CN106701833B - 一种抑菌的类芽孢杆菌发酵液提取物 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种抑菌的类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.)发酵液提取物。该抑菌的类芽孢杆菌发酵液提取物是由包括下述步骤的方法所制得的：在牛乳中培养多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)CGMCC No.10062，收集发酵液的上清液即得。本发明所提供的多粘类芽孢杆菌所产生的抑菌的类芽孢杆菌发酵液提取物对酸碱和温度不敏感，并具有广谱和高效的抑菌效果，可有效抑制或杀死病原菌。

Description

一种抑菌的类芽孢杆菌发酵液提取物

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种抑菌的类芽孢杆菌(Paenibacillussp.)发酵液提取物。

背景技术

食品在加工、保藏、运输等过程中极易受到外界微生物的污染而发生变质腐败，传统保藏食物的方法通常是腌制、烟熏、地窖存放、酒渍等。随着科学技术的不断发展，化学合成防腐剂成为食品工业中最重要的添加剂之一。然而研究发现这些化学合成防腐剂不仅影响食品原有的风味而且还存在着对人体潜在的诱癌性、致畸性或者造成食物中毒等安全隐患，因此，寻找和开发可有效抑制或杀死食品中病原菌的天然、安全的抗菌剂无疑可促进食品和医药行业的进步。

类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.)广泛存在于土壤、植物茎叶、果实、根系和天然发酵食品中，部分类芽孢杆菌能产生高效丰富的抗菌物质，对多种病原菌具较强抑制作用，在生物防治和食品防腐方面有着重要的前景。同时，类芽孢杆菌具有生长繁殖快、易于存活、抗逆性强、营养要求简单等优点，有利于大规模制备其菌体或特定的代谢产物。因此，寻找和开发可有效抑制或杀死食品中病原菌的天然、安全的抗菌剂可促进食品和医药行业的进步。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是为了克服现有技术中医药和食品领域的化学合成防腐剂会影响食品原有的风味且还存在对人体潜在的诱癌性、致畸性或者造成食物中毒等安全隐患、缺少天然、安全的抑菌剂这一技术问题，提供了一种由多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)产生的抑菌的发酵液提取物。所述抑菌的类芽孢杆菌发酵液提取物对酸碱和温度不敏感，并具有广谱和高效的抑菌效果，可有效抑制或杀死病原菌。

本发明技术方案之一：一种抑菌的类芽孢杆菌发酵液提取物，其由包括下述步骤的方法制得：在牛乳中发酵多粘类芽孢杆菌CGMCC No.10062，收集发酵液的上清液即得。

本发明中，所述多粘类芽孢杆菌已于2014年11月26日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101，保藏编号为：CGMCC No.10062，培养物名称是BD3736，分类命名是Paenibacilluspolymyxa。

本发明中，所述牛乳可以为本领域常规的牛乳，较佳地为全脂牛乳和/或脱脂牛乳，更佳地为脱脂牛乳。所述牛乳可以是生鲜乳或者复原乳。所述牛乳的固形物含量可以为本领域常规的含量，较佳地为2-15％，更佳地为10-15％，最佳地为10％，所述百分比为所述固形物的质量占所述牛乳体积的质量体积百分比。

本发明中，所述发酵的温度可以为本领域常规的温度，较佳地为25-35℃，更佳地为30℃。所述发酵的时间可以为本领域常规的时长，较佳地为1-7天，更佳地为4-6天，最佳地为5天；所述发酵较佳地为振荡培养，所述振荡培养的转速可以为本领域常规的转速，较佳地为180r/min。

本发明中，所述收集发酵液的上清液可以为本领域常规的操作，较佳地包括以下步骤：将所述发酵液中的多粘类芽孢杆菌CGMCC No.10062灭活，离心，收集上清液。所述灭活可以为本领域常规的操作，如高温水浴，过滤除菌，超高压杀菌等，较佳地为在50-80℃下水浴5-15min、冷却，更佳地为在60℃下水浴10min，冷却至室温。所述离心可以为本领域常规的操作，所述离心的转速较佳地为9000r/min，所述离心的时间较佳地为25min。

