20.0g/L、磷酸氢二钾2.0g/L、柠檬酸氢二铵2.0g/L、乙酸钠5g/L、硫酸镁0.2g/L、硫酸锰0.04g/L、吐温80 1.0g/L，5℃的pH值为5.7±0.2。
进一步地，利用戊糖片球菌接种发酵能够显著提高酸菜中乳酸的含量，提高氨基酸的含量，尤其是苏氨酸、丝氨酸、谷氨酸、脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸、组氨酸等。另外，戊糖片球菌接种发酵能改善酸菜风味，提高醇类、醛类、烃类和腈类化合物含量。还能改善酸菜滋味，增加酸味和咸味，减少苦味和鲜味。
本发明提供的戊糖片球菌，可用改善发酵蔬菜的风味品质，具有非常广泛的应用前景。
实施例1：
本发明提供了一株戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)C53，保藏号为CGMCCNo.20192。该菌株分离自酸菜样品。
为了鉴定该菌株，采用细菌基因组DNA快速抽提试剂盒(生工生物工程(上海)股份有限公司)提取基因组DNA，采用细菌通用引物27F：5'-AGA GTTTGA TCC TGG CTCAG-3'和1492R：5'-GGT TAC CTT GTT ACG ACT T-3'进行16S rDNA序列扩增，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。所述引物27F的序列为SEQ ID NO:1，1492R的序列为SEQ ID NO:2。PCR反应体系为：12.5μL2×Taq PCR MasterMix(TIANGEN)、27f和1492r引物各1μL、ddH2O8.5μ、2μL DNA模板。PCR反应程序：94℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃90s，循环30次；72℃10min。扩增产物通过1％琼脂糖凝胶电泳，180V电压30min检验，扩增产物委托生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。将测序结果通过BLAST程序进行在线比对，结果如表1所示。菌株C53被鉴定为戊糖片球菌。
表1筛选菌株C53的16S rDNA比对结果
所述C53菌株的保藏方法：从MRS琼脂培养基平板上挑选生长良好的单菌落接种至2mL MRS肉汤培养基，37℃、耗氧、静置培养24h，取1mL培养液加入到含有1mL体积分数30％甘油的冻存管中，于-80℃冰箱保藏。
所述菌株的培养方法：挑取戊糖片球菌单菌落，接种至2mL MRS肉汤培养基中，37℃、耗氧、静置培养24h，随后取10μL菌液接种至50mL MRS肉汤培养基中，37℃、耗氧、静置培养12h，10000r/min离心10min后收集菌体，将菌体用质量分数为0.85％氯化钠水溶液稀释，制备成108～1010CFU/mL的菌悬液。
所述MRS肉汤培养基成分为：蛋白胨10.0g/L、牛肉浸粉8.0g/L、酵母浸粉4.0g/L、葡萄糖20.0g/L、磷酸氢二钾2.0g/L、柠檬酸氢二铵2.0g/L、乙酸钠5g/L、硫酸镁0.2g/L、硫酸锰0.04g/L、吐温801.0g/L，25℃的pH值为5.7±0.2。
为表征该菌株的耐酸和耐胆盐特性，采用全自动生长曲线分析仪(芬兰，FP-1100-C)测定菌株C53在不同pH和不同浓度胆盐条件下的生长情况，具体步骤如下：挑取戊糖片球菌单菌落，接种至2mL MRS肉汤培养基中，37℃、耗氧、静置培养24h，随后取10μL菌液接种至300μL MRS肉汤培养基中，然后放入全自动生长曲线分析仪进行测定。结果如图1和图2所示。由图可以看出菌株C53在2h后进入对数生长期，10h后进入稳定期。菌株C53能耐受0.09％的胆盐，在pH＝4仍然可以生长，表明在酸菜酸化过程中仍可以进行代谢，进而有助于风味的形成。
实施例2：
一种利用戊糖片球菌C53改善酸菜风味品质的方法，包括步骤：
S1、原料预处理：
新鲜的白菜，挑选出有杂质、虫眼、腐烂的菜叶丢弃，一个白菜按重量平均切成四份备用；
自来水煮沸，放凉备用，得待腌制白菜；
S2、制作酸菜：
