CN108048489B - 一种利用多粘类芽孢杆菌制备dpp-iv抑制剂的方法及制备出的dpp-iv抑制剂 - Google Patents

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Abstract

本发明公开的一种利用多粘类芽孢杆菌制备DPP‑IV抑制剂的方法，该方法包括如下步骤：(1)将多粘类芽孢杆菌接种于脱脂乳中进行发酵；(2)将步骤(1)得到的发酵产物水浴加热后，离心收集上清液，将收集到的上清液冷冻干燥后得到DPP‑IV抑制剂。本发明技术方案的优点在于，极大简化了生产步骤，仅需发酵、加热灭活、离心和冷冻干燥四步，大大减少了传统复杂工艺可能带来的污染问题。制备所采用的发酵培养基来源广泛、成本低廉、天然安全，避免使用化学合成培养基；加上发酵菌种采用多粘类芽孢杆菌这单一菌种，上述的原料、菌种的组合，有利于产品品质的标准化与工业大规模生产的成本控制。

Description

一种利用多粘类芽孢杆菌制备DPP-IV抑制剂的方法及制备出 的DPP-IV抑制剂
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体为一种利用多粘类芽孢杆菌制备DPP-IV抑制剂的方法及制备出的DPP-IV抑制剂。
背景技术
近年来，糖尿病(Diabetes Mellitus，DM)在全世界广泛流行，目前已成为继肿瘤、心血管疾病之后第三大类严重危害人类健康的慢性疾病。随着我国经济、社会的迅速发展，膳食结构和生活方式的改变，人口老龄化速度的加快，糖尿病的患病率也呈现快速增加的趋势。据统计，2015年全球糖尿病患者约有4.15亿人，而我国糖尿病患者约1.1亿人，已位居世界首位，而且5年间的增长率近20％。在糖尿病患病率快速上升的同时，我国糖尿病的知晓率、治疗率及控制率明显偏低。糖尿病已成为一个严重危害我国人群健康的公共卫生问题，对经济社会发展产生越来越严重的影响。
1999年WHO将糖尿病分为Ⅰ型糖尿病、Ⅱ型糖尿病、妊娠糖尿病和特殊类型糖尿病，其中Ⅱ型糖尿病占所有糖尿病患病率的90％以上。Ⅰ型糖尿病的治疗主要是通过注射胰岛素或其类似物，而Ⅱ型糖尿病患者不需要依靠胰岛素，可使用口服降糖药、胰岛素及其类似物。对于大多数患者而言，口服降糖药是经济、实用、便利的治疗方案。目前治疗Ⅱ型糖尿病的口服降糖药物主要有：双胍类、磺脲类及非磺脲类胰岛素促泌剂、噻唑烷二酮类胰岛素增敏剂、α-葡糖糖苷酶抑制剂、胰高血糖素样肽-1(GLP-1)受体激动剂、DPP-IV抑制剂以及钠-葡萄糖共转运蛋白2(SGLT2)抑制剂等。
DPP-IV是位于细胞表面的一种丝氨酸蛋白酶，广泛存在于肾脏、胃肠道、结缔组织和淋巴结等组织中。GLP-1是由肠道内L细胞分泌的葡萄糖依赖性肠降血糖素，在体内具有抑制血糖升高作用，但易被DPP-IV降解而失去活性。DPP-IV抑制剂能有效延长GLP-1半衰期，增强葡萄糖诱导的胰岛素分泌，调节血糖浓度。DPP-IV抑制剂与其他口服降糖药物的不同是，仅在人体血糖高于正常水平的情况下才会增加人体胰岛素的分泌。在低血糖的时候，肠促胰岛激素与β细胞表面的特异性受体结合后，仅引发钙离子的少量内流和胰岛素的微量释放，不会导致血糖的进一步降低，所以这类药物的应用不会引起低血糖。由于诸多优势，DPP-IV抑制剂已是降糖药市场的新霸主。2006年全球首个上市的DPP-IV抑制剂—西格列汀(商品名：捷诺维)，在2016年联同其复方制剂—西格列汀+二甲双胍(商品名：捷诺达),二者销售合计达到61亿美元，超过了甘精胰岛素(Lantus)的销售额，成为全球最畅销的降糖药。