本发明中，所述方法较佳地还可以包括以下步骤：向所述发酵液的上清液中加入盐进行沉淀、离心，收集沉淀物。所述盐可以为本领域常规的盐，较佳地为硫酸铵。所述沉淀的时间可以为本领域常规的时长，较佳地为4-24h。所述盐的终饱和度可以为本领域常规的饱和度，较佳地为40-90％，更佳地为80％，所述百分比为所述盐的质量占所述发酵液和盐的总体积的质量体积百分比。所述离心的转速可以为本领域常规的转速，较佳地为9000r/min；所述离心的时间可以为本领域常规的时长，较佳地为25min。

本发明中，所述方法较佳地还可以包括以下步骤：纯化所述沉淀物，所述纯化所述沉淀物在所述收集沉淀物后进行。所述纯化较佳地包括以下步骤：重悬所述沉淀物、透析、凝胶过滤层析，即得。所述重悬所用的溶液可以为本领域常规的溶液，较佳地为超纯水。所述透析可以为本领域常规的透析，所述透析袋的截留分子量较佳地可以为3500Da和1000Da；所述透析的温度较佳地为4℃；所述透析的时间较佳地为4-24h。所述凝胶过滤层析的层析柱可以为本领域常规的层析柱，较佳地为筛选分子量范围为100Da-1500Da的层析柱，更佳地为Sephadex G-15。

本发明中，所述抑菌的类芽孢杆菌发酵液提取物较佳地包括分子量在25kDa-37kDa之间的蛋白质和小于10kDa的蛋白质，更佳地为分子量小于10kDa的蛋白质。

本发明中，所述抑菌的类芽孢杆菌发酵液提取物较佳地可以抑制革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌。所述革兰氏阴性菌较佳地包括大肠杆菌(Escherichia coli)、福氏志贺氏菌(Shigellaflexneri)及肠炎沙门氏菌(Salmonella enteritidis)；所述革兰氏阳性菌较佳地包括单增李斯特菌(Listeria monocytogenes)、藤黄小球菌(Micrococcus luteus)及枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。

本发明中，所述抑菌的类芽孢杆菌发酵液提取物的抑菌活性不受温度的影响。具体地，分别在60℃、80℃和100℃中水浴30min，或在121℃下处理15min后所述抑菌的类芽孢杆菌发酵液提取物的抑菌活性不受影响。

本发明中，所述抑菌的类芽孢杆菌发酵液提取物的抑菌活性不受pH值的影响。具体地，在pH分别为3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0和9.0时室温放置2h后，所述抑菌的类芽孢杆菌发酵液提取物的抑菌活性不受影响。

本发明中，所述抑菌的类芽孢杆菌发酵液提取物的抑菌活性受胃蛋白酶或蛋白酶K影响，不受脂肪酶或胰蛋白酶影响。

在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。

本发明所用试剂和原料均市售可得。

本发明的积极进步效果在于：本发明提供的由多粘类芽孢杆菌(Paenibacilluspolymyxa)所产生的抑菌的类芽孢杆菌发酵液提取物对酸碱和温度不敏感，并具有广谱和高效的抑菌效果，可有效抑制或杀死食品中的病原菌。

生物材料保藏信息

本发明中，所述多粘类芽孢杆菌已于2014年11月26日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101，保藏编号为：CGMCC No.10062，培养物名称是BD3736，分类命名是Paenibacilluspolymyxa。

附图说明

图1为本发明所述抑菌的类芽孢杆菌发酵液提取物对不同种类细菌的抑菌效果。

图2为本发明所述抑菌的类芽孢杆菌发酵液提取物经Sephadex G-15柱层析后不同收集管在280nm处的紫外吸收结果。

图3为本发明所述抑菌的类芽孢杆菌发酵液提取物经Sephadex G-15柱层析后不同收集管洗脱液对沙门氏菌的抑菌活性。

图4为本发明所述抑菌的类芽孢杆菌发酵液提取物经Sephadex G-15柱层析后不同收集管洗脱液蛋白含量。

图5为本发明所述抑菌的类芽孢杆菌发酵液提取物经Sephadex G-15柱层析后不同收集管洗脱液经硫酸铵沉淀后，SDS-PAGE电泳结果。其中，M：蛋白Marker；23-26代表Sephedx G-15柱层析的收集管号。

