CN110577910B - 一种侧孢短芽孢杆菌、抗菌脂肽及其在农业与食品上的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种侧孢短芽孢杆菌、抗菌脂肽及其在农业与食品上的应用，属于生物技术领域。其中侧孢短芽孢杆菌从南京农田分离得到；该侧孢短芽孢杆菌在LB液体培养基中进行培养，可以发酵产生抗菌脂肽，其中所产生的抗菌脂肽为由两种氨基酸序列构成一级结构的两种抗菌脂肽，抗菌脂肽通过三次分离纯化以及鉴定得到。经过测定，该抗菌脂肽具有较广的抑菌谱以及较好的热稳定性和pH稳定性，可以广泛应用于食品及农业领域中。

Description

一种侧孢短芽孢杆菌、抗菌脂肽及其在农业与食品上的应用

技术领域

本发明涉及一种侧孢短芽孢杆菌、抗菌脂肽及其在农业与食品上的应用，属于生物技术领域。

背景技术

在食品工业中，有关食品的防腐保鲜始终是一个亟待解决的重要问题。据FDA统计，全世界每年约有10％-20％的食品损失于各种腐败变质，在食品腐败变质的过程中，微生物起着决定性的作用。针对微生物引起的食品腐败变质问题，我们采取不同的处理手段控制食品中的微生物。但是常用的高温灭菌法会对食品的质地、风味和营养产生不良影响，而添加化学防腐剂的方法对人体健康有影响。天然食品防腐剂因其使用方便有效，同时能很好地保存食品的商品价值，目前仍然是食品防腐的重要措施之一。

目前我国食品添加剂标准(GB2760)允许使用的32种防腐剂中以化学防腐剂为主，天然防腐剂仅乳链菌肽(Nisin)和纳他霉素(Natamycin)两种。化学防腐剂通常成本较低、化学性能稳定以及抑菌谱较广、防腐效果好，但目前研究已表明，化学防腐剂对人体不同程度存在一定的毒性，其中一些具有诱癌性和致畸性，在超标使用的情况下易引起食物中毒。随着人民生活水平的提高和食品安全意识的增强，人们对食品的安全卫生和自身健康状况日益关注，不含化学防腐剂的天然食品和绿色食品更容易被消费者认可和接受。因此，研究开发高效安全无毒的天然防腐剂已成为当今国际食品添加剂发展的主要方向。

侧孢短芽孢杆菌及其发酵产物研究已有百余年，不仅在农业上具有广泛应用，而且还应用于保健方面。在农业上，侧孢短芽孢杆菌对许多植物植病真菌具有很好的抑制效果。同时侧孢短芽孢杆菌对无脊椎动物也有毒杀作用，是一种防病防虫多功能的微生物菌剂。在侧孢短芽孢杆菌应用的一百年中，没有报道表明它对人或哺乳动物有危害。1989年，侧孢短芽孢杆菌Brevibacillus laterosporus BOD申请专利，并被当做益生菌应用到商业中。某些侧孢短芽孢杆菌菌株在代谢过程中会合成一些小分子脂肽，部分脂肽能抑制病原微生物、腐败细菌的生长繁殖，具有食品保鲜应用前景。目前，国内外研究最透彻的天然多肽是乳酸链球菌素——Nisin，已经在许多国家和地区得到商业化的应用。我国也在1992年将Nisin列入1992年10月1日实施的国标GB2660-86中的增补品种，可用于罐头食品、植物蛋白饮料、乳制品和肉制品的保藏中。但是，Nisin主要应用于果汁、啤酒、红酒等低pH食品中，在碱性环境下活性损失严重，只对革兰氏阳性菌有作用，对革兰氏阴性菌、酵母、霉菌、病毒无抑制作用。因此筛选高效广谱、活性稳定的天然多肽成为近年来全世界范围内科学家的一个热点研究方向。

虽然国内外对不同来源的微生物天然防腐剂如乳酸菌细菌素、抗菌脂肽研究较多，但是在食品工业中实际应用很少，这主要是因为其中一些天然防腐剂抑菌谱窄，抑菌效果不够理想，抗菌性能不稳定，尤其是价格偏高、产率低且安全性未能得以确定，目前还很难取代化学防腐剂的作用和地位。因此，开发出广谱、高效、稳定、安全、产率高、低成本的天然食品防腐剂和生物农药具有潜在应用价值和巨大的市场需求。