目前，临床上所使用的各种DPP-IV抑制剂，都属于化学药，主要通过化学合成的方法制得，其合成工艺复杂，环境污染压力较大，所以，开拓DPP-IV抑制剂全新的来源方式，将是本领域技术人员亟待解决的问题。
发明内容
为解决现有技术中DPP-IV抑制剂只能通过化学合成制备得到的缺陷，本发明提供了一种利用多粘类芽孢杆菌制备DPP-IV抑制剂的方法及制备出的DPP-IV抑制剂，实现的目的为采用生物发酵方法制备出新型DPP-IV抑制剂，得到的抑制剂具有强烈和稳定的抑制活性。
为了实现上述目的，本发明提供以下技术方案：本发明提供的一种利用多粘类芽孢杆菌制备DPP-IV抑制剂的方法，包括如下步骤：(1)将多粘类芽孢杆菌接种于脱脂乳中进行发酵，所述多粘类芽孢杆菌的拉丁文分类命名为paenibacillus polymyxa，保藏编号为CGMCC No.10062，保藏时间为2014年11月26日，所述多粘类芽孢杆菌的接种量为多粘类芽孢杆菌在发酵产物的终浓度为2x106～2x107cfu/mL；该菌种保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(China General Microbiological Culture Collection Center,CGMCC),地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。邮编：100101。
(2)将步骤(1)得到的发酵产物水浴加热后，离心收集上清液，将收集到的上清液冷冻干燥后得到DPP-IV抑制剂。
本发明公开的制备方法，首次采用多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)CGMCC No.10062，以脱脂乳为培养基进行发酵，水浴加热灭活菌体和多种蛋白酶，离心取上清，冷冻干燥制备得到DPP-IV抑制剂，披露了多粘类芽孢杆菌CGMCC No.10062具有发酵脱脂乳生成DPP-IV抑制剂的新用途，拓宽了DPP-IV抑制剂的来源。同时，上述制备方法与超滤等方法相比，操作更加简单，成本更低，适用于工业化生产，并且多粘类芽孢杆菌CGMCCNo.10062发酵脱脂乳所制备的DPP-IV抑制剂的活性强，稳定性好。
进一步的，所述步骤(1)中的脱脂乳包括脱脂乳粉和水，脱脂乳粉占脱脂乳的质量百分比为5％～10％。
进一步的，所述步骤(1)中的发酵方法为将多粘类芽孢杆菌接种于脱脂乳中进行振荡培养，振荡速度为125rpm～220rpm。
进一步的，所述步骤(1)中的发酵方法为将多粘类芽孢杆菌接种于脱脂乳中进行振荡培养，振荡速度为125rpm～220rpm。
进一步的，所述步骤(2)中水浴加热温度为75℃～100℃，加热时间为10min～30min。
进一步的，所述步骤(2)中离心加速度为8,000g～12,000g，离心时间为10min～40min。
进一步的，所述步骤(2)中冷冻干燥为真空冷冻干燥，真空冷冻干燥的燥温度为-25℃～-35℃，真空冷冻干燥的时间为16h～32h，真空冷冻干燥的真空度为10Pa～30Pa。
本发明自然要求保护经过上述制备方法得到的DPP-IV抑制剂，该抑制剂对DPP-IV的半抑制浓度IC50≤20mg/mL。