将容器清洗干净，沸水灭菌20min，得灭菌容器；将36g食盐溶解于1680mL水，得NaCl溶液；将所述NaCl溶液与109CFU/mL的戊糖片球菌C53菌液混合，制得腌制液，所述腌制液中戊糖片球菌C53菌的终浓度为107CFU/mL；将1680mL所述腌制液、步骤S1所述待腌制白菜600g置于所述灭菌容器中，15℃水封放置发酵30天，得酸菜；
其中，所述戊糖片球菌C53菌液的制备方法为：挑取戊糖片球菌单菌落，接种至2mLMRS肉汤培养基中，37℃、耗氧、静置培养24h，得菌液A；随后取10μL所述菌液A接种至50mLMRS肉汤培养基中，37℃、耗氧、静置培养12h，得菌液B；将所述菌液B置于10000r/min离心10min后收集菌体，将菌体用质量分数为0.85％氯化钠水溶液稀释，制备成109CFU/mL的菌悬液。
对比例1：
自然发酵制备酸菜步骤：
S1、原料预处理：
新鲜的白菜，挑选出有杂质、虫眼、腐烂的菜叶丢弃，一个切成四份备用；
自来水煮沸，放凉备用；
S2、制作酸菜：
将容器清洗后，沸水灭菌20min；取步骤S1所得600g白菜块置于所述容器中，将36g食盐溶解于1680mL水中倒入放置白菜的容器中，15℃水封放置发酵30天，得酸菜；
对本发明实施例及对比例制备的酸菜的理化性质、游离氨基酸、挥发性风味物质、有机酸以及电子舌进行了测定。
1.理化指标
酸味是酸菜重要的风味指标之一，也是判断酸菜发酵正常和成熟的重要指标。利用pH计、酸碱滴定法和离子色谱法测定酸菜样品的pH值、总酸和乳酸含量，结果如图3所示。实施例2所制备酸菜的pH显著低于对比例1，而实施例2制备酸菜的总酸和乳酸含量显著高于对比例1，表明接种C53发酵的酸味更浓郁。另外，实施例2制备酸菜的亚硝酸盐含量明显低于对比例1，表明接种C53发酵酸菜更具有安全性。
2.游离氨基酸含量
利用氨基酸测定仪LA8080测定酸菜样品中氨基酸含量，结果如表2所示。接种发酵后氨基酸总量增加，与自然发酵相比，接种发酵组中甲硫氨酸有略微下降，其余游离氨基酸含量均有较明显的增长，其中苏氨酸增长幅度最为明显，接种发酵酸菜中游离氨基酸含量几乎比对比例增加1倍，其原因可能是接种发酵有助于酶系的产生，水解产生的氨基酸种类及含量较多。另外，根据每种氨基酸呈味不同，划分为3类，与对比例相比，实施例甜味增长最多，苦味与鲜味小幅度变化，总体呈上升趋势，发酵酸菜产生鲜香口味，增加发酵产品营养品质的同时也提高了感官品质。
表2酸菜中游离氨基酸含量(mg/L)
3.挥发性风味物质
挥发性风味物质是酸菜感官评定的重要指标之一，运用气相色谱-质谱联用仪7890A/5977A(Agilent Technologies Inc.,Palo Alto，CA，USA)测定自然发酵和接种发酵酸菜中挥发性风味物质含量，结果如表3所示。实施例2所得酸菜中异硫氰酸类物质显著小于对比例1，表明接种C52发酵能够减少白菜本身的刺激性辛辣风味。还可以促进酸性环境下腈类物质的产生(图4)。实施例2所得酸菜中醇类物质高于对比例1，表明C53接种发酵有助于醇类风味物质的产生；另外，实施例2所制备酸菜中醛类物质含量显著高于对比例1，该类C6-C12的醛类物质阈值较低，香气较好，对风味贡献较大。接种C53发酵还有助于烃类物质的产生，烃类物质包括烷烃和烯烃，烷烃每种香气的含量都相对较少，对酸菜风味的贡献较小。烯烃类香味物质的阈值较小并有一类比较特殊的香味，对酸菜的香气有一定的贡献。
表3酸菜中挥发性风味物质(mg/L)
4、有机酸
采用液相色谱分析分析对比例1和实施例2所制备酸菜的有机酸含量，结果如表4所示。实施例2制备酸菜的有机酸含量均高于对比例1，表明接种C53发酵有助于有机酸的产生，增加酸菜的酸味。
表4酸菜中有机酸含量(g/L)
5、电子舌
采用TS-5000Z型味觉分析系统(Insent，Japan)进行对比例1和实施例2的酸菜进行电子舌检测，结果如表5所示。酸味是酸菜中重要的感官评价指标，与对比例1相比，实施例2所得酸菜的酸味显著提升，同时苦味显著降低。因此，接种C53发酵能够改善酸菜的滋味品质。
表5酸菜电子舌分析