发明内容

本发明的目的在于为了克服以上现有技术的不足而提供一种侧孢短芽孢杆菌、其抗菌脂肽和分离方法以及在农业食品上的应用。

本发明是由以下技术手段实现的：

一种侧孢短芽孢杆菌(Brevibacillus laterosporus),其特征在于，该侧孢短芽孢杆菌(Brevibacillus laterosporus)fmb70在LB固体培养基上呈黄褐色小点，产芽孢，且芽孢位于菌体一侧。革兰氏阳性菌，短杆状，无鞭毛。不能利用葡萄糖，其保藏号为：CGMCC18426。

由所述的侧孢短芽孢杆菌发酵得到的抗菌脂肽，抗菌脂肽1的其化学结构为：FA-Dhb-L-Orn-I-V-V-K-V-V-K-Y-L-Valinol，式中FA：脂肪酸链；Dhb:2-氨基丁烯酸；L：亮氨酸；Orn:鸟氨酸；Valinol:缬氨醇；I：异亮氨酸；V：缬氨酸；K:赖氨酸；Y：酪氨酸。

抗菌脂肽2的其化学结构为：FA-Dhb-L-Orn-I-I-V-K-V-V-K-Y-L-Valinol，式中FA：脂肪酸链；Dhb:2-氨基丁烯酸；L：亮氨酸；Orn:鸟氨酸；Valinol:缬氨醇；I：异亮氨酸；V：缬氨酸；K:赖氨酸；Y：酪氨酸。

所述的抗菌脂肽的制备方法，其特征在于，由侧孢短芽孢杆菌Brevibacilluslaterosporus fmb70通过下述方法培养发酵得到：

(1)侧孢短芽孢杆菌Brevibacillus laterosporus fmb70种子液制备：将保藏的菌种，接种于LB液体培养基中，37℃，180rpm培养12-16h；

(2)侧孢短芽孢杆菌Brevibacillus laterosporus fmb70发酵：将活化的种子液，按体积百分比为2％接种于LB液体培养基，在LB液体培养基静置培养24h后，5000rpm离心即得含抗菌脂肽的发酵液，此发酵液表现出广谱抗菌活性，对革兰阳性菌，革兰阴性菌和真菌都有抑制效果。

以上所述的抗菌脂肽的制备方法，其中所述的LB液体培养基配方为胰蛋白胨10g，酵母提取液5g，氯化钠10g，蒸馏水1L，pH6.8。

一种以上所述的抗菌脂肽的分离纯化方法，采用以下步骤进行：

(1)正丁醇萃取：先将侧孢短芽孢杆菌LB发酵后的发酵液离心取上清，发酵上清液和正丁醇按照1:1比例进行加入到分液漏斗中混合均匀，静置30分钟后，取上层液体。上层正丁醇溶液用真空旋蒸仪蒸干，沉淀用甲醇溶解；

(2)Sephadex LH-20第二次纯化,以金黄色葡萄球菌为指示菌，得到测定抑菌圈大于15mm的分离液；

(3)半制备液相第三次纯化，得到保留时间为22.8min和25.4min的两个活性峰；

(4)抗菌脂肽结构序列用基质辅助激光解吸-飞行时间质谱仪鉴定。

以上所述抗菌脂肽，可以在食品防腐、抗菌性药物和农业食品中应用。

有益效果

本发明从南京郊区的农田土样中分离筛选出一株具有广谱抑菌作用的侧孢短芽孢杆菌Brevibacillus laterosporus fmb70(CGMCC No.18426)。再从侧孢短芽孢杆菌fmb70纯化出两种具有广谱抗菌作用的抗菌脂肽1和抗菌脂肽2，主要优点和积极效果有：

(1)来源安全，侧孢短芽孢杆菌在使用的一百年中，未出现过人、畜毒害作用，可作为益生菌的菌株。故从安全上看，侧孢短芽孢杆菌的发酵产物(两种抗菌脂肽，抗菌脂肽1和抗菌脂肽2)也是十分安全的。

(2)Brevibacillus laterosporus fmb70对大部分病原菌、腐败菌具有拮抗作用，本身又产生有广谱抗菌作用的抗菌脂肽，故可作为工业食品发酵的出发菌，而且可以减少甚至杜绝其所发酵食品其他防腐剂的使用，延长发酵食品的货架期。

