CN110746488A - 一种具有食品防腐保鲜作用的细菌素pe-zyb1及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种具有食品防腐保鲜作用的细菌素PE‑ZYB1及其应用，本发明采用乙酸乙酯萃取、Sephadex LH‑20柱层析系统纯化、离子交换色谱纯化和半制备型反相液相色谱纯化四步法从乳酸菌zy‑B中分离、纯化得到得到一种细菌素PE‑ZYB1，该细菌素具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，与抗菌肽Andersonin‑X1相似度接近，相似度仅为38.09％，该细菌素对革兰氏阳性和革兰氏阴性的食源性致病菌与腐败菌均具有广谱抗菌活性，在高温下具有较高的耐热性和稳定性且在pH值2‑7时仍可保持较好的抑菌活性，尤其是对单增李斯特菌具有杀死作用，可以应用于食品防腐保鲜领域。

Description

一种具有食品防腐保鲜作用的细菌素PE-ZYB1及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种具有食品防腐保鲜作用的细菌素PE-ZYB1及其应用。

背景技术

食品在加工和保藏过程中，极易受到微生物污染而导致腐败变质，微生物污染已成为一个世界性的食品安全问题，它不仅造成食品腐败，而且还导致重大的健康和经济损失。如单核细胞增生李斯特氏菌(单增李斯特菌)、鼠伤寒沙门氏菌、大肠埃希菌、弯曲菌属等往往导致李斯特菌病、腹泻综合症、溶血性尿毒症及沙门氏菌病等严重的食源性疾病。当前，采用防腐剂抑制微生物，延缓腐败是食品保鲜的重要技术之一。然而，食品中使用的最多是化学防腐剂，影响人体健康，应用越来越受到众多国家的限制。天然生物防腐剂具有安全、无毒、适用性广、性能稳定等优点，因此，开发天然食品生物防腐剂，尤其是由微生物所产生的天然食品防腐剂，以替代目前广泛使用的化学防腐剂已成为现代食品工业的重要任务。

乳酸菌(lactic acid bacteria，LAB)，是一类能利用碳水化合物产生大量乳酸的革兰氏阳性细菌的通称，广泛存在于自然界中，被公认为是安全的食品级微生物。研究表明许多乳酸菌产生的细菌素对人类和动物的致病微生物或者腐败微生物具有抑制活性。因此乳酸菌产生的细菌素更受科研工作者的亲睐。

细菌素是核糖体合成的抗菌肽或由各种革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌分泌的复杂蛋白质。细菌素根据其生化特性和氨基酸序列以及产生菌的遗传特征或二硫化物或单硫化物的存在键、分子量、热稳定性、蛋白酶稳定性、是否存在氨基酸的翻译后修饰和抗菌作用等可分为Class I类细菌素、Class II类细菌素和Class III类细菌素，其中，Class II类细菌素是一类具有热稳定性，并且分子量小于10kDa，非羊毛硫的或未经修饰或类似pediocin的细菌素。Class II类细菌素又分为Class IIa类细菌素和Class IIb类细菌素(双肽细菌素)，Class IIa类细菌素是一类对单增李斯特菌(Listeria monocytogenes)具有强烈抑制作用的细菌素，N-端具有保守序列YGNGV等37个氨基酸残基组成，C端包含α-螺旋结构，其作用机理是C端结构插入细胞膜形成孔洞造成细胞内物质泄漏导致死亡，此类细菌素也对部分真菌具有抑制活性。

随着食品化学防腐剂的使用所引起的问题，天然的防腐剂越来越被人们所关注，尤其是由微生物所产生的天然食品防腐剂，乳酸菌所产生的细菌素是由自身代谢过程中合成并分泌外界当中的一类具有抑菌活性的肽或者蛋白质性质的物质，它在人体内可被降解，具有无毒、无残留、高效、耐酸、耐高温、无抗药性等特点，其中IIa类乳酸菌素以具有抗菌活性强，抗菌谱广的特点已成为天然防腐剂研究与开发的热点。然而，由于常用的商业乳酸菌素nisin只对革兰氏阳性菌有抗菌作用，所以亟需找到更多具有抗菌谱广抗菌性强的乳酸菌素。

