CN116218701A - 一株贝莱斯芽孢杆菌1-3、菌株同时产2类抗菌物质的方法及其所产抗菌物质和用途 - Google Patents

一株贝莱斯芽孢杆菌1-3、菌株同时产2类抗菌物质的方法及其所产抗菌物质和用途 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株贝莱斯芽孢杆菌1‑3，该菌同时产生2类抗菌物质的方法、及其所产的抗菌物质和用途。该菌株1‑3分类命名为贝莱斯芽孢杆菌Bacillus velezensis，保藏编号为CGMCC No.25292。该菌经过发酵可同时产生2类抗菌物质，经大孔树脂可实现2类抗菌物质的100％分离，经结构确证2类抗菌物质分别为细菌素和脂肽类物质，其性质稳定，活性好，不仅能够作为新型抗生素替代品使用，还可以有效抑制食品腐败菌生长、降低病原菌对养殖动物的危害，同时，该菌合成的脂肽物质还可作为生物表面活性剂用于去除油污等环境治理应用。

Description

一株贝莱斯芽孢杆菌1-3、菌株同时产2类抗菌物质的方法及 其所产抗菌物质和用途
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株贝莱斯芽孢杆菌1-3、贝莱斯芽孢杆菌1-3同时产生两类抗菌物质的方法、及其所产的抗菌物质和用途。
技术背景
在全世界范围内，抗生素在医疗、畜牧等行业不规范使用引起的一系列食品、卫生和环境问题，严重威胁人类的健康。据世界卫生组织(World health organization，WHO)估计，在许多国家，50％以上的抗生素属于不当使用的范畴，其中最主要的是抗生素作为生长促进剂在畜牧养殖行业中的应用。
长期使用抗生素的灾难性后果包括：
1.抗生素作为促生长剂长期饲喂动物，导致动物源性食品和环境中抗生素残留问题日趋严重，抗生素残留进一步通过食物链向上传导，进而富集到人体内，更加剧了对人类健康的威胁。
2.更为严重的是抗生素的不规范使用导致细菌产生抗药性，而兽用抗生素耐药菌在传播过程中又面临人用抗生素的二次筛选，最终形成了对所有抗生素均具有抗性的“超级细菌”。
因此发掘抗菌机制有别于抗生素的新型抗菌物质才是解决病原菌内药性的根本手段。
另外，全世界每年农副产品、果蔬等食品及其原料因腐烂变质而引起的经济损失十分巨大。因此，延长它们的保质期是食品工业的一项重要任务，而添加防腐剂是防止食品腐败变质的重要方法。目前化学防腐剂如苯甲酸钠、山梨酸钾等依然在我国防腐剂市场上占有很大的份额，而化学防腐剂或多或少的对人体会有一定的毒副作用。随着生活水平的提高和保健意识的增强，人们对食品安全的关注度越来越高。天然、绿色、安全的生物防腐剂将占据更大的市场，并逐渐取代传统的化学防腐剂。生物防腐剂按照来源分为植物来源防腐剂、动物来源的防腐剂及微生物来源的防腐剂。其中微生物防腐剂主要以天然农产品为原料，通过发酵方法制得，具有安全无毒、适用性广、性能稳定和易于工业化生产等优点。
表面活性剂能降低溶剂表面张力和界面能量，因此具有强烈的去污能力，在处理被石油污染的土壤、水体等方面有着广泛的应用。然而，化学合成的表面活性剂通常具有毒性、热稳定性差等缺点，在治理环境的同时又引入的新的污染源。生物表面活性剂是微生物或植物在一定条件下培养时，其代谢过程中分泌出的具有一定表界面活性，集亲水基和疏水基结构于一分子内部的两亲化合物，如糖脂、多糖脂、脂肽或中性类脂衍生物等。它无毒，可以生物降解，对环境影响很小，热稳定性和化学稳定性较好，具有高效的表面活性，是合成表面活性剂的理想代替品。
发明内容
本发明提供了一株贝莱斯芽孢杆菌1-3，及贝莱斯芽孢杆菌1-3同时产生两类抗菌物质的方法及其所产抗菌物质的方法和用途。所述贝莱斯芽孢杆菌1-3可以同时产生2类不同的抑菌活性物质，并对多种病原菌具有很好的抑制作用，其提取得到的2类抗菌物质具有很好的抗菌活性，另一方面，抗菌物质2还具有清除油污的作用。