本发明采用上述技术方案，包括以下有益效果：本发明利用多粘类芽孢杆菌制备DPP-IV抑制剂，极大简化了生产步骤，仅需发酵、加热灭活、离心和冷冻干燥四步，大大减少了传统复杂工艺可能带来的污染问题。制备所采用的发酵培养基来源广泛、成本低廉、天然安全，避免使用化学合成培养基；加上发酵菌种采用多粘类芽孢杆菌这单一菌种，上述的原料、菌种的组合，有利于产品品质的标准化与工业大规模生产的成本控制。
具体实施方式
下面通过具体的实施例对本发明做进一步的详细描述。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。实施例中所使用的试剂若未加说明，均为分析纯试剂，购买自国药集团。其他试验仪器、试剂、菌种，如未做特别说明，均可通过商业途径直接购得。
实施例一：本发明提供的一种利用多粘类芽孢杆菌制备DPP-IV抑制剂的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：
(1)将多粘类芽孢杆菌接种于脱脂乳中进行发酵，所述多粘类芽孢杆菌的保藏编号为CGMCC No.10062，所述多粘类芽孢杆菌的接种量为：多粘类芽孢杆菌在发酵产物的终浓度为2x106cfu/mL；
(2)将步骤(1)得到的发酵产物水浴加热后，离心收集上清液，将收集到的上清液冷冻干燥后得到DPP-IV抑制剂。
所述步骤(1)中的脱脂乳包括脱脂乳粉和水，脱脂乳粉占脱脂乳的质量百分比为5％。
所述步骤(1)中的发酵方法为将多粘类芽孢杆菌接种于脱脂乳中进行振荡培养，振荡速度为125rpm。
所述步骤(1)中发酵的温度为25℃，发酵的时间为3d。
所述步骤(2)中水浴加热温度为75℃，加热时间为10min。
所述步骤(2)中离心加速度为8,000g，离心时间为10min。
所述步骤(2)中冷冻干燥为真空冷冻干燥，真空冷冻干燥的燥温度为-28℃，真空冷冻干燥的时间为30h，真空冷冻干燥的真空度为10Pa。
经过上述方法制备得到的DPP-IV抑制剂，对DPP-IV的半抑制浓度IC50≤20mg/mL。
更为具体的，所述多粘类芽孢杆菌种子(发酵菌种)的制备：将多粘类芽孢杆菌CGMCC No.10062(该菌株的来源请参见公开号为CN106701610A的中国专利)的冻干粉用少量无菌蒸馏水溶解，用接种环取一环划线于TYC固体培养基(OXOID，英国)，30℃好氧培养48h取出，用接种环挑取单菌落放入10mL TYC液体培养基(OXOID，英国)，运用涡旋振荡器将菌落均匀分散于液体培养基内，30℃、180rpm振荡培养24h取出，以2％(v/v，种子液占发酵液的体积百分比，下同)接种量接种于TYC液体培养基(OXOID，英国)，30℃、180rpm振荡培养24h后，培养物12,000g离心10min，弃去上清，菌体用无菌蒸馏水洗涤2次后，用原培养体积的无菌蒸馏水悬浮，得到发酵用的种子。
脱脂乳的制备：将脱脂乳粉与蒸馏水混匀，充分溶解后，在110℃下灭菌15min，冷却至室温，即得所需浓度的脱脂乳。
实施例二：本发明提供的一种利用多粘类芽孢杆菌制备DPP-IV抑制剂的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：
(1)将多粘类芽孢杆菌接种于脱脂乳中进行发酵，所述多粘类芽孢杆菌的保藏编号为CGMCC No.10062，所述多粘类芽孢杆菌的接种量为：多粘类芽孢杆菌在发酵产物的终浓度为2x107cfu/mL；
(2)将步骤(1)得到的发酵产物水浴加热后，离心收集上清液，将收集到的上清液冷冻干燥后得到DPP-IV抑制剂。