发明内容

为了克服上述现有技术的不足，本发明提出了一种具有食品防腐保鲜作用的细菌素PE-ZYB1及其应用，该细菌素对革兰氏阳性和革兰氏阴性的食源性致病菌与腐败菌均具有广谱抗菌活性，在高温下具有较高的耐热性和稳定性，且在pH值2-7时仍可保持较好的抑菌活性。尤其是对单增李斯特菌具有杀死作用，并不是单纯地抑制作用，可以应用于食品防腐保鲜领域。

为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：

本发明提供一种细菌素PE-ZYB1，所述细菌素PE-ZYB1具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，所述细菌素PE-ZYB1的分子量为2019.22Da。通过抗菌肽数据库(ADP)比对后发现此细菌素与抗菌肽Andersonin-X1(登录号：AP 01874)相似度接近，仅仅只有38.09％。推测此细菌素可能是潜在的新型细菌素。

进一步的，上述的细菌素PE-ZYB1可以应用于食品防腐保鲜中。

抗菌谱测定实验表明，细菌素PE-ZYB1不仅对单增李斯特菌、金黄色葡萄球菌等革兰氏阳性细菌有较强的抑制作用，同时对革兰氏阴性菌如副溶血性弧菌、大肠杆菌、产气肠杆菌、铜绿假单胞菌、变形杆菌、溶血性链球菌也有抑制作用抑制，而且对枯草芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌也有抑制作用。表明细菌素PE-ZYB1具有较广泛的抗菌谱。因此细菌素PE-ZYB1可以作为潜在的天然抗菌药物或生物保鲜剂应用于食品工业。

优选的，所述细菌素PE-ZYB1以细菌素溶液的形式直接喷涂于固体食品的表面，或混合于液体食品中，用于抑制食品中的单增李斯特菌、金黄色葡萄球菌、副溶血性弧菌、大肠杆菌、产气肠杆菌、铜绿假单胞菌、变形杆菌、溶血性链球菌、枯草芽孢杆菌和蜡状芽孢杆菌。所述固体食品包括肉类食品(如鸡脚、鸡翅、猪蹄、猪皮、猪耳朵等)或蔬菜类食品(如竹笋、萝卜等)，所述液体食品包括饮料(如果汁等)和酒类(如啤酒等)。

更优选的，将所述细菌素PE-ZYB1溶于纯水，得到细菌素溶液，所述细菌素溶液的质量浓度不低于50μg/mL。

更优选的，按质量百分比算，所述细菌素溶液的用量为食品的0.5-1％。

更进一步的，所述细菌素PE-ZYB1可以应用于制备食品防腐剂，具体的，所述细菌素PE-ZYB1尤其适用于制备抗单增李斯特菌食品防腐剂，所述细菌素PE-ZYB1的效价为5120AU/mL。

以单增李斯特菌为指示菌，采用连续双倍稀释法测定细菌素的效价，结果表明细菌素PE-ZYB1的效价为5120AU/mL。细菌素PE-ZYB1对单增李斯特菌的生长抑制状况方面的实验表明，细菌素PE-ZYB1对单增李斯特菌的生长抑制状况非常明显，在对细胞膜通透性的影响方面，测定了细菌素PE-ZYB1处理对单增李斯特菌的胞外电导率影响，结果发现经细菌素PE-ZYB1作用后的单增李斯特菌胞外电导率在1小时后迅速增加，这说明细菌素PE-ZYB1能对细胞膜造成损伤，使细胞膜通透性增强。通过扫描电镜观察到单增李斯特菌被作用前后细胞形态发生了非常明显的变化，被细菌素作用后的单增李斯特菌细胞发生褶皱、形态出现凹陷、细胞周围出现不规整形态，而且细胞出现孔洞，细胞内物质流出。这说明细菌素PE-ZYB1对细胞膜造成孔洞能或者改变细胞的渗透性导致细胞内物质的流出，最后导致细胞死亡，证明细菌素PE-ZYB1对单增李斯特菌具有杀死作用，并不是单纯地抑制作用。