(3)Brevibacillus laterosporus fmb70产生的广谱抗菌作用的抗菌脂肽1，抗菌谱广，能抑制革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌和真菌能作为食品天然防腐剂添加到食品中，延长食品的货架期。

(4)抗菌脂肽1性质较为稳定，pH、温度对其活性影响不大，在pH 5-9的范围内以及温度100℃以下，其活性基本可以完全保留，更有利于食品中的应用。

(5)抗菌脂肽1对植物植病真菌具有很好的抑制杀死效果，且对植物和环境没有危害作用，在农业上可以防治真菌性病害。

附图说明

图1：A侧孢短芽孢杆菌革兰氏染色；B侧孢短芽孢杆菌芽孢染色

图2：侧孢短芽孢杆菌16S rRNA电泳图

图3：Brevibacillus laterosporus fmb70系统发育树

图4：Sephadex LH-20第二次纯化后活性洗脱曲线

图5：抗菌脂肽1和抗菌脂肽2的半制备液相色谱图

图6：抗菌脂肽1的HPLC图

图7：抗菌脂肽2的HPLC图

图8：抗菌脂肽1的MALDI-TOF-MS

图9：MALDI-TOF-MS/MS二级质谱图；A为抗菌脂肽1；B为抗菌脂肽2；C为brevibacillin

图10：抗菌脂肽1和抗菌脂肽2的氨基酸序列及化学结构

(FA：脂肪酸链；Dhb:2-氨基丁烯酸；L：亮氨酸；Orn:鸟氨酸；Valinol:缬氨醇；I：异亮氨酸；V：缬氨酸；K:赖氨酸；Y：酪氨酸)

图11：抗菌脂肽1的MALDI-TOF-MS

图12：抗菌脂肽1和抗菌脂肽2在牛奶中的应用；A、B为25℃储藏；C、D为4℃储藏。(■)为阴性对照；(●,▲)为16μg/mL和64μg/mL的抗菌脂肽1；(▼,◆)为16μg/mL和64μg/mL的抗菌脂肽2

生物保藏

侧孢短芽孢杆菌fmb70，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；保藏日期：2019年9月5日；保藏编号CGMCC No.18426；分类命名：侧孢短芽孢杆菌(Brevibacilluslaterosporus)。

具体实施方式

本发明从南京市郊区的农田土样中分离筛选出一株具有广谱抑菌作用的侧孢短芽孢杆菌Brevibacillus laterosporus fmb70。主要生物学特征：LB培养基上呈现黄褐色小点，产芽孢革兰氏阳性菌，芽孢位于菌体一侧，短杆状，无鞭毛。在特定培养基中发酵培养可以产生具有广谱抗菌活性的抗菌脂肽。

Brevibacillus laterosporus fmb70可以采用LB培养基，37℃，180rpm转速进行摇床培养。

以下实施例中所述的LB培养基采用如下配方：

LB液体培养基配方：胰蛋白胨10g，酵母提取液5g，氯化钠10g，蒸馏水1L，pH6.8。

实施例1

1、侧孢短芽孢杆菌筛选及鉴定

(1)侧孢短芽孢杆菌筛：土样悬浮后80℃水浴10分钟，十倍梯度稀释得到10^-2，10^-3，10^-4三个浓度，取上述三种浓度各0.1mL，涂布LB平板，37℃下培养24小时，挑取菌落形态不同的单菌落，接种到LB液体培养基中30℃，180rpm培养24小时。取发酵上清选取大肠杆菌和金黄色葡萄球菌进行抑菌实验。具有抑菌效果的菌株进行下一步确认。

(2)侧孢短芽孢杆菌鉴定：形态学鉴定和16S rRNA序列比对。

形态学鉴定包括革兰氏染色和芽孢染色，对筛选出来的具有抑菌活性的菌株进行形态学鉴定。革兰氏染色按照革兰氏染色步骤进行，芽孢染色用孔雀绿染色芽孢，用沙黄染液复染菌体，光学显微镜下观察。

16S rRNA序列比对：选取引物：F27 5′-agagtttgatcatggctcag-3′和R1492 5′-tacggttaccttgttacgactt-3′，用PCR扩增16S rRNA片段，琼脂糖凝胶电泳验证后，送往测序公司(生工，南京)测序，测序结果在NCBI的GenBank Datebases比对。

