CN113480621B

CN113480621B - 抗菌蛋白ppia-l20及其在生物防治中的应用

Info

Publication number: CN113480621B
Application number: CN202110722619.3A
Authority: CN
Inventors: 张克云; 窦振国; 王浩; 李�瑞; 赵鸿阳
Original assignee: Nanjing Agricultural University
Current assignee: Nanjing Agricultural University
Priority date: 2021-06-28
Filing date: 2021-06-28
Publication date: 2023-08-11
Anticipated expiration: 2041-06-28
Also published as: CN113480621A

Abstract

本发明公开了抗菌蛋白PPIA‑L20及其在生物防治中的应用。本发明还公开了抗菌蛋白PPIA‑L20从伯氏致病杆菌NN6菌株胞外粗蛋白中的纯化方法。本发明还公开了经质谱鉴定后的抗菌蛋白为peptidyloprolyl isomerase A，并给出氨基酸序列信息。本发明还公开了抗菌蛋白PPIA‑L20对尖孢镰刀菌西瓜专化型菌丝和孢子显微和超微结构的影响。该NN6菌株胞外粗蛋白具有热稳定性，持效期长和来源环保无毒性等特点，对于保护生态环境和提高农产品的附加值上具有重要意义，且抗菌蛋白PPIA‑L20具有良好的抗菌性，使其具有很好的市场开发应用前景。

Description

抗菌蛋白PPIA-L20及其在生物防治中的应用

技术领域

本发明涉及高毒力昆虫病原线虫共生菌伯氏致病杆菌NN6菌株胞外抗菌蛋白和抗菌蛋白PPIA-L20在生物防治中的应用，属于生物农药领域。

背景技术

西瓜枯萎病是由西瓜专化型尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum f.sp.niveum)侵染导致的土传性病害，该病又被成为死秧病，这种危害发生在瓜苗发育的各个阶段，在全世界范围内广泛存在。西瓜枯萎病对我国西瓜产业已经造成了严重危害，尤其是在长江中下游等西瓜产地经常发生，发病田地平均减产20-40％，严重的甚至绝收。相较于其他真菌和细菌性病害，西瓜枯萎病一旦发病将无法遏制，因对其致病机制的研究不全，导致防治的方法比较单一。

小麦赤霉病是由多种镰刀菌引起的严重危害小麦健康的植物性病害，其中禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)是我国麦类主要的致病菌种。发病正常的年份会造成20％～30％的小麦减产，严重时减产超过60％。它以子囊壳在病残体上营腐生越冬，然而中国长江中下游平原的气候湿润多雨，极利于子囊孢子的传播，故导致小麦赤霉病在长江中下游地区常年盛行且难以防治。

黄瓜枯萎病是由尖孢镰刀菌黄瓜专化型(Fusarium oxysporumf.sp.cucumebrium Owen)引起的，与西瓜枯萎病菌一样，是土传性病害，从黄瓜根或根颈部侵入致使植株枯萎。在我国广泛分布，是黄瓜生产中较难防治且危害严重的一种病害，同一地块连作3年时发病率可高达70％，产量损失10％-50％。

据报道，木贼镰刀菌(Fusarium equiseti)生态适应性极强、分布广、寄主种类多，可寄生在橡胶幼树中，使其根基部先出现淡褐色病斑，而后变黑，树梢发黄，叶片脱落，最终枯萎死亡。以菌丝体或厚垣孢子在土壤、栽培基质中越冬，可营腐生生活，其分生孢子借气流、雨水、进行传播。

灰霉菌(Botryis cinerea)，又称灰葡萄孢菌，能够引起多种植物幼苗和果实猝倒、落叶、花腐和烂果，如辣椒、黄瓜、茄子等。连续阴雨天气多的年份危害严重，因其在潮湿环境中，病变表层可产生大量的灰色霉层(分生孢子梗和分生孢子)，所以日常生活中的果蔬放一段时间会长毛，多数就可能是受到了灰霉菌的侵染。番茄是江苏地区重要的蔬菜作物，而江苏又地处中国的长江中下游平原，每年夏季会有长时间的阴雨天气，所以番茄灰霉病的防治是重要的科学课题。