“*”表示具有显著性差异，p＜0.05。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 大连工业大学
<120> 一株戊糖片球菌及其在改善发酵果蔬风味品质中的应用
<130> ZR201257LQ
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 1
agagtttgat cctggctcag 20
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 2
ggttaccttg ttacgactt 19
Claims (7)
1.一株戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）C53，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No. 20192。
2.一种如权利要求1所述戊糖片球菌C53在改善发酵果蔬风味品质中的应用，包括针对发酵果蔬中氨基酸的含量、挥发性风味物质的含量和有机酸的含量的改善；所述发酵果蔬为以白菜为原料发酵所得的酸菜。
3.一种利用权利要求1所述戊糖片球菌C53改善发酵果蔬风味品质的方法，其特征在于，包括步骤：将菌株浓度为108~1010CFU/mL戊糖片球菌C53菌液作为发酵剂，接种在果蔬发酵体系中进行发酵，发酵体系的液体中戊糖片球菌C53的终浓度为106~108CFU/mL；其中，所述果蔬与所述液体的重量体积比是1:（2~4）g/mL；所述果蔬为白菜。
4.根据权利要求3所述利用戊糖片球菌C53改善发酵果蔬风味品质的方法，其特征在于，包括步骤：
S1、原料预处理：取白菜，用水煮沸，放凉备用，得待腌制白菜；
S2、制作酸菜：将NaCl溶解在水中，制备成NaCl溶液；将所述NaCl溶液与戊糖片球菌C53菌液混合，制得腌制液；将所述腌制液与步骤S1所述待腌制白菜置于灭菌容器中，14~16℃水封发酵28~32天，得酸菜；
其中，所述NaCl溶液中，NaCl和水的重量体积比是1:45~47g/mL；所述腌制液中戊糖片球菌C53的浓度为107CFU/mL；所述待腌制白菜与所述腌制液重量体积比是1:（2~4）g/mL。
5.根据权利要求4所述利用戊糖片球菌C53改善发酵果蔬风味品质的方法，其特征在于，所述戊糖片球菌C53菌液的制备方法为：挑取戊糖片球菌C53单菌落，接种至2mL MRS肉汤培养基中，37℃、耗氧、静置培养24h，得菌液A；然后取10μL所述菌液A接种至50mL MRS肉汤培养基中，37℃、耗氧、静置培养12h，得菌液B；将所述菌液B置于10000r/min离心10min后收集菌体，将菌体用质量分数为0.85%氯化钠水溶液稀释，制备成108~1010CFU/mL的菌悬液。
6.根据权利要求4所述利用戊糖片球菌C53改善发酵果蔬风味品质的方法，其特征在于，所述灭菌容器的灭菌方法为：将容器洗净，置于沸水中加热灭菌20min。
7.根据权利要求4所述利用戊糖片球菌C53改善发酵果蔬风味品质的方法，其特征在于，包括步骤：
S1、原料预处理：取白菜，每个白菜按重量平均切成四份，自来水煮沸，放凉备用，得待腌制白菜；
S2、制作酸菜：
将容器清洗干净，沸水灭菌20min，得灭菌容器；将36g食盐溶解于1680mL水，得NaCl溶液；将所述NaCl溶液与109CFU/mL的戊糖片球菌C53菌液混合，制得腌制液，使所述腌制液中戊糖片球菌C53菌的终浓度为107CFU/mL；将1680mL所述腌制液、步骤S1所述待腌制白菜600g置于所述灭菌容器中，15℃水封放置发酵30天，得酸菜；
其中，所述戊糖片球菌C53菌液的制备方法为：挑取戊糖片球菌单菌落，接种至2mL MRS肉汤培养基中，37℃、耗氧、静置培养24h，得菌液A；随后取10μL所述菌液A接种至50mL MRS肉汤培养基中，37℃、耗氧、静置培养12h，得菌液B；将所述菌液B置于10000r/min离心10min后收集菌体，将菌体用质量分数为0.85%氯化钠水溶液稀释，制备成109CFU/mL的菌悬液。
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