革兰氏染色结果表明侧孢短芽孢杆菌为革兰氏阳性菌(图1A)，芽孢染色结果表明芽孢位于菌体一侧(图1B)。16S rRNA结果：PCR扩增出序列(图2)经过验证后测序，得到1405bp的碱基对，在NCBI的GenBank Datebases中进行比对，与侧孢短芽孢杆菌相似度达到99％，绘制进化树(图3)结合侧孢短芽孢杆菌的形态学结果，确定此菌株为侧孢短芽孢杆菌。

2、抗菌脂肽1和抗菌脂肽2分离纯化及鉴定

(1)抗菌脂肽的萃取

含有抗菌脂肽的上清液与正丁醇体积1:1的比例加入到分液漏斗中，摇晃均匀后，静置分层，将下层液体去掉，收集上层液体。上层含有抗菌脂肽的正丁醇溶液用抽真空旋蒸仪旋干，用甲醇复溶沉淀。

(2)Sephadex LH-20第二次纯化

甲醇复溶液，用吸管吸取1mL样品，打开装好Sephadex LH-20柱材料的层析柱下面的阀门，待柱子里面的液面凹面与LH-20柱材料相切时，缓慢滴入样品，待样品液液面凹面与LH-20柱材料相切时，再加入80％甲醇水溶液1mL，待这1mL甲醇水溶液的液面凹面与LH-20柱材料相切时，再加入2mL甲醇水溶液，打开恒流泵，调节好流速(1.8mL/10min)，利用自动收集器收集馏分。馏分收集后，以金黄色葡萄球菌为指示菌，检测其抑菌活性。

Sephadex LH-20第二次纯化后，得到测定抑菌圈大于15mm的分离液收集起来(图4)，浓缩3倍用于后续分析。

(3)半制备液相色谱第三次纯化

1)Sephadex LH-20得到的浓缩液用半制备液相色谱进行进一步分离纯化。纯化条件：C18柱，A:水+0.1％TFA，B：乙腈+0.1％TFA，Time：30min，A:70％-30％，B:30％-70％，波长：210nm，流速4mL/min。得到色谱图(见图5)。用10ml离心管收集洗脱液。检测每管的抑菌活性。得到保留时间为22.8min和25.4min的两个活性峰。

2)抗菌脂肽1和抗菌脂肽2的纯度进行检测：从制备液相中收集的活性组分抗菌脂肽1和抗菌脂肽2，浓缩后用高效液相色谱HPLC进行检测，洗脱条件和半制备液相色谱基本一致，时间由30min缩短到23分钟。抗菌脂肽1和抗菌脂肽2使用归一化法发计算，纯度都高于90％(图6，7)。

(4)抗菌脂肽1的分子量及氨基酸序列确定

1)利用MALDI-TOF-MS得出其分子量，结果显示分子量为1570.17D(图8)。

2)抗菌脂肽1氨基酸序列确定：抗菌脂肽1的MALDI-TOF-MS/MS结果和已报道文献中的碎片结果进行比对(图9)，确定抗菌脂肽1的氨基酸序列(图10A)，确定抗菌脂肽1为一种全新的抗菌脂肽。

(5)抗菌脂肽2的分子量及氨基酸序列确定

1)利用MALDI-TOF-MS得出其分子量，结果显示分子量为1583.749D(图11)。

2)抗菌脂肽2氨基酸序列确定：抗菌脂肽2的MALDI-TOF-MS/MS结果和已报道文献中的碎片结果进行比对(图9)，确定抗菌脂肽2的氨基酸序列(图10B)。

3、抗菌脂肽1和抗菌脂肽2的抑菌活性和稳定性

(1)纯化得到的抗菌脂肽1及抗菌脂肽2，分别以下表1所述的菌为指示菌，测试抗菌脂肽1及抗菌脂肽2的抑菌活性。结果表明：抗菌脂肽1和抗菌脂肽2对3种革兰阳性菌、5种革兰阴性菌和四种霉菌均有抑制效果，其中抗菌脂肽1的抑制效果同抗菌脂肽1的抑制效果相似。