图6为本发明所述抑菌的类芽孢杆菌发酵液提取物经SDS-PAGE电泳后各条带对肠炎沙门氏菌的抑菌效果。

图7为本发明所述抑菌的类芽孢杆菌发酵液提取物对不同温度处理的稳定性。

图8为本发明所述抑菌的类芽孢杆菌发酵液提取物对不同酶处理的稳定性。

图9为本发明制备方法所制得的抑菌的类芽孢杆菌发酵液提取物对经不同饱和度硫酸铵沉降后对肠炎沙门氏菌的抑菌效果。

具体实施方式

下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。

本发明所述的过夜为本领域常规术语，即4-24小时，所述的室温为本领域常规术语，即25℃。

本发明所用到的培养基成分如下：

LB培养基：胰胨(或酪朊水解物)1g；酵母膏0.5g；NaCl 0.5g，水100mL，115℃，杀菌15min。

LB固体培养基：上述LB培养基另加入1.8g琼脂。

BHI培养基：胰胨(或酪朊水解物)1g；酵母膏0.5g；NaCl 0.5g，水100mL，115℃，杀菌15min。

BHI固体培养基：上述BHI培养基另加入1.8g琼脂。

本发明中所用到的试剂和仪器如下：

蛋白质定量试剂盒：BCA蛋白质定量检测试剂盒购自生工生物工程(上海)股份有限公司。

Sephadex G-15：购自GE Healthcare。

本发明中所用到的菌种：

大肠杆菌(Escherichia coli)、福氏志贺氏菌(Shigella flexneri)、肠炎沙门氏菌(Salmonella enteritidis)、单增李斯特菌(Listeria monocytogenes)、藤黄小球菌(Micrococcus luteus)及枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)均购自中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)。

以下实施例中，所述各种牛乳的固形物含量百分比为所述牛乳中的固形物质量占所述牛乳体积的质量体积百分比。

实施例1多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)BD3736来源的抗菌物质的提取

1、BD3736菌株的培养

取20％甘油保存的BD3736菌株，接种到LB固体培养基上，在大气条件下30℃恒温箱中48h。然后，刮取一环单菌落于15mL固形物含量为10％灭菌脱脂牛乳中，30℃、180r/min恒温振荡培养24h，制得BD3736菌株种子发酵液。

在500mL三角瓶中装入130mL固形物含量为10％灭菌脱脂牛乳，将上述BD3736菌株种子发酵液按照4％(v/v)的接种量接种，30℃、180r/min恒温振荡5天，得BD3736菌株发酵液。

2、BD3736菌株发酵液提取物的制备

将如上所述BD3736菌株发酵液在60℃下水浴10min，冷却至室温，9000r/min，离心25min，收集上清液。在磁力搅拌的作用下，缓慢加入硫酸铵粉末，使盐离子终饱和度达到80％，所述百分比为所述盐的质量占所述上清液和盐的总体积的质量体积百分比，过夜沉淀。然后9000r/min离心25min，收集沉淀物。将上述沉淀物重悬入去离子水中，即得BD3736菌株发酵液提取物粗品。

实施例2 BD3736菌株发酵液提取物的抑菌谱

1、指示菌平板的制备

将20％甘油保存的病原菌，分别转接到BHI固体培养基，30℃培养48h。然后刮取一环单菌落转接到液体BHI中，30℃、180r/min培养24h。12000rpm离心5min收集菌体，用无菌水稀释，制成菌悬液。利用血球计数板计数，控制终始菌浓为10⁶cfu/mL。