优选的，以所述细菌素PE-ZYB1为主要原料，辅以食品领域可接受的辅料制备得到食品防腐剂。

更优选的，按质量百分比计，所述细菌素PE-ZYB1的用量不低于50％，所述辅料的用量不为零。

更优选的，所述辅料选自壳聚糖、大豆磷脂、大蒜素、鱼精蛋白、溶菌酶、茶多酚、海藻酸钠、咖啡因和纳他霉素中的一种或多种，多种辅料时，各种辅料间以任意比例复配。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明采用乙酸乙酯萃取、Sephadex LH-20柱层析系统纯化、离子交换色谱纯化和半制备型反相液相色谱纯化四步法从乳酸菌zy-B中分离、纯化得到得到一种细菌素PE-ZYB1，该细菌素的分子量为2019.22Da，N端具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，与抗菌肽Andersonin-X1(登录号：AP 01874)相似度接近，相似度仅为38.09％，推测此细菌素可能是潜在的新型细菌素。

抗菌谱测定实验表明，细菌素PE-ZYB1具有广泛的抗菌谱，不仅对单增李斯特菌、金黄色葡萄球菌等革兰氏阳性细菌有较强的抑制作用，同时对革兰氏阴性菌如副溶血性弧菌、大肠杆菌、产气肠杆菌、铜绿假单胞菌、变形杆菌、溶血性链球菌也有抑制作用，而且对枯草芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌也有抑制作用。

蛋白酶、温度和pH的影响实验表明，细菌素PE-ZYB1在高温下具有较高的耐热性和稳定性，在pH值为2-7范围内，细菌素PE-ZYB1可以保持较好的抑菌活性。细菌素PE-ZYB1在蛋白酶敏感试验中发现对胰蛋白酶较为敏感。

细菌素PE-ZYB1对单核细胞增生李斯特菌生长的影响实验发现，细菌素PE-ZYB1对单增李斯特菌的生长抑制状况非常明显；细菌素PE-ZYB1对单增李斯特菌膜通透性的影响实验发现，细菌素PE-ZYB1作用后的单增李斯特菌胞外电导率在1小时后明显上升，说明细菌素PE-ZYB1能够改变细胞膜的通透性或者造成孔洞使细胞损伤；细菌素PE-ZYB1对单增李斯特菌细胞形态的影响实验发现，通过扫描电镜观察到单增李斯特菌被作用前后细胞形态发生了明显的变化，作用后的细胞膜出现褶皱、细胞表面出现凹陷、细胞四周出现不规整，而且细胞破裂，胞内物质溶出，说明细菌素PE-ZYB1对细胞膜造成的损伤能使胞内的大分子物质泄漏，最后导致细胞死亡。

综上可见，细菌素PE-ZYB1对革兰氏阳性和革兰氏阴性的食源性致病菌与腐败菌均具有广谱抗菌活性，在高温下具有较高的耐热性和稳定性且在pH值2-7时仍可保持较好的抑菌活性。尤其是对单增李斯特菌具有杀死作用，并不是单纯地抑制作用，可以应用于食品防腐保鲜领域，如食品防腐剂等。

附图说明

图1为菌株zy-B发酵上清液和乙酸乙酯萃取后的细菌素粗提物对单增李斯特菌的抑制效果(图中，1：菌株zy-B发酵上清液；2：乙酸乙酯萃取后细菌素；3：乙酸乙酯；CK：空白对照)；

图2为25-32管组分对单增李斯特菌的抑制效果；

图3离子交换色谱纯化细菌素的洗脱曲线；

图4为半制备型反相色谱纯化细菌素洗脱曲线；

图5为H5组分纯度的RP-HPLC色谱鉴定图；

图6为细菌素PE-ZYB1的MS/MS图；

图7为细菌素PE-ZYB1对李斯特菌生长的影响；

图8为细菌素PE-ZYB1对单增李斯特菌电导率的影响；

图9为细菌素PE-ZYB1处理单增李斯特菌后的扫描电镜图(图中，A：空白对照；B：处理1.5结果；C：处理3h结果)。

具体实施方式

下面对本发明的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。

下述实验例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。

实验材料：MRS液体培养基的配方具体参考文献：Delves-Broughton J.Nisin andits application as a food preservative[J].International Journal ofDairyTechnology,2010,43(3):73-76.