为实现上述发明目的，本发明通过下述技术方案予以实现：
本发明提供了一株口腔来源的贝莱斯芽孢杆菌菌株1-3，其分类命名为贝莱斯芽孢杆菌Bacillus velezensis，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.25292。
所述贝莱斯芽孢杆菌1-3菌落为圆形、白色，表面微凸、呈微褶皱状、无光泽、不透明，边缘明显清晰，菌落周围具有较宽的透明圈，菌体呈杆状。
进一步的，所述贝莱斯芽孢杆菌菌株1-3的16S rRNA序列如SEQ ID No.1所示。
另一方面，本发明提供了贝莱斯芽孢杆菌菌株1-3同时产生2类具有抑菌活性物质的方法，所述方法包括如下步骤：
(1)取贝莱斯芽孢杆菌1-3进行深层液体发酵；；
(2)分离纯化：
A.将(1)获得的发酵液离心，取发酵上清液经大孔树脂吸附；
B.吸附后的大孔树脂用2-5倍体积的蒸馏水洗，再依次用2-5倍体积的30％、
75％、95％浓度的乙醇洗脱，收集洗脱液；
C.将洗脱液于40-42℃的条件下旋转浓缩；将获得的浓缩液经冷冻、真空干燥后，得到粗提物；
D.对粗提物分别以75％的乙醇洗脱、并通过G-50分子筛凝胶层析纯化获得抗菌物质1，以95％的乙醇洗脱、并通过G-50分子筛凝胶层析纯化获得抗菌物质2。
进一步的，所用TSB-YE培养基为：可溶性淀粉15-18g/L，葡萄糖5-10g/L，酵母提取物15-20g/L，NaCl 8-12g/L，Mg2+浓度0.8-1.2mmol。将所述贝莱斯芽孢杆菌1-3接种于培养基中，37℃，180rpm条件下培养12小时得到种子液。按照2％将种子液的接种量接种到含有25L发酵培养基50L发酵罐中。
进一步的，所述方法中贝莱斯芽孢杆菌菌株1-3进行深层液体发酵时，条件如下：初始pH 6.0-8.0，装料量40％-80％，接种量1％-15％，培养温度30-40℃，通风为1:0.4～1:1.2，转速为100-400rpm，发酵时间24-72小时。
将发酵液离心，将发酵上清液与经预处理的大孔吸附树脂按5-10:1(v/m)的比例进行动态吸附，流速为1-2BV/h，在室温条件下吸附18-24h至发酵液被完全吸附；吸附后的废液以2-3BV的体积依次用2-5倍体积的蒸馏水、2-5倍体积的30％、75％、95％的乙醇进行梯度洗脱，控制流速为1-2BV/h，收集不同浓度的洗脱液；将不同区分洗脱液于40-42℃的条件下旋转蒸发浓缩，去除乙醇；将去除乙醇后的洗脱液经真空冷冻干燥，在75％乙醇洗脱区分得到了抗菌物质1，从95％乙醇区分中得到了抗菌物质2。
进一步的，所述步骤(2)分离纯化时发酵上清液与大孔树脂体积比为5-20:1。
所述方法获的抗菌物质的提取效率高，通过Tricine-SDS-PAGE电泳检测，可以实现100％的抑菌活性物质的吸附，可以通过75％的乙醇洗脱可以实现85％-95％抗菌提取物1的分离，通过95％的乙醇洗脱可以实现95％-100％抗菌提取物2的纯化。另一方面，本发明提供了一种贝莱斯芽孢杆菌1-3产生的抗菌物质1，其特征在于，所述抗菌物质1为细菌素，抗菌物质其蛋白质序列如SEQ ID No.2所示。
进一步的，通过G-50分子筛凝胶层析对抗菌物质1进行纯化，在280nm下得到单一吸收峰，冷冻干燥后得到抗菌物质1。
进一步的，通过Tricine-SDS-PAGE电泳检测，估算抗菌物质1粗品的分子量为7.0-7.5kDa，通过质谱抗菌物质1分子量为7351.405Da，并含有一段NASFAHAAW的序列。将该序列同贝莱斯芽孢杆菌1-3的转录组序列进行比对，发现其序列对应于转录组中唯一一条蛋白，而且序列完全一致。
进一步的，将所述蛋白序列定位到贝莱斯芽孢杆菌1-3基因组上，并从贝莱斯芽孢杆菌1-3基因组中克隆出相关基因，并翻译为蛋白序列，分子量为7369.63Da。