所述步骤(1)中的脱脂乳包括脱脂乳粉和水，脱脂乳粉占脱脂乳的质量百分比为10％。
所述步骤(1)中的发酵方法为将多粘类芽孢杆菌接种于脱脂乳中进行振荡培养，振荡速度为220rpm。
所述步骤(1)中发酵的温度为35℃，发酵的时间为7d。
所述步骤(2)中水浴加热温度为100℃，加热时间为30min。
所述步骤(2)中离心加速度为12,000g，离心时间为40min。
所述步骤(2)中冷冻干燥为真空冷冻干燥，真空冷冻干燥的燥温度为-25℃，真空冷冻干燥的时间为28h，真空冷冻干燥的真空度为10Pa。
经过上述方法制备得到的DPP-IV抑制剂，对DPP-IV的半抑制浓度IC50≤20mg/mL。
实施例三：本发明提供的一种利用多粘类芽孢杆菌制备DPP-IV抑制剂的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：
(1)将多粘类芽孢杆菌接种于脱脂乳中进行发酵，所述多粘类芽孢杆菌的保藏编号为CGMCC No.10062，所述多粘类芽孢杆菌的接种量为：多粘类芽孢杆菌在发酵产物的终浓度为6x106cfu/mL；
(2)将步骤(1)得到的发酵产物水浴加热后，离心收集上清液，将收集到的上清液冷冻干燥后得到DPP-IV抑制剂。
所述步骤(1)中的脱脂乳包括脱脂乳粉和水，脱脂乳粉占脱脂乳的质量百分比为7％。
所述步骤(1)中的发酵方法为将多粘类芽孢杆菌接种于脱脂乳中进行振荡培养，振荡速度为150rpm。
所述步骤(1)中发酵的温度为30℃，发酵的时间为5d。
所述步骤(2)中水浴加热温度为85℃，加热时间为20min。
所述步骤(2)中离心加速度为9,000g，离心时间为25min。
所述步骤(2)中冷冻干燥为真空冷冻干燥，真空冷冻干燥的燥温度为-20℃，真空冷冻干燥的时间为24h，真空冷冻干燥的真空度为20Pa。
经过上述方法制备得到的DPP-IV抑制剂，对DPP-IV的半抑制浓度IC50≤20mg/mL。
各个实施例制备得到的DPP-IV(DPP-IV)抑制剂，可采用下述方法得到待检测液：将DPP-IV抑制剂溶于浓度为100mmol/L，pH 8.0的Tris-HCl缓冲溶液中，在室温下，10,000g离心10min，取上清，即可用于DPP-IV抑制活性的检测。
DPP-IV抑制剂的筛选模型：取25μL待测样品于1.0mL EP(Eppendorf)管，接着加入50μL，浓度为10mU/mLDPP-IV(Sigma，美国)，混匀，37℃温育15min，再加入25μL中含有0.8mmol/L的甘氨酰-脯氨酰-对硝基苯胺盐酸盐(Sigma，美国)，混匀，37℃反应30min，最后加入100μL，1mol/L，pH 4.0醋酸钠缓冲溶液终止反应。在4℃、10,000rpm离心2min，取200μL上清于96孔微孔板(Greiner bio-one，德国)，Spectra Max M5多功能酶标仪(MolecularDevices,美国)在405nm波长下，测定吸光度值。待测样品对DPP-IV的抑制活性，如以下公式所示：
Figure GDA0003161800440000061
其中：阴性对照组为空白脱脂乳替代待测样品；
阴性空白组：浓度100mmol/L的三(羟基甲基)氨基甲烷盐酸缓冲液(Tris-HCl，pH＝8.0)替代阴性对照组中的DPP-IV；
样品空白组为Tris-HCl替代待测样品组中的DPP-IV。