表1抗菌脂肽1及抗菌脂肽2的抑菌谱

(2)抗菌脂肽1和抗菌脂肽2的热稳定性及pH稳定性

纯化出来的抗菌脂肽1和抗菌脂肽2，按下表2所示温度及时间处理水浴出来后，以金黄色葡萄球菌为指示菌，检测其残留活性，对于pH处理方法为：各取少量抗菌脂肽1和抗菌脂肽2溶液，以HCL或者NaOH调节到对应pH，25℃保温20h后再调回原始pH＝7测试其抑菌活性。

表2抗菌脂肽1和抗菌脂肽2的热稳定性及pH稳定性

从上表可以看出，抗菌脂肽1和抗菌脂肽2的热耐受性较好，100℃以下，活性没有损失。pH耐受性上，抗菌脂肽1在pH 5-pH 9，其活性基本保留，但是pH 3时，其活性损失50％左右。抗菌脂肽2在pH 5-pH 7，其活性基本保留，但是pH 3和9时，其活性损失50％左右。从热耐受性及pH耐受性看，抗菌脂肽1和抗菌脂肽2可应用于部分食品防腐。

4、抗菌脂肽1和抗菌脂肽2在脱脂奶中的应用

模拟抗菌脂肽1和抗菌脂肽2在感染致病菌的脱脂牛奶中的应用效果。采用牛奶中最常见的致病菌金黄色葡萄球菌(S.aureus GIM 1.142)和单增李斯特菌(L.monocytogenes ATCC 21633)对牛奶进行人工污染。随后分别将抗菌脂肽1和抗菌脂肽2以低浓度组(μg/ml)和高浓度组(μg/ml)加入到致病菌侵染的脱脂奶中，对照组加入等量无菌水。对照组、低浓度组和高浓度组分别置于4℃和25℃贮藏，分别测量活菌数来评估抗菌脂肽1和抗菌脂肽2的抑制效果，结果如图9所示，(■)为阴性对照；(●,▲)为16μg/mL和64μg/mL的抗菌脂肽1；(▼,◆)为16μg/mL和64μg/mL的抗菌脂肽2。图12A、12B为25℃储藏，12C、2D为4℃贮藏。

在25℃时，金黄色葡萄球菌和单增李斯特菌的对照组均在1天内快速生长至10⁸CFU/mL。低浓度时(16μg/mL)，抗菌脂肽1能100％抑制单增李斯特菌的生长，对金黄色葡萄球菌的抑制率达到90％。抗菌脂肽2能100％抑制单增李斯特菌的生长，并能在三天内完全杀死金黄色葡萄球菌。当处于高浓度时(64μg/mL)，抗菌脂肽1和抗菌脂肽2均能在三天之内完全杀死单增李斯特菌和金黄色葡萄球菌。低浓度处理组和高浓度处理组菌显示出对金黄色葡萄球菌和单增李斯特菌有效的抑制和杀死作用。

4℃储藏时，对照组没有明显的生长趋势。低浓度(16μg/mL)的抗菌脂肽1和抗菌脂肽2和高浓度(64μg/mL)抗菌脂肽2均可100％抑制致病菌生长，高浓度(64μg/mL)的抗菌脂肽1能在九天内100％杀死金黄色葡萄球菌和单增李斯特菌。

结果表明抗菌脂肽1和抗菌脂肽2在低浓度16μg/mL时，能有效抑制金黄色葡萄球菌和单增李斯特菌的生长，在高浓度64μg/mL时，能有效杀死两种食源性致病菌。

5、侧孢短芽孢杆菌以及抗菌脂肽1和抗菌脂肽2在农业上的应用

(1)研究抗菌脂肽1和抗菌脂肽2对潍坊地区大姜茎基腐病致病菌群结腐霉的抑制作用。用菌丝抑制率来表示抗菌脂肽1和抗菌脂肽2对群结腐霉的抑制效果。培养基选用CMA培养基(玉米粉100g、16g琼脂，溶于1L水)，分别将抗菌脂肽1和抗菌脂肽2加入CMA培养基中，倒平板，在平板中间用打孔器打一个直径6mm的孔，接入群结腐霉，观察抑制情况。

表4抗菌脂肽1和抗菌脂肽2对群结腐霉抑制率

处理	浓度μg/mL	菌丝直径(mm)	抑制率(％)
				对照		83.5	0.0
恶霉灵	50	57±2.65	31.7
				抗菌脂肽1	50	20.6±0.8	75.3
抗菌脂肽2	50	16.5±0.87	80.2