进一步的，将翻译的蛋白序列进行序列比对，发现其属于环状细菌素，即肽链首尾氨基酸残基通过肽键连接后，形成环状结构。
进一步的，肽链首尾氨基酸残基通过肽键连接后会失去一个水分子。
进一步的，翻译的蛋白序列分子量推测7369.63Da，若减去环化过程丢失的一个水分子，分子量应为7351.63，与一级质谱直接测定的抗菌物质1的分子量7351.405Da完全相同(小数点后的分子量差异系同位素不同计入所导致)。
进一步的，所述抗菌物质1可以耐受80℃以下的高温处理。
进一步的，所述抗菌物质1可以耐受pH4.0以上的环境条件。
进一步的，所述抗菌物质1可以耐受胰蛋白酶、胃蛋白酶、蛋白酶K、木瓜蛋白酶、糜蛋白酶的降解。
另一发明，本发明提供了一种本发明还提供了贝莱斯芽孢杆菌1-3产生的抗菌物质2。
通过G-50分子筛凝胶层析对抗菌物质2进行纯化，在280nm下得到检测吸收峰，冷冻干燥后得到抗菌物质2。
进一步的，所述抗菌物质2为环状脂肽。
进一步的，所述抗菌物质2的序列特征为：N端-LLVDLLE-C端，所述环肽的N端和C端通过肽键相连，形成了环状结构。
进一步的，通过薄层层析后碘染色发现抗菌物质2中含有脂肪链和肽链，是一种脂肽结构。
进一步的，发现抗菌物质2含有三个特征峰，分子量相差14，即一个CH2。通过二级质谱鉴定和解析，确定三个特征峰的结构为由一个环肽结构和三种C原子数不同的脂肪链连接形成的脂肽结构。
进一步的，三种C原子数不同的脂肪链含有的碳原子数分别为14、15和16个。通过质谱分析，发现抗菌物质2含有三个信号峰，分子量分别为1030.642Da、1044.660Da和1058.677Da。
另一方面，本发明还提供了所述的贝莱斯芽孢杆菌菌株1-3所产生的抗菌物质1和抗菌物质2在用于制备抑制病原菌的抗菌剂、食品防腐剂和环境治理产品中的用途。
进一步的，所述病原菌包括单细胞核增生李斯特菌、白色念珠菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、松鼠葡萄球菌、缓慢葡萄球菌、粪肠球菌、蜡样芽胞杆菌、大肠杆菌、溶藻弧菌、副溶血性弧菌、霍乱弧菌、嗜水气单胞菌、溶血不动杆菌、阪崎肠杆菌、肺炎克雷伯氏菌、阴沟肠杆菌、立枯丝核菌、植物炭疽病菌、杂色曲霉。
进一步的，所述抗菌物质1可通过降低单核增生李斯特菌的增殖速度。
进一步的，所述抗菌物质1对单核增生李斯特菌的增殖的最小抑菌浓度为2μg/mL。
进一步的，所述抗菌物质1对单核增生李斯特菌的抑菌机理为破坏其细胞膜结构，导致胞内K+和蛋白外流。
进一步的，所述抗菌物质1可以抑制单核增生李斯特菌生物被膜的形成。
另一方面，本发明还提供了所述的贝莱斯芽孢杆菌菌株1-3所产生的抗菌物质2在作为清除油渍的表面活性剂的用途。
进一步的，所述抗菌物质2作为表面活性剂在石油采油、页岩采油、洗涤、环境改良、土壤清除油渍上的用途。
进一步的，在应用时，抗菌物质2不低于0.16mg/mL时，具有清除油污的作用。
与现有技术相比，本发明具有以下优点和技术效果：
1)本发明提供了一株口腔来源的贝莱斯芽孢杆菌菌株1-3，该菌株能够同时产生2类抗菌物质。
2)本发明确定了菌株1-3同时产生2类抗菌活性物质的深层液体发酵生物合成方法，同时建立了大孔树脂吸附及分离抗菌活性物质的方法，该方法提取效率高，可达成100％吸附，随之，通过75％的乙醇洗脱可以实现85％-95％抗菌提取物1的分离，通过95％的乙醇洗脱可以实现95％-100％抗菌提取物2的分离。
3)本发明获得的2类抑菌活性物质，抗菌物质1为细菌素，其分子量为7351.405Da，可耐受80℃以下的高温、PH4.0的环境，并可耐受胰蛋白酶、胃蛋白酶、蛋白酶K、木瓜蛋白酶、糜蛋白酶的降解；抗菌物质2为由一个环肽结构和三种C原子数不同的脂肪链连接形成的脂肽结构。