将实施例1中的接种量，脱脂乳浓度，培养温度，发酵时间、发酵振荡的速度、水浴加热温度逐一进行调整，获得了以下一组不同方法制备的DPP-IV抑制剂产品，采用上述方法测得的各组所得DPP-IV抑制剂对DPP-IV的抑制效果如表1所示。
表1.不同方法制备所得DPP-IV抑制剂的抑制效果
Figure GDA0003161800440000071
从表1所示的结果中可以得出，将所述DPP-IV抑制剂产品的制备方法中接种量，脱脂乳浓度，培养温度，发酵时间、发酵振荡的速度等调整到优选范围之外的时候，多粘类芽孢杆菌CGMCC No.10062依然可以发酵脱脂乳产生DPP-IV抑制剂，但是产物的DPP-IV抑制效果明显下降。
采用上述方法可重复数次平行试验，最终得到在本发明优选的发酵参数的范围之外时，多粘类芽孢杆菌CGMCC No.10062发酵脱脂乳，得到的DPP-IV抑制剂的抑制效果明显下降。例如，在接种量过少时，菌种繁殖速度慢，使得最终获得的DPP-IV抑制剂的活性低于优选的接种量范围；当接种量过多时，一定时间后菌种个体因生存空间及营养的限制而死亡或停滞生长，不利于代谢物的积累，也使得最终获得的DPP-IV抑制剂的活性低于优选的接种量范围。又例如，当发酵温度低于优选范围值时，菌种代谢缓慢，会导致DPP-IV抑制剂的活性有所降低。还例如，发酵的振荡速度低于优选范围时，菌种发酵的溶氧量不够，生长和代谢受到限制，导致DPP-IV抑制剂的活性降低。
本发明得到的DPP-IV抑制剂对DPP-IV半抑制浓度(IC50)的测定：以倍半稀释的方法将待测样品溶液进行稀释，获得不同浓度的待测样品组，利用上述检测方法测定不同浓度的待测样品对DPP-IV的抑制率，根据浓度与DPP-IV抑制率构成的线性关系，计算得出样品对DPP-IV的半抑制浓度(IC50)。进过数次平行试验检测，得到本发明的DPP-IV抑制剂，对DPP-IV的半抑制浓度IC50≤20mg/mL。
效果实施例1：冷藏条件下DPP-IV抑制剂抑制效果的稳定性将实施例1-3制备的产品A、B、C分别装入密封袋后，置于冷藏条件(8℃)保存0、10、20和30d后取出，分别测定各样品对DPP-IV的半抑制浓度IC50值，结果如表2所示。
表2.冷藏条件下DPP-IV抑制剂产品抑制效果的稳定性
Figure GDA0003161800440000081
由表2可知，所有测试的DPP-IV抑制剂产品在冷藏(8℃)保存30d后，对DPP-IV抑制活性保持在同一水平，即稳定性较好。
效果实施例2：
参考实施例1所述方法，比较由多粘类芽孢杆菌CGMCC No.10062、干酪乳杆菌(L.casei)ATCC 393(购买自ATCC)、保加利亚乳杆菌(L.bulgaricus)LB340(由丹尼斯科公司提供)、嗜热链球菌(S.thermophilus)ST-BODY-3(由科汉森公司提供)制备的DPP-IV抑制剂对DPP-IV的抑制效果，具体操作如下：
1、材料与方法
(a)种子(发酵菌种)的制备：
干酪乳杆菌和保加利亚乳杆菌种子的制备：将干酪乳杆菌ATCC 393和保加利亚乳杆菌LB340的冻干粉分别用少量无菌蒸馏水溶解，各自用接种环取一环划线于MRS固体培养基(Merck，德国)上，37℃厌氧培养24h取出，用接种环挑取单菌落放入1mL MRS液体(Merck，德国)，运用涡旋震荡器将菌落均匀分散于液体培养基内，37℃厌氧培养24h取出，以2％(v/v)接种量接种于50mL MRS液体，37℃培养24h后，培养物9,000rpm离心10分钟，弃去上清，菌体用无菌蒸馏水洗涤2次后，用原培养体积的无菌蒸馏水悬浮，得到相应的发酵用的种子。