MightyAmp DNA聚合酶、2×MightyAmp buffer，购于宝生物工程(大连)有限公司。

胰酪胨大豆酵母浸膏琼脂(TSA-YE培养基)、营养琼脂培养基、含3％氯化钠的营养琼脂培养基、琼脂糖，购于北京陆桥技术有限责任公司。

胰蛋白酶、胃蛋白酶，购于上海生工生物有限公司；木瓜蛋白酶购于美国Sigma公司。

乳酸菌zy-B，保存于广东海洋大学食品安全微生物保藏室，并于2019年8月19日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(广州市先烈中路100号大院59号楼5楼)，保藏编号为GDMCC No:60743，分类命名为Pediococcus pentosaceus zy-B。

各指示菌均为市售，详细情况见表1：

表1指示菌种

实施例1细菌素PE-ZYB1的分离、纯化

(1)乳酸菌zy-B发酵上清液制备和细菌素效价的测定方法

将斜面保存的乳酸菌zy-B转接于MRS液体培养基中，置于恒温摇床于28℃、150r/min下培养，活化2代后按照3％的接种量接种于1L MRS液体培养基中，28℃培养48h，收集发酵液于12,000rpm、4℃下离心10min，除去菌体保留发酵上清液，发酵上清液使用0.22μm滤膜进行过滤，将发酵上清液以单增李斯特菌为指示菌进行抑菌活性测定，4℃保存备用。其中，抑菌活性的测定采用双层琼脂牛津杯法，牛津杯法的具体操作方法参照“焦冬冬,任文彬,赵鸭美,et al.南海海域动物肠道中抗菌活性乳酸菌的分离及多样性分析[J].食品科学,2017(08):82-87.”。

采用连续双倍稀释法测定细菌素效价，以定量测定细菌素活性。细菌素液用无菌去离子水连续稀释两倍，在牛津杯中加入100μL的稀释液测定抗菌活性(以单增李斯特菌为指示菌)。其抗菌效价(AU)的计算公式为2ⁿ×1000μL/100μL，其中n是明显有抑制圈的稀释度(具体操作方法参照“

A.C M,Carvalho M A R,Bemquerer M P,etal.Purification and partial characterization of a bacteriocin produced byEikenella corrodens[J].Journal of Applied Microbiology,2010,104(2):508-514.”)。

(2)细菌素粗提取物的抽提(乙酸乙酯萃取法)

取1L上述发酵上清液与乙酸乙酯按1：1的比例混合，置于摇床以120r/min的转速放置过夜。收集上部有机相，下层发酵上清液再使用等体积乙酸乙酯提取两次。将有机相混合后使用旋转蒸发器在40℃的真空下进行蒸发、浓缩，收集含有残留物的馏分，得到细菌素粗提取物。细菌素粗提取物使用25mL PBS(磷酸缓冲盐溶液)重新复溶，利用双层琼脂牛津杯法对单增李斯特菌进行抑菌活性测定和效价测定。

图1的抑菌活性测定实验结果表明，乳酸菌zy-B的发酵上清液经过乙酸乙酯萃取后仍具有较好的抑菌效果，通过效价测定经初步纯化的细菌素粗提物的效价为6553.6AU/mL。表明可以使用乙酸乙酯从发酵上清液中萃取细菌素，进行下一步的纯化。

(3)采用Sephadex LH-20柱层析系统纯化细菌素

Sephadex LH-20柱层析系统是使用有分子筛功能的葡聚糖凝胶，利用不同物质分子大小不同来进行组分的分离纯化。具体方法参照：赵圣明,赵岩岩,马汉军.植物乳杆菌JLA-9产细菌素的分离纯化[J].食品与发酵工业,2017,43(6):60-65。