4)本发明提供了抗菌物质1和抗菌物质2在抑制病原菌的抗菌剂、食品防腐剂和环境治理产品中的用途。具体的对单细胞核增生李斯特菌、白色念珠菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、松鼠葡萄球菌、缓慢葡萄球菌、粪肠球菌、蜡样芽胞杆菌、大肠杆菌、溶藻弧菌、副溶血性弧菌、霍乱弧菌、嗜水气单胞菌、溶血不动杆菌、阪崎肠杆菌、肺炎克雷伯氏菌、阴沟肠杆菌、立枯丝核菌、植物炭疽病菌、杂色曲霉等病原菌具有抑菌活性。
5)本发明提供了抗菌活性的为破坏细菌的细胞膜结构。
6)本发明抗菌物质2同时具有清除油污的作用。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，还可以根据这些附图获得其他的附图，而并不超出本发明要求保护的范围。
图1为贝莱斯芽孢杆菌1-3的菌落形态及菌体显微镜照片。
图2为贝莱斯芽孢杆菌1-3的系统发育树。
图3为贝莱斯芽孢杆菌1-3发酵液两类抗菌物质的分离纯化：图3A为大孔树脂纯化图谱；图3B为各洗脱组分的抑菌活性。
图4为Tricine-SDS-PAGE电泳图。
图5为G-50分子筛凝胶层析对抗菌物质1的纯化：图5A为层析图谱；图5B为Tricine-SDS-PAGE电泳图。
图6为抗菌物质1的一级质谱图。
图7为抗菌物质1酶解后的一级质谱图。
图8为抗菌物质1酶解后特征峰的二级质谱图。
图9为抗菌物质1转录组预测序列与克隆序列对比图。
图10为抗菌物质2分子筛层析图谱。
图11为抗菌物质2的一级质谱图。
图12为抗菌物质2的二级质谱图：图12A为14个碳原子的脂肪链的环状脂肽；图12B为15个碳原子的脂肪链的环状脂肽；图12C为16个碳原子的脂肪链的环状脂肽。
图13为抗菌物质2结构解析：图13A为14个碳原子的脂肪链的环状脂肽；图13B为15个碳原子的脂肪链的环状脂肽；图13C为16个碳原子的脂肪链的环状脂肽。
图14为抗菌物质1对单核增生李斯特菌的最小抑菌浓度。
图15为抗菌物质1对单核增生李斯特菌的细胞膜结构破坏的扫描电镜图：对照组为正常的单核增生李斯特菌细胞；处理组为细胞膜收到破坏的单核增生李斯特菌细胞。
图16为抗菌物质1对单核增生李斯特菌的细胞膜结构破坏的透射电镜图：对照组为正常的单核增生李斯特菌细胞；处理组为细胞膜受到破坏的单核增生李斯特菌细胞。
图17为抗菌物质1对单核增生李斯特菌的细胞膜结构破坏后核酸染料渗入细胞膜图：对照组碘化丙啶染料对正常单核增生李斯特菌细胞的染色；处理组为碘化丙啶染料对细胞膜受到抗菌物质1破坏的单核增生李斯特菌细胞的染色。
图18为抗菌物质1对单核增生李斯特菌胞内钾离子释放图。
图19为抗菌物质2对单核增生李斯特菌的最小抑菌浓度。
图20为抗菌物质2的排油实验图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
除非另外说明，本文所用的所有技术和科学术语和缩略语具有本发明领域或该术语应用领域中普通技术人员通常所理解的含义。虽然本发明实施过程中可使用类似于或等价于本文公开的任何物质或材料，但本文描述了优选的物质或材料。
本发明的术语“食品”、“保健品”、“食物产品”、“保健产品”、“保健组合物”或“食物组合物”的含义是期望被动物(包括人)摄入并向该动物提供营养或保健作用的产品或组合物。
实施例1、菌株1-3的鉴定
挑取单菌落，用接种环在LB固体培养基上进行划线，放置于37℃培养箱内倒置培养12小时，菌落形态特征呈菌落圆形、白色，表面微凸、呈微褶皱状、无光泽、不透明，边缘明显清晰，菌落周围具有较宽的透明圈，菌体呈杆状，革兰氏染色呈阳性(图1)。