待BHI固体培养基冷却至55℃，与制备好的所述指示菌菌悬液混匀倒平板，每个培养皿内倒入20mL左右培养基。凝固并充分晾干后即得指示菌平板。

2、BD3736菌株发酵液提取物的抑菌谱

以大肠杆菌(Escherichia coli)、肠炎沙门氏菌(Salmonella enteritidis)、福氏志贺氏菌(Shigella flexneri)为革兰氏阴性菌代表，以枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、单增李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、藤黄小球菌(Micrococcus luteus)为革兰氏阳性菌代表。在指示菌平板上放置牛津杯，然后加100μL实施例1所获得的BD3736菌株发酵液提取物粗品，检测对其是否有抑制作用。

实验结果见图1，结果显示，BD3736菌株发酵液提取物粗品对大肠杆菌、福氏志贺氏菌、肠炎沙门氏菌、单增李斯特菌、藤黄小球菌及枯草芽孢杆菌均有比较明显的抑制作用，而对金黄色葡萄球菌没有抑制作用。因此BD3736菌株发酵液提取物粗品具有广谱、高效抑菌效果。

实施例3 BD3736菌株发酵液提取物的纯化

(1)将实施例1所述BD3736菌株发酵液提取物粗品利用截留值分别为3500Da和1000Da的透析袋，4℃过夜透析，收集袋内的样品。将透析液冷冻干燥，得冻干粉。

(2)将步骤(1)得到的冻干粉用超纯水溶解到质量浓度200mg/mL，上样量10mL，过Sephadex G-15(柱体积约800mL)凝胶柱层析分离。洗脱液为pH 7.0的超纯水，流速为3mL/min。每4min收集一管，每管约12mL。用蛋白紫外检测仪在280nm处检测。实验结果见图2。

将上述收集到的样品蒸干水相。测定对沙门氏菌的抑菌圈直径，实验结果见图3。结果显示，14-16、23-30两段收集管(分别用A、B表示)表现出明显的抑菌活性，且两段收集管的洗脱时间比较接近，A为64min，B为96min，说明它们的分子量比较接近。

(3)利用蛋白定量试剂盒，将步骤(2)得到的不同收集管，分别检测蛋白含量。结果见图4。

实施例4 BD3736菌株发酵液提取物的相对分子质量的分析

(1)SDS-PAGE电泳。

取实施例3中编号为23-26号的收集管中收集的样品点样跑SDS-PAGE胶，实验结果见图5。结果显示，样品经电泳后出现两条明显的色带，分子量分别37kD～25kD和10kDa以下。

(2)将步骤(1)得到的两个条带，用无菌蒸馏水反复浸洗后，测试不同分离条带的抑菌作用。实验结果见图6，结果显示，低于10kD区域出现的条带具有抑菌活性。

实施例5 BD3736菌株发酵液提取物的对温度的稳定性

将实施例1所制得的BD3736菌株发酵液提取物粗品分别在60℃、80℃和100℃中水浴30min和121℃温度下处理15min，未经热处理的样品CK作为对照。利用如实施例2所述制得的指示菌(肠炎沙门氏菌)平板，在牛津杯分别加100μL上述样品测其抑菌圈直径。实验结果见图7，结果显示，BD3736菌株所产抑菌的类芽孢杆菌发酵液提取物粗品在60℃、80℃、100℃温度下处理30min后，抑菌活性均没有发生明显变化；甚至经121℃处理15min后，活性也没有丧失。可见BD3736菌株的抑菌的类芽孢杆菌发酵液提取物具有较好的热稳定性。

实施例6 BD3736菌株发酵液提取物对酸碱度的稳定性

用不同pH范围的缓冲液将如实施例1所制得的BD3736菌株发酵液提取物粗品pH分别调至3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0和9.0，室温放置2h，以对应pH值的缓冲液为对照，利用如实施例2所述制得的指示菌(肠炎沙门氏菌)平板，在牛津杯分别加100μL上述样品测其抑菌圈直径。