嗜热链球菌种子的制备：将嗜热链球菌ST-BODY-3的冻干粉用少量无菌蒸馏水溶解，用接种环取一环划线于M17固体培养基(Merck，德国)上，40℃厌氧培养24h取出，用接种环挑取单菌落放入1mL M17液体(Merck，德国)，运用涡旋震荡器将菌落均匀分散于液体培养基内，40℃厌氧培养24h取出，以2％(v/v)接种量接种于50mL M17液体，40℃培养24h后，培养物9,000rpm离心10min，弃去上清，菌体用无菌蒸馏水洗涤2次后，用原培养体积的无菌蒸馏水悬浮，得到发酵用的种子。
(b)脱脂乳的制备：同实施例1。
(c)待测样品制备：同实施例1。
2、DPP-IV抑制剂产品的制备
将各菌株以终浓度为8.0x106cfu/ml接种量无菌接种于8％(w/w)脱脂乳，分别培养(保加利亚乳杆菌和干酪乳杆菌37℃厌氧培养，嗜热链球菌40℃厌氧培养，多粘类芽孢杆菌30℃、220rpm振荡培养)4d，获得相应的发酵乳。
将上述发酵乳按照实施例1中所述方法进行灭菌，离心，超滤，冷冻干燥，制备得到DPP-IV抑制剂。
3、DPP-IV抑制剂活性的测定
上述不同菌株制备的DPP-IV抑制剂的抑制效果如表3所示：
表3.不同菌株制备的DPP-IV抑制剂的抑制效果
Figure GDA0003161800440000091
由表3可知，其他常规发酵菌株不具有发酵脱脂乳产生DPP-IV抑制剂的能力，而多粘类芽孢杆菌CGMCC No.10062可以发酵脱脂乳，最后得到DPP-IV抑制剂，对DPP-IV的抑制活性非常显著。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种利用多粘类芽孢杆菌作为制备DPP-IV抑制剂的用途，其特征在于，该用途包括如下步骤：
(1)将多粘类芽孢杆菌接种于脱脂乳中进行发酵，所述多粘类芽孢杆菌的保藏编号为CGMCC No.10062；
(2)将步骤(1)得到的发酵产物水浴加热后，离心收集上清液，将收集到的上清液冷冻干燥后得到DPP-IV抑制剂；所述步骤(2)中冷冻干燥为真空冷冻干燥，真空冷冻干燥的燥温度为-25℃～-35℃，真空冷冻干燥的时间为16h～32h，真空冷冻干燥的真空度为10Pa～30Pa；
上述步骤(1)所得到的发酵产物中的多粘类芽孢杆菌终浓度为2x106～2x107cfu/mL。
2.根据权利要求1所述的利用多粘类芽孢杆菌作为制备DPP-IV抑制剂的用途，其特征在于，所述步骤(1)中的脱脂乳包括脱脂乳粉和水，脱脂乳粉占脱脂乳的质量百分比为5％～10％。
3.根据权利要求1所述的利用多粘类芽孢杆菌作为制备DPP-IV抑制剂的用途，其特征在于，所述步骤(1)中的发酵方法为将多粘类芽孢杆菌接种于脱脂乳中进行振荡培养，振荡速度为125rpm～220rpm。
4.根据权利要求1或3所述的利用多粘类芽孢杆菌作为制备DPP-IV抑制剂的用途，其特征在于，所述步骤(1)中发酵的温度为25℃～35℃，发酵的时间为3d～7d。
5.根据权利要求1所述的利用多粘类芽孢杆菌作为制备DPP-IV抑制剂的用途，其特征在于，所述步骤(2)中水浴加热温度为75℃～100℃，加热时间为10min～30min。
6.根据权利要求1所述的利用多粘类芽孢杆菌作为制备DPP-IV抑制剂的用途，其特征在于，所述步骤(2)中离心加速度为8,000g～12,000g，离心时间为10min～40min。
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