从LB平板上挑取1-3单菌落于装有50μL无菌水的1.5mL EP管中，100℃煮10min，取1μL作为模板，利用细菌通用引物27F和1492R对细菌的16S rRNA基因序列进行扩增。PCR扩增体系为25μL，1μL菌液作为模板，上下游引物各1μL，2×Mix 12.5μL，ddH2O 9.5μL。PCR反应程序：95℃预变性5min；94℃变性30s；55℃退火1min和72℃延伸40s，30次循环后，72℃后延伸10min。PCR产物进行DNA测序，测序的序列如SEQ ID No.1所示，并提交至NCBI数据库进行Blast比对，并构建系统发育树，结果显示1-3同贝莱斯芽孢杆菌处于同一进化分支(图2)。
将菌株1-3进行需氧性实验、触酶实验、V-P实验、氧化酶实验、糖醇发酵试验，鉴定其理化特征。结果如表1所示。
表1：菌株1-3的生理生化特征
Figure BDA0003884842390000081
注：+表示阳性结果；-表示阴性结果；N表示结果不明显。
以上结果与文献中B.velezensis的生理生化特征描述基本一致。确定1-3号菌为B.velezensis。将菌株1-3进行菌种保藏，所述贝莱斯芽孢杆菌1-3的保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)；地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；保藏日期：2022年7月13日；贝莱斯芽孢杆菌Bacillus velezensis的保藏编号为CGMCC No.25292。
实施例2、贝莱斯芽孢杆菌1-3的发酵产生2类抗菌物质
所述贝莱斯芽孢杆菌1-3接种于TSB-YE培养基中，37℃，180rpm条件下培养12小时得到种子液。按照1％将种子液的接种量接种到含有25L发酵培养基50L发酵罐中，发酵培养基的配方为：可溶性淀粉15g/L，葡萄糖5g/L，酵母提取物20g/L，NaCl 10g/L，Mg2+浓度1.0mmol。在发酵罐中的培养条件为：初始pH 6.0，培养温度37℃，通风为1:0.5(体积比)，转速为300rpm，发酵时间24小时。
同时，在实验过程中，采用贝莱斯芽孢杆菌菌株1-3进行深层液体发酵，依次选用如下条件：初始pH 6.0-8.0，装料量40％-80％，接种量1％-15％，培养温度30-40℃，通风为1:0.4～1:1.2，转速为100-400rpm，发酵时间24-72小时。
实施例3、菌株1-3的发酵液中2类抗菌物质的分离纯化
将发酵液离心，取发酵上清液流经预处理的大孔吸附树脂，进行动态吸附；吸附后的大孔树脂分别用2-5倍体积的蒸馏水洗，再依次用2-5倍体积的浓度30％、75％和95％的乙醇进行洗脱(图3A)，分别收集75％和95％乙醇洗脱液，于40℃的条件下旋转蒸发，去除乙醇，将浓缩液经冷冻、真空干燥后，得到2类抑菌活性物质的粗提物分别在75％和95％的洗脱组分中(图3B)。
经过Tricine-SDS-PAGE电泳检测，发现90.4％的抗菌物质1存在于75％的乙醇洗脱组分中，100％的抗菌物质2存在于95％的乙醇洗脱组分中。
经过多次试验，对提取条件进行调整的情况如下，大孔吸附树脂按5～20:1(体积比)的比例进行动态吸附，流速为1BV/h，在室温条件下吸附18h至发酵液被完全吸附；吸附后的废液依次用2倍体积的蒸馏水、2倍体积的30％、75％、95％的乙醇进行梯度洗脱，控制流速为1BV/h通过75％的乙醇洗脱可以实现95％抗菌提取物1的分离，通过95％的乙醇洗脱可以实现100％抗菌提取物2的纯化。
实施例4、抗菌物质1的鉴定
抗菌物质1用G-50分子筛凝胶层析进一步分离纯化，在纯化图谱中只存在单一洗脱峰(图5A)，Tricine-SDS-PAGE电泳检测发现抗菌物质1的条带存在于该洗脱峰中(图5B)。使用微量层析柱Ziptip脱盐后，进行MALDI-TOF/TOF分析，发现在7-8kDa之间，出现明显的信号峰，分子量为7351.405Da(图6)。通过对贝莱斯芽孢杆菌1-3的转录组测定，发现其对应的基因序列如SEQ ID No.2所示，蛋白序列如SEQ ID No.3所示。经检索上述序列未发现该分子量大小的细菌素报道，是一种新的细菌素，因此将其命名为：Velezin。