结果表明抗菌脂肽1和抗菌脂肽2对大姜茎基腐病致病菌具有很好的抑制效果，相同浓度下比农业上常用的恶霉灵效果高出2倍以上。表明抗菌脂肽1和抗菌脂肽2能有效的在农业上进行应用。

从以上所述的内容可以看出，本发明提供的侧孢短芽孢杆菌，其发酵产生的抗菌脂肽具有很好的抑菌效果，同时天然、安全，完全可以经过加工成为食品添加剂或抗菌性药物制剂应用于食品或医药领域中。同时本发明提供的侧孢短芽孢杆菌以及其产生的抗菌脂肽能有效地抑制农业上的植物致病菌。序列表：

抗菌脂肽1：FA-Dhb-L-Orn-I-V-V-K-V-V-K-Y-L-Valinol(FA：脂肪酸链；Dhb:2-氨基丁烯酸；L：亮氨酸；Orn:鸟氨酸；Valinol:缬氨醇；I：异亮氨酸；V：缬氨酸；K:赖氨酸；Y：酪氨酸)

抗菌脂肽2：FA-Dhb-L-Orn-I-I-V-K-V-V-K-Y-L-Valinol(FA：脂肪酸链；Dhb:2-氨基丁烯酸；L：亮氨酸；Orn:鸟氨酸；Valinol:缬氨醇；I：异亮氨酸；V：缬氨酸；K:赖氨酸；Y：酪氨酸)。

序列表

<110> 南京农业大学，南京福斯弗瑞生物科技有限公司

<120> 一种侧孢短芽孢杆菌、抗菌脂肽及其在农业与食品上的应用

<141> 2019-09-17

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 9

<212> PRT

<213> 侧孢短芽孢杆菌(Brevibacillus laterosporus)

<400> 1

Ile Val Val Lys Val Val Lys Tyr Leu

1 5

<210> 2

<211> 9

<212> PRT

<213> 侧孢短芽孢杆菌(Brevibacillus laterosporus)

<400> 2

Ile Ile Val Lys Val Val Lys Tyr Leu

1 5

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 侧孢短芽孢杆菌(Brevibacillus laterosporus)

<400> 3

agagtttgat catggctcag 20

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 侧孢短芽孢杆菌(Brevibacillus laterosporus)

<400> 4

tacggttacc ttgttacgac tt 22

Claims (5)

1.一种由侧孢短芽孢杆菌（Brevibacillus laterosporus）发酵得到的抗菌脂肽，其特征在于,其化学结构为：FA-Dhb-L-Orn-I-V-V-K-V-V-K-Y-L-Valinol，式中FA：脂肪酸链;Dhb: 2-氨基丁烯酸; L：亮氨酸；Orn:鸟氨酸；Valinol:缬氨醇；I：异亮氨酸；V：缬氨酸；K:赖氨酸；Y：酪氨酸。

2.权利要求1所述的抗菌脂肽的分离纯化方法，其特征在于，先将保藏号为CGMCCNO.18426的侧孢短芽孢杆菌（Brevibacillus laterosporus）fmb70用LB液体培养基培养发酵，LB液体培养基配方:胰蛋白胨 10 g，酵母提取液 5 g，氯化钠 10 g，蒸馏水 1 L，pH6.8，然后采用以下步骤进行：

（1）正丁醇萃取：先将侧孢短芽孢杆菌发酵后的发酵液离心取上清，发酵上清液和正丁醇按照1:1比例加入到分液漏斗中混合均匀，静置30分钟后，取上层液体， 上层正丁醇溶液用真空旋蒸仪蒸干，沉淀用甲醇溶解；

（2）Sephadex LH-20第二次纯化,以金黄色葡萄球菌为指示菌，得到测定抑菌圈大于15mm的分离液；

（3）半制备液相第三次纯化，得到保留时间为22.8min和25.4min的两个活性峰，所述抗菌脂肽的活性峰为22.8min；

（4）抗菌脂肽结构序列用基质辅助激光解吸-飞行时间质谱仪进行鉴定。

3.权利要求1所述的抗菌脂肽在食品防腐中的应用。

4.权利要求1所述的抗菌脂肽在制备抗菌性药物中的应用。

5.权利要求1所述的抗菌脂肽在农业上防治大姜茎基腐病中的应用。

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