结果显示，本发明所述BD3736菌株发酵液提取物能耐受较宽范围的酸碱度，且在碱性条件下抑菌活性大于酸性。

实施例7 BD3736菌株发酵液提取物的酶的稳定性

分别配制5mg/mL的胃蛋白酶、胰蛋白酶、蛋白酶K、脂肪酶(pH分别为1.5、7.5、7.5和6.5)，各取100μL于离心管中，加入实施例1所制得的BD3736菌株发酵液提取物粗品400μL，使酶的终浓度为1mg/mL。在各蛋白酶的最适温度下(胃蛋白酶、胰蛋白酶、蛋白酶K和脂肪酶分别为40℃、37℃、55℃和26℃)恒温水浴酶解4h，置100℃沸水水浴5min使酶失活。再将pH值调回6.0，用20mmol/mL PBS缓冲液将体积补至同一体积，以100μL超纯水加400μL细菌素为对照。利用如实施例2所述制得的指示菌(肠炎沙门氏菌)平板，在牛津杯分别加100μL上述样品测其抑菌圈直径。实验结果见图8，结果显示，本发明所述BD3736菌株发酵液提取物对胃蛋白酶、蛋白酶K部分敏感，对脂肪酶、胰蛋白酶不敏感。依据此推测该BD3736菌株发酵液提取物为蛋白类物质。

实施例8多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)BD3736来源的抗菌物质的提取

1、BD3736菌株的培养

取20％甘油保存的BD3736菌株，接种到LB固体培养基上，在大气条件下30℃恒温箱中48h。然后，刮取一环单菌落于15mL固形物含量为10％灭菌脱脂牛乳中，30℃、180r/min恒温振荡培养24h，制得BD3736菌株种子发酵液。

在500mL三角瓶中装入130mL灭菌生鲜牛乳，将上述BD3736菌株种子发酵液按照4％(v/v)的接种量接种25℃、180r/min恒温振荡5天，得BD3736菌株发酵液。所述灭菌生鲜牛乳的固形物含量为11％。

2、BD3736菌株发酵液提取物的制备

将如上所述BD3736菌株发酵液在50℃下水浴15min，冷却至室温，9000r/min，离心25min，收集上清液。在磁力搅拌的作用下，缓慢加入硫酸铵粉末，使盐离子终饱和度达到80％，所述百分比为所述盐的质量占所述上清液和盐的总体积的质量体积百分比。过夜沉淀。然后9000r/min离心25min，收集沉淀物。将上述沉淀物重悬入去离子水中，即得BD3736菌株发酵液提取物粗品。

测定如上所述抑菌的类芽孢杆菌发酵液提取物对指示菌平板(沙门氏菌)的抑菌圈直径。结果显示，抑菌圈直径为14.5mm。

实施例9多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)BD3736来源的抗菌物质的提取

1、BD3736菌株的培养

取20％甘油保存的BD3736菌株，接种到LB固体培养基上，在大气条件下30℃恒温箱中48h。然后，刮取一环单菌落于15mL固形物含量为10％灭菌脱脂牛乳，30℃、180r/min恒温振荡培养24h，制得BD3736菌株种子发酵液。

在500mL三角瓶中装入130mL灭菌脱脂牛乳，将上述BD3736菌株种子发酵液按照4％(v/v)的接种量接种25℃、180r/min恒温振荡5天，得BD3736菌株发酵液。所述灭菌脱脂牛乳的固形物含量为2％。

2、BD3736菌株发酵液提取物的制备

将如上所述BD3736菌株发酵液在50℃下水浴15min，冷却至室温，9000r/min，离心25min，收集上清液。在磁力搅拌的作用下，缓慢加入硫酸铵粉末，使盐离子终饱和度达到80％，所述百分比为所述盐的质量占所述上清液和盐的总体积的质量体积百分比。过夜沉淀。然后9000r/min离心25min，收集沉淀物。将上述沉淀物重悬入去离子水中，即得BD3736菌株发酵液提取物粗品。