进一步对抗菌物质1用胰蛋白酶酶解后，进行质谱鉴定，在分子量986.533Da处，出现特征峰(图7)。进一步对该特征峰进行二级质谱鉴定，结果如图8所示，确定为Velezin氨基酸序列中的一个片段。
进一步以贝莱斯芽孢杆菌1-3的基因组为模板，从中克隆出Velezin的基因序列，翻译为蛋白序列后与SEQ ID No.3对比发现两者相似性为100％(图9)
Velezin在形成成熟肽的过程中，Velezin氨基酸序列的N末端和C末端会通过肽键连接形成环状结构，在这一过程中会失去1个水分子，使实际分子量比形成环状结构之前小了约18Da。本实施例中，MALDI-TOF/TOF鉴定的实际分子量为7351.405Da，与形成环状结构之前计算的分子量7369.63Da相比，相差18.225Da，正好是一个水分子分子量。进一步确证本发明所分离的肽是一个环状细菌素。
实施例5、抗菌物质2的鉴定
抗菌物质2用G-50分子筛凝胶层析进一步分离纯化，得到纯化后的抗菌物质2(图10)。
使用微量层析柱Ziptip脱盐后，进行MALDI-TOF/TOF分析，发现有三个分子量极为接近的特征峰，分子量分别为1030.642Da、1044.660Da和1058.677Da，三个特征峰，分子量相差14，即一个CH2(图11)。进一步二级质谱鉴定和解析，确定三个特征峰的结构为由一个环肽结构和三种C原子数不同的脂肪链连接形成的脂肽结构(图12)。进一步分析三种C原子数不同的脂肪链含有的碳原子数分别为14、15和16个(图13)。
实施例6、抗菌物质1的抗菌活性
按照实施例3所述制备的抗菌物质1，用pH 7.0的磷酸盐缓冲液配置成10mg/mL的样品，分别检测其对单细胞核增生李斯特菌、白色念珠菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、松鼠葡萄球菌、缓慢葡萄球菌、粪肠球菌、蜡样芽胞杆菌、大肠杆菌、溶藻弧菌、副溶血性弧菌、霍乱弧菌、嗜水气单胞菌、溶血不动杆菌、阪崎肠杆菌、肺炎克雷伯氏菌、阴沟肠杆菌、立枯丝核菌、植物炭疽病菌、杂色曲霉的抑菌活性。结果如表2所示：
表2：抗菌物质1的抑菌谱
Figure BDA0003884842390000111
按照实施例3所述制备的抗菌物质1，用无菌水配置成浓度2560μg/mL的样液，用无菌水进行2倍梯度稀释，共稀释12管至样品浓度0.125μg/mL。在无菌96孔板中，加入90μL稀释后的单核增生李斯特菌培养至OD600为0.4并用培养基稀释1000倍的菌液，之后分别加入10μL的各样品稀释液，每个稀释度做2个平行。之后将96孔板密封，37℃，50rpm摇培12h，在OD600下的吸光值，在第8孔和第9孔之间出现明显变化，因此将Velezin样品对单核增生李斯特菌的MIC值确定为第8孔对应的样品浓度，即为2μg/mL为1×MIC(图14)。
通过SEM观察用抗菌物质1处理单核增生李斯特菌后菌体形态变化，结果显示，菌体整体结构散乱，菌体表面出现了明显的缩水、皱褶，甚至裂解现象，而未处理的单核增生李斯特菌菌体排列整齐、均一，菌体表面结构完整、光滑(图15)。透射电镜可以为菌体表面结构的观察提供更大的视野。经抗菌物质1处理的单核增生李斯特菌在TEM下观察结果如图16所示，未处理的菌体相比细胞致密、边界清晰，而处理后的细胞，出现边界模糊、孔洞、甚至破裂现象。经上述结果表明，抗菌物质1处理后，直接导致了目标菌株单核增生李斯特菌的细胞表面膜结构的变化，改变了细胞形态。