将经乙酸乙酯萃取得到的细菌素粗提取物利用PBS溶解，将样品浓缩至尽量小的体积，0.22μm滤膜过滤除去杂质后，采用湿法上样，先用纯甲醇将凝胶柱洗脱一个柱体积，除去之前残存的杂质，再利用80％甲醇-水的洗脱体系洗脱一个柱体积，平衡凝胶柱。然后将样品直接加入Sephadex LH-20凝胶层析柱，利用80％甲醇-水进行洗脱，流速设置为1mL/5min，5mL/管，利用全自动收集器进行样品收集，最后用纯甲醇洗脱，收集每一管洗脱样品进行抑菌测定。

将25mL乙酸乙酯纯化的细菌素粗提物样品上样于LH-20凝胶柱，利用甲醇：水(8:2)的洗脱体系洗脱，电脑自动收集器共收集到40管洗脱样品，测定每管样品的抑制单增李斯特菌活性，结果见图2，通过测定每管的抑菌活性后发现第25、26、27、28、29、30、31和32号管具有不同的抑菌效果，合并冻干复溶后测定其效价为8192AU/mL，进行下一步阳离子交换纯化。

(4)采用离子交换色谱纯化细菌素

当pH<pI时大部分细菌素带正电，所以可以选用在合适的pH下的细菌素溶液使用离子交换色谱进一步纯化细菌素，通过调节pH、上样量、洗脱流速与NaCl的浓度得到合适的洗脱体系来进行细菌素的分离，具体方法参照“任丽.新型双歧杆菌细菌素bifidocin A的提纯、特性及分子结构研究[D].2015.”。

取10mL经LH-20凝胶柱纯化得到的细菌素上样于AKTA系统中，与SP FF阳离子柱结合后，先用20nmol/L的柠檬酸缓冲液(pH 6.0)冲洗未结合的杂质蛋白，洗至基线平衡；再使用1mol/L的NaCl溶液梯度洗脱目标蛋白，同时在280nm处检测吸收峰，自动收集器收集样品，分别检测每管的抗菌活性。

280nm处检测收集组分，洗脱曲线如图3所示，经检测出现两个吸收峰S1和S2，通过抗菌活性测定发现S2具有抑菌活性，效价为4096AU/mL。

(5)采用半制备型反相液相色谱纯化细菌素：

利用HP Plus 50D全自动中高压制备液相色谱仪对经过阳离子交换色谱收集的组分进一步分离纯化，C18反相柱填料：SinoChromODS-AP 15μm；尺寸：20.0mm*250mm；柱号：2617138；流动相为甲醇-水，使用前样品均需经0.22μm滤膜过滤，并且超声脱气；上述S2样品经过0.22μm滤膜阳离子交换层析，通过进样环上样，0～4min，10％的甲醇-水等度洗脱；4～13min，10％甲醇-水～25％的甲醇-水梯度洗脱；13～21min，25％～30％的甲醇-水梯度洗脱21～22min，30％～40％甲醇梯度洗脱；22～32min利用100％甲醇等度洗脱，收集对单增李斯特菌具有抑制活性的组分。

洗脱曲线如图4所示，0～4min，10％的甲醇-水等度洗脱，得到组分H1；4～13min，10％甲醇-水25％的甲醇-水梯度洗脱，得到组分H2；13～21min，25％～30％的甲醇-水，得到组分H3和组分H4；21～22min，30％～40％甲醇没有组分；22～32min利用100％甲醇等度洗脱，得到组分H5。经抗菌活性检测发现只有峰H5具有抑菌活性，效价为5120AU/mL。

用RP-HPLC分析色谱对H5峰的纯度进行鉴定，如图5所示，结果发现只在t＝1.859min时出现一个峰，表明纯化的细菌素已达到单一组分。至此得到纯化的细菌素PE-ZYB1。