测定如上所述抑菌的类芽孢杆菌发酵液提取物对指示菌平板(沙门氏菌)的抑菌圈直径。结果显示，抑菌圈直径为13mm。

实施例10多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)BD3736来源的抗菌物质的提取

1、BD3736菌株的培养

取20％甘油保存的BD3736菌株，接种到LB固体培养基上，在大气条件下30℃恒温箱中48h。然后，刮取一环单菌落于15mL固形物含量为10％灭菌脱脂牛乳中，30℃、180r/min恒温振荡培养24h，制得BD3736菌株种子发酵液。

在500mL三角瓶中装入130mL灭菌脱脂牛乳，将上述BD3736菌株种子发酵液按照4％(v/v)的接种量接种35℃、180r/min恒温振荡5天，得BD3736菌株发酵液。所述灭菌脱脂牛乳的固形物含量为15％。

2、BD3736菌株发酵液提取物的制备

将如上所述BD3736菌株发酵液在80℃下水浴5min，冷却至室温，9000r/min，离心25min，收集上清液。在磁力搅拌的作用下，缓慢加入硫酸铵粉末，使盐离子终饱和度达到80％，所述百分比为所述盐的质量占所述上清液和盐的总体积的质量体积百分比。过夜沉淀。然后9000r/min离心25min，收集沉淀物。将上述沉淀物重悬入去离子水中，即得BD3736菌株发酵液提取物粗品。

测定如上所述抑菌的类芽孢杆菌发酵液提取物对指示菌平板(沙门氏菌)的抑菌圈直径。结果显示，抑菌圈直径为14mm。

实施例11BD3736菌株发酵液提取物发酵时间的优化

将如实施例1所述500ml三角瓶中装入的130ml固形物含量为10％灭菌脱脂牛乳的发酵液连续发酵，每隔1天取样一次。

在实施例2所述的指示菌平板上等间隔放置无菌牛津杯，取100μL上述发酵液加入牛津杯中，每个样品2个重复，将加好样的培养皿，30℃恒温培养36h后，测量抑菌圈的直径(mm)。结果如表1所示。

表1 BD3736菌株不同时间的发酵上清液对沙门氏菌、大肠杆菌、福氏志贺氏菌的抑菌效果

注：抑菌圈试验结果判定标准：抑菌圈直径(mm)＞20：极敏感；抑菌圈直径(mm)在15～20：高敏感；抑菌圈直径(mm)在10～14：中敏感；抑菌圈直径(mm)＜10：低敏感；抑菌圈直径(mm)为0：不敏感。

从表1可知，BD3736菌株第5天的发酵上清液抑菌活性明显最强，抑菌圈平均直径约为13.08mm，且该抑菌的类芽孢杆菌发酵液提取物对肠炎沙门氏菌抑菌作用最强。

实施例12BD3736菌株发酵液提取物硫酸铵沉淀的优化

将如实施例1所述装入500ml三角瓶的130ml固形物含量为10％灭菌脱脂牛乳30℃、180r/min培养5天。

将上述发酵液60℃水浴10min。冷却至室温后，9000r/min，离心25min，收集上清液。

将上述上清液在磁力搅拌器的作用下，缓慢加入硫酸铵粉末，使盐离子终饱和度达到40％，过夜，然后9000r/min离心25min，收集沉淀物；上述沉淀后上清再在磁力搅拌器的作用下，缓慢加入硫酸铵粉末，使盐离子终饱和度达到60％，过夜，然后9000r/min离心25min，收集沉淀物；上述沉淀后上清再在磁力搅拌器的作用下，缓慢加入硫酸铵粉末，使盐离子终饱和度达到80％，过夜，然后9000r/min离心25min，收集沉淀物；上述沉淀后上清再在磁力搅拌器的作用下，缓慢加入硫酸铵粉末，使盐离子终饱和度达到90％，过夜，然后9000r/min离心25min，收集沉淀物。上述逐级得到的沉淀物，利用去离子水重悬，并使重悬后的浓度相同。

将如实施例2所述指示菌平板(肠炎沙门氏菌)等间隔放置无菌牛津杯，取100μL上述重悬液加入牛津杯中。每个样品2个重复。将加好样的培养皿30℃恒温培养24h，测量抑菌圈的直径并拍照。