碘化丙啶(PI)是一种核酸染料，但其无法通过完整的细菌细胞膜。当细菌细胞膜受损时，PI可以穿过细胞膜，将胞内的核酸染色，在荧光显微镜下表现为红色。用抗菌物质1处理单核增生李斯特菌后，用10μg/mL的PI染色，之后用荧光显微镜观察，用绿光进行激发，激发波长为535nm，发射波长为615nm。发现经抗菌物质1处理单核增生李斯特菌表现为红色，而未经抗菌物质1处理单核增生李斯特菌则未出现红色(图17)。
同对照组相比，1×MIC、2×MIC、4×MIC的抗菌物质1样品处理单核增生李斯特菌，5min内即检测出了K+外流，其中4×MIC处理组的外流量最高，达到了2.59mg/L。随着处理时间的延长，K+的外流逐渐增加，至60min，1×MIC、2×MIC和4×MIC处理组的K+外流浓度分别达到了2.86、3.10和3.73mg/L，而对照组的K+浓度则无明显变化(图18)。
实施例6、抗菌物质2的抗菌活性
按照实施例5所述制备的抗菌物质2，用pH 7.0的磷酸盐缓冲液配置成10mg/mL的样品，分别检测其对单细胞核增生李斯特菌、白色念珠菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、松鼠葡萄球菌、缓慢葡萄球菌、粪肠球菌、蜡样芽胞杆菌、大肠杆菌、溶藻弧菌、副溶血性弧菌、霍乱弧菌、嗜水气单胞菌、溶血不动杆菌、阪崎肠杆菌、肺炎克雷伯氏菌、阴沟肠杆菌、立枯丝核菌、植物炭疽病菌、杂色曲霉的抑菌活性。结果如表3所示：
表3：抗菌物质2的抑菌谱
Figure BDA0003884842390000121
Figure BDA0003884842390000131
按照实施例3所述制备的抗菌物质2，用无菌水配置成浓度2560μg/mL的样液，用无菌水进行2倍梯度稀释，共稀释12管至样品浓度0.125μg/mL。在无菌96孔板中，加入90μL稀释后的单核增生李斯特菌培养至OD600为0.4并用培养基稀释1000倍的菌液，之后分别加入10μL的各样品稀释液，每个稀释度做2个平行。之后将96孔板密封，37℃，50rpm摇培12h，在OD600下的吸光值，在第8孔和第9孔之间出现明显变化，因此将抗菌物质2样品对单核增生李斯特菌的MIC值确定为第8孔对应的样品浓度，即为2μg/mL为1×MIC(图19)。
实施例7、抗菌物质2的排油活性
按照实施例3所述制备的抗菌物质2，用pH 7.0的磷酸盐缓冲液配置成浓度2.56、1.28、0.64、0.32和0.16mg/mL的样品，进行排油活性检测。加入10μL粗品样品脂肽样品后，2.56至0.16mg/mL的样品水面的油膜迅速挤向四周，可形成4.8-1.5cm的排油圈(图20)。
抗菌物质2可以有效的去除油渍，可以广泛地应用于各个领域，包括不限于石油采油、页岩采油、洗涤、环境改良、土壤清除污渍方面的用途。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。

Claims (19)

1.一株同时产生2类抗菌物质的贝莱斯芽孢杆菌菌株1-3，其特征在于：其分类命名为贝莱斯芽孢杆菌Bacillus velezensis，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.25292。
2.根据权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌菌株1-3，其特征在于：所述贝莱斯芽孢杆菌菌株1-3菌落为圆形、白色，表面微凸、呈微褶皱状、无光泽、不透明，边缘明显清晰，菌落周围具有较宽的透明圈，菌体呈杆状，芽孢中生。
3.根据权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌菌株1-3，其特征在于：所述贝莱斯芽孢杆菌菌株1-3的16S rRNA序列如SEQ ID No.1所示。