实施例2细菌素PE-ZYB1的分子质量测定与氨基酸分析

将纯化得到的细菌素PE-ZYB1寄送于北京百泰派克生物技术有限公司，用LC-MS/MS系统(岛津LC-20AD nano flow-LC与Thermo Fisher Scientific Q Exactive massspectrometer)对多肽片段进行分析。一级质谱扫描范围为350-1800(m/z)，分辨率为70000，二级MS/MS分辨率为17500。通过MaxQuant分析软件将得到的氨基酸序列与通用蛋白数据库(UniProt)、BLAST(http：/www.uniprot.org/BLAST/)和抗肽数据库(APD)保存的序列进行比较(http：/aps.unmc.edu/ap/main.html)。

LC-MS/MS分析发现，细菌素PE-ZYB1具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列(图6)，细菌素PE-ZYB1的分子量为2019.22Da。与通用蛋白数据库(UniProt)进行比较发现细菌素PE-ZYB1与数据库中一种未鉴定的蛋白质相似，并且与其他文献报道的抗菌肽无同源性。在抗菌肽数据库(APD)中搜索，发现与抗菌肽Andersonin-X1(登录号：AP 01874)相似，最高相似性为38.09％。表明细菌素PE-ZYB1可能为潜在的新型细菌素。

实施例3细菌素PE-ZYB1的抑菌谱测定

将细菌素PE-ZYB1溶液(用PBS稀释成50μg/mL)采用双层琼脂牛津杯法，以表1中的指示菌，进行指示菌抑菌谱实验，测抑菌圈直径。牛津杯法的具体操作方法参照“焦冬冬,任文彬,赵鸭美,et al.南海海域动物肠道中抗菌活性乳酸菌的分离及多样性分析[J].食品科学,2017(08):82-87.”。其中，Listeria monocytogenes接种于TSA-YE培养基，Staphylococcus aureus、Escherichia coli、Bacillus subtilis、Bacillus cereus、Enterobacter aerogenes、Pseudomonas aeruginosa、Streptococcus hemolytics、Proteus bacillus接种于营养琼脂培养基，Vibrio parahemolyticus接种于含3％氯化钠的营养琼脂培养基，37℃培养24h。

采用牛津杯法对10种指示菌进行细菌素PE-ZYB1抗菌谱测定(表2)，结果发现它不仅对单增李斯特菌、金黄色葡萄球菌等革兰氏阳性细菌有较强的抑制作用，同时对革兰阴性菌如副溶血性弧菌、大肠杆菌、产气肠杆菌、铜绿假单胞菌、变形杆菌、溶血性链球菌也有抑制作用，而且对枯草芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌也有抑制作用。结果表明细菌素PE-ZYB1具有较广泛的抗菌谱。因此细菌PE-ZYB1可以作为潜在的天然抗菌药物或生物保鲜剂应用于食品工业。细菌素具有广泛的抗菌活性，在食品工业中是有用和有价值的。

表2细菌素PE-ZYB1的抗菌谱

注：抑菌直径(mm):+++:>20；++:14-20；+:＜14mm.(牛津杯直径为8mm)；/：无抑菌效果。

实施例4蛋白酶、温度和pH对细菌素PE-ZYB1对抗菌活性的影响

(1)pH对细菌素PE-ZYB1活性的影响

分别用pH 2～10的柠檬酸缓冲液(20mM)将细菌素PE-ZYB1配制成终浓度为50μg/mL的溶液。以单增李斯特菌为指示菌，采用双层琼脂牛津杯法测定抑菌活性，观察抑菌圈大小的变化。

(2)温度对对细菌素PE-ZYB1活性的影响

将细菌素PE-ZYB1溶液(用PBS稀释成50μg/mL)分别在40℃、60℃、80℃、100℃、121℃下处理30min，用双层琼脂牛津杯法测定抑菌活性，以单增李斯特菌为指示菌，观察抑菌圈大小的变化。