实验结果见图9，结果显示，BD3736菌株发酵液的上清液经饱和度80％的硫酸铵沉降后的抑菌效果最佳。

应理解，在阅读了本发明的上述内容之后，本领域技术人员可以对本发明的相关条件作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (17)

1.一种抑菌的类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.)发酵液提取物，其特征在于，其由包括下述步骤的方法制得：在牛乳中发酵多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)CGMCCNo.10062，收集发酵液的上清液即得。

2.如权利要求1所述抑菌的类芽孢杆菌发酵液提取物，其特征在于，所述牛乳为全脂牛乳和/或脱脂牛乳。

3.如权利要求1所述抑菌的类芽孢杆菌发酵液提取物，其特征在于，所述牛乳的固形物含量为2-15％，所述百分比为所述固形物的质量占所述牛乳的体积的质量体积百分比。

4.如权利要求1所述抑菌的类芽孢杆菌发酵液提取物，其特征在于，所述发酵的温度为25-35℃；和/或，所述发酵的时间为1-7天；和/或，所述发酵为振荡培养。

5.如权利要求4所述抑菌的类芽孢杆菌发酵液提取物，其特征在于，所述振荡培养的转速为180转/分钟。

6.如权利要求1所述抑菌的类芽孢杆菌发酵液提取物，其特征在于，所述收集发酵液的上清液包括以下步骤：将所述发酵液中的多粘类芽孢杆菌CGMCC No.10062灭活、离心，收集上清液。

7.如权利要求6所述抑菌的类芽孢杆菌发酵液提取物，其特征在于，所述灭活为在50-80℃下水浴5-15min、冷却。

8.如权利要求7所述类芽孢杆菌发酵液提取物，其特征在于，所述冷却为冷却至室温。

9.如权利要求6-8任一项所述类芽孢杆菌发酵液提取物，其特征在于，所述离心为9000r/min离心25min。

10.如权利要求1所述抑菌的类芽孢杆菌发酵液提取物，其特征在于，所述方法还包括以下步骤：向所述发酵液的上清液中加入盐进行沉淀、离心，收集沉淀物。

11.如权利要求10所述类芽孢杆菌发酵液提取物，其特征在于，所述盐为硫酸铵。

12.如权利要求10所述类芽孢杆菌发酵液提取物，其特征在于，所述沉淀的时间为4-24小时。

13.如权利要求10-12任一项所述类芽孢杆菌发酵液提取物，其特征在于，所述盐的终饱和度为40-90％，所述百分比为所述盐的质量占所述上清液和盐的总体积的质量体积百分比。

14.如权利要求10所述抑菌的类芽孢杆菌发酵液提取物，其特征在于，所述方法还包括以下步骤：纯化所述沉淀物，所述纯化在所述收集沉淀物后进行。

15.如权利要求14所述类芽孢杆菌发酵液提取物，其特征在于，所述纯化包括以下步骤：重悬所述沉淀物、透析、过凝胶过滤层析，即得。

16.如权利要求15所述抑菌的类芽孢杆菌发酵液提取物，其特征在于，所述重悬为使用超纯水重悬；和/或，所述透析的透析袋的截留分子量为3500道尔顿和1000道尔顿；和/或，所述凝胶过滤层析柱的筛选分子量范围为100道尔顿-1500道尔顿。

17.如权利要求1所述抑菌的类芽孢杆菌发酵液提取物，其特征在于，所述抑菌的类芽孢杆菌发酵液提取物包括分子量在25千道尔顿-37千道尔顿之间的和小于10千道尔顿的蛋白质；和/或，所述抑菌的类芽孢杆菌发酵液提取物抑制革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌；和/或，所述抑菌的类芽孢杆菌发酵液提取物的抑菌活性不受温度的影响；和/或，不受pH值的影响；和/或，受胃蛋白酶或蛋白酶K影响，不受脂肪酶或胰蛋白酶影响。

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