4.权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌菌株1-3同时生物合成2类具有抑菌活性物质的方法，其特征在于：所述方法包括如下步骤：
(1)取贝莱斯芽孢杆菌1-3接种于TSB-YE培养基中培养；
(2)取贝莱斯芽孢杆菌1-3进行深层液体发酵；
(3)分离纯化：
A.将(2)获得的发酵液离心，取发酵上清液经大孔树脂吸附；
B.吸附后的大孔树脂用2-5倍体积的蒸馏水洗，再依次用2-5倍体积的30％、75％、95％浓度的乙醇洗脱，收集洗脱液；
C.将洗脱液于40-42℃的条件下旋转浓缩，经冷冻、真空干燥后得到粗提物；
D.对粗提物以75％的乙醇洗脱、并通过G-50分子筛凝胶层析纯化获得抗菌物质1；以95％的乙醇洗脱、并通过G-50分子筛凝胶层析纯化获得抗菌物质2。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述方法中贝莱斯芽孢杆菌菌株1-3进行深层液体发酵时，条件如下：初始pH 6.0-8.0，装料量40％-80％，接种量1％-15％，培养温度30-40℃，通风体积比为1:0.4～1:1.2，转速为100-400rpm，发酵时间24-72小时。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述步骤(2)分离纯化时发酵上清液与大孔树脂体积比为5-20:1。
7.权利要求4所述的方法产生的抗菌物质1，其特征在于，所述抗菌物质1为细菌素，其蛋白质序列如SEQ ID No.2所示。
8.根据权利要求7所述的抗菌物质1，其特征在于，所述抗菌物质1的N端和C端通过肽键相连，形成环状结构。
9.根据权利要求7所述的抗菌物质1，其特征在于，所述的抗菌物质1的分子量为7351.405Da。
10.权利要求4所述的方法产生的抗菌物质2，其特征在于，所述抗菌物质2为环状脂肽，所述环状脂肽的结构由环肽和脂肪链两部分构成。
11.根据权利要求10所述的抗菌物质2，其特征在于，所述环肽的序列特征为：N端-LLVDLLE-C端，所述环肽的N端和C端通过肽键相连，形成了环状结构。
12.根据权利要求10所述的抗菌物质2，其特征在于，所述环肽分别与14、15和16个碳原子构成的脂肪链连接，形成三种分子量不同的环状脂肽，分子量分别为1030.64Da、1044.66Da和1058.67Da。
13.权利要求7所述的抗菌物质1和/或权利要求10所述的抗菌物质2在制备抑制病原菌的药品、食品防腐剂和环境治理产品中的用途。
14.根据权利要求13所述的用途，其特征在于，所述病原菌包括单细胞核增生李斯特菌、白色念珠菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、松鼠葡萄球菌、缓慢葡萄球菌、粪肠球菌、蜡样芽胞杆菌、大肠杆菌、溶藻弧菌、副溶血性弧菌、霍乱弧菌、嗜水气单胞菌、溶血不动杆菌、阪崎肠杆菌、肺炎克雷伯氏菌、阴沟肠杆菌、立枯丝核菌、植物炭疽病菌、杂色曲霉。
15.根据权利要求14所述的用途，其特征在于，所述抗菌物质通过破坏细胞膜结构导致胞内物质外流发挥抑菌作用；优选的，所述抗菌物质导致细胞内K+外流，破坏胞内外渗透压。
16.根据权利要求15所述的用途，其特征在于，所述抗菌物质1对单核增生李斯特菌增殖的最小抑菌浓度为2μg/mL。
17.权利要求10所述的抗菌物质2作为清除油渍的表面活性剂的用途。
18.根据权利要求17所述的用途，其特征在于，所述抗菌物质2作为表面活性剂在石油采油、页岩采油、洗涤、环境改良、土壤清除油渍上的用途。
19.根据权利要求18所述的用途，其特征在于，抗菌物质2的浓度不低于0.16mg/mL。
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