(3)蛋白酶对对细菌素PE-ZYB1活性的影响

取3份细菌素PE-ZYB1溶液(用PBS稀释成50μg/mL)，按胃蛋白酶(pepsase)、木瓜蛋白酶(Papain)和胰蛋白酶(Trypsin)的pH值分别为2.0、6.0和7.4，并使各蛋白酶的终浓度均为1.0mg/mL的标准分别加入蛋白酶、木瓜蛋白酶和胰蛋白酶，37℃下水浴4h后调至pH值为6.0，用双层琼脂牛津杯法测定抑菌活性，以单增李斯特菌为指示菌，观察抑菌圈大小的变化。

如表3的所示，温度处理结果发现细菌素PE-ZYB1具有较强的热稳定性，在40～100℃的处理后，发现其抗菌活性的保存率为86.3％～94.9％，即使在121℃高温下20min，其抗菌活性仍保留了80.2％。由于高温杀菌是食品工业中的一种常规处理方法，因此细菌素PE-ZYB1作为生物防腐剂应用于食品工业可能是一种优势。pH处理结果发现pH 2.0～8.0条件下，其活性仍保持在62.1％以上，说明细菌素PE-ZYB1在酸性条件下具有更好的抑菌活性，适合作为酸性食品的防腐剂。蛋白酶的处理结果发现，用木瓜蛋白酶和肽酶(胃蛋白酶)处理后，细菌素PE-ZYB1的抗菌活性分别为77.1％和64.7％，细菌素PE-ZYB1经胰蛋白酶处理后几乎完全灭活，说明细菌素PE-ZYB1是一种蛋白质。

表3温度、pH和蛋白酶对细菌素PE-ZYB1抗菌活性影响

实施例5细菌素PE-ZYB1对单核细胞增生李斯特菌生长的影响

将单增李斯特菌使用TSB-YE活化两代后，按照3％的接种量分别接种于2支含有10mL TSB-YE的试管中，置于摇床中于37℃、150r/min下培养至对数生长期(OD600＝0.15～0.20)，然后其中一支试管加入纯化的细菌素PE-ZYB1，终浓度为50μg/mL，另一支作为对照组加入等体积的无菌生理盐水。每1h取一次细菌悬液，用VarioskanFlash酶标仪测量600nm下的吸光值，并绘制生长曲线。

如图7所示，经过细菌素PE-ZYB1处理后的实验组，单增李斯特菌培养液的OD 600值在2h时略有增加，随后保持在OD600＝0.27左右，表明李斯特菌在2h后被完全抑制。在空白组不添加细菌素PE-ZYB1的情况下，单增李斯特菌培养液的OD 600值在1h后开始一直增加，直到8h后达到平衡。比较这两条曲线，说明细菌素PE-ZYB1对单增李斯特菌的生长有明显的抑制作用。

实施例6细菌素PE-ZYB1对单增李斯特菌膜通透性的影响

将斜面保存的单增李斯特菌使用TSB-YE活化两代后，按3％的接种量接种于TSB-YE培养基中，置于摇床中于37℃、120r/min下培养18h。将培养好的发酵液以4℃，4000r/min，10min的条件离心，保留菌体弃去上清液，吸取无菌PBS缓冲液置于菌体的离心管中，反复吹打洗涤菌体，重复洗涤三次。分别用无菌生理盐水和无菌PBS缓冲液将洗涤干净的菌体稀释至10⁸CFU/mL，分别吸取1mL已稀释的菌悬液于两个无菌试管中，分为实验组与对照组，在实验组中加入纯化的细菌素PE-ZYB1，终浓度为50μg/mL，于37℃恒温培养箱中温育，每隔0.5h取适量温育的菌悬液在4℃下以5000r/min的转速离心10min，取上清液测电导率。以时间为横坐标，电导率为纵坐标绘制曲线。

如图8所示，发现经过细菌素PE-ZYB1处理的单增李斯特菌的无菌上清液的电导率在1h后持续上升到400μS/cm，而未处理的单增李斯特菌的无菌上清液始终保持在100μS/cm范围。细胞膜将细胞与外界环境分隔，维持着细胞的渗透压与外界物质的传递，对维持细胞正常生命活动起着重要的作用。如果细胞膜受到不同程度的破坏，就会导致细胞外电解质渗漏，从而外液的电导率增加，这样可以被电导率仪测量出来。表明经过处理过的单增李斯特菌的细胞膜被细菌素PE-ZYB1迅速破坏，可能改变了其细胞膜的完整性与通透性，细胞内的物质流出导致细胞外的电导率大幅度上升，其杀菌方式可能是破坏细菌膜的完整性。

实施例7细菌素PE-ZYB1对单增李斯特菌细胞形态的影响

将斜面保存的单增李斯特菌使用TSB-YE活化两代后，按照3％的接种量接种于TSB-YE培养基中，置于摇床中于37℃、150r/min下培养16小时到达对数生长期，将培养好的发酵液以4℃，4000r/min，10min的条件离心，保留菌体弃去上清液，吸取无菌PBS缓冲液置于菌体的离心管中，反复吹打洗涤菌体，重复洗涤三次，后用生理盐水稀释配制成10⁸CFU/mL的菌悬液。将菌悬液分成三组，向两组实验组菌悬液里加入纯化后的细菌素PE-ZYB1，使终浓度为50μg/mL，一组37℃下置于恒温培养箱温育1.5h，另一组37℃下温育3h。空白对照组加入相同体积的无菌PBS缓冲液。作用好的菌悬液在4℃、4000r/min下离心10min，收集三组的菌体，配置成2.5％质量分数的戊二醛溶液，置于4℃固定过夜。固定一夜的菌体于4000r/min下离心10min，弃去戊二醛，用无菌PBS缓冲液洗涤，反复吹打至菌块均匀分散，用30％,50％,70％,85％,95％乙醇依次脱水一次，每次脱水15min，最终以100％的乙醇脱水2次，每次30min。将处理好的菌体用无菌PBS缓冲液稀释至一定浓度滴于在干净的铝箔纸上，冷冻干燥后将铝箔纸标本放入高真空蒸发器中喷金镀膜，扫描电镜下观察。

如图9所示，与实验组相比，空白对照组的单增李斯特菌的细胞膜保持完整、丰满而清晰的轮廓。但经细菌素PE-ZYB1处理1.5h后，发现细胞形态发生了明显的变化，出现了巨大的凹陷和轻微的细胞收缩。在经细菌素PE-ZYB1处理3h后，可以看出单增李斯特菌的细胞膜出现了不规则褶皱和细胞质物质渗漏。表明细菌素PE-ZYB1对单核细胞生长的细胞膜有破坏作用，也与电导率测定结果一致。

以上对本发明的实施方式作了详细说明，但本发明不限于所描述的实施方式。对于本领域的技术人员而言，在不脱离本发明原理和精神的情况下，对这些实施方式进行多种变化、修改、替换和变型，仍落入本发明的保护范围内。

序列表

<110> 广东海洋大学

<120> 一种具有食品防腐保鲜作用的细菌素PE-ZYB1及其应用

<141> 2019-10-17

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Ala Leu Pro Ala Leu Pro Ala Ala Ser Met Gly Thr Gly Ala Gly Val

1 5 10 15

Gly

Claims (8)

1.一种细菌素PE-ZYB1，其特征在于：所述细菌素PE-ZYB1具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。

2.如权利要求1所述的细菌素PE-ZYB1在食品防腐保鲜中应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述细菌素PE-ZYB1以细菌素溶液的形式直接喷涂于固体食品的表面，或混合于液体食品中。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：将所述细菌素PE-ZYB1溶于纯水，得到细菌素溶液，所述细菌素溶液的质量浓度不低于50μg/mL。

5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：按质量百分比算，所述细菌素溶液的用量占食品质量的0.5％-1％。

6.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述细菌素PE-ZYB1在制备抗单增李斯特菌食品防腐剂中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述食品防腐剂中还含有食品领域可接受的辅料。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述辅料选自壳聚糖、大豆磷脂、大蒜素、鱼精蛋白、溶菌酶、茶多酚、海藻酸钠、咖啡因或纳他霉素中的一种或多种。

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