水稻是稻属谷类作物，原产于中国和印度，现如今世界上近一半人口以大米为主食。一旦大规模爆发病害，势必将带来巨大的经济损失和供粮压力。稻瘟病又名稻热病、叩头瘟等，是由稻瘟病菌(Magnaporthe grisea)引起的，可发生在水稻各个部位以及在整个发育期内的一种病害。广泛分布为世界稻区，是稻作生产中的主要病害，其中以亚洲、非洲稻区发病为重，严重时可减产40-50％，局部会出现颗粒无收的现象。病菌主要在病稻稻草上越冬，来年天气转暖，又有雨淋的情况下，越冬病菌会大量复苏、增殖，成为初侵染源。

据不完全统计，全世界农作物每年因病虫害造成的损失约占其总产量的37％，对病虫害的防治一直是人们提高农作物产量和发展农业生产的途径之一。多运用于防治植物病原真菌的防治方法有抗病品种的选育、嫁接和化学农药等。选育抗病品种所需周期长，且抗病效果不稳定，多数时会影响果实口感。嫁接同样会造成果实口感差、且易受到其他病虫害的感染。现如今，化学农药依旧是主要的控制病虫害的有效手段，但化学农药毒性高，难以降解且对同一真菌病害多次施用后，很容易使病菌产生抗药性，同时还会造成环境污染和人体健康安全等问题，这违背了倡导绿色消费的绿色无公害的生态农业模式。绿色无公害的生态农业模式其要求是“优质、高产、高效、生态、安全”，而生物农药是实现无公害农业的关键环节之一。

用生物农药方法来植物真菌病害，是一种绿色安全、对环境和人、畜无害且病原真菌不易产生抗药性的有效方法，已成为当今农药界研究的热点。生物农药主要是利用有益微生物(真菌和细菌)来抑制病菌，有益微生物等进入土壤后，或直接对病原菌产生影响，或与土壤中微生物相互作用形成共生增殖关系后抑制病原真菌，更多的是分解转化有机物，直接或间接为植物提供更多营养，促进植物的生长。同时与根际微生物形成优势种群，增强植物抗病性。目前市面上的生物农药种类繁多，以微生物类、基因工程类和植物源类农药为主，其中微生物农药应用最为广泛。

昆虫病原线虫(Entomopathogenic Nematodes，EPNs)共生细菌是一类存在EPNs肠道内的革兰氏阴性菌，通过EPNs携带进入昆虫宿主血淋巴，释放多种毒素使宿主患败血症死亡，同时分泌多种具有抑菌活性的次生代谢产物保证虫尸不腐。从昆虫病原线虫共生菌中已经分离出大量具有杀虫活性、抗菌活性甚至抗肿瘤活性的次级代谢产物，包括蛋白质、肽、二硫吡咯衍生物、吲哚衍生物、苯并吡喃衍生物和一些新发现的活性物质，具有对人畜安全、生态环境影响小、病虫害不易产生抗性等优点，有望成为控制作物病虫害、保障食品安全的重要微生物农药资源。

应用伯氏致病杆菌(Xenorhabdus bovienii)次级代谢产物的防治FON的研究除了本实验室做了初步探索外，尚未见报道。本实验室前期研究发现，X.bovienii NN6菌株的发酵液对FON等5种常见植物病原真菌的菌丝生长具有较好的抑制作用，但具体活性成分未知。

发明内容

发明目的：根据当前生态农业中绿色无公害农产品的生产问题和需求以及现有的技术等问题，本发明的目的旨在从具有广谱抑菌效应的伯氏致病杆菌(Xenorhabdusbovienii)NN6中纯化出广谱抗菌(西瓜专化性尖孢镰刀菌1号生理小种、黄瓜专化性尖孢镰刀菌、禾谷镰刀菌、木贼镰刀菌、灰霉菌和稻瘟病菌)的胞外粗蛋白和一种新的具有抗西瓜枯萎病菌的抗菌蛋白PPIA-L20。

技术方案：为了解决上述技术问题，本发明提供了一种抗菌蛋白PPIA-L20，所述抗菌蛋白PPIA-L20的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

本发明内容还包括核酸或基因，其编码所述的抗菌蛋白PPIA-L20。

其中，所述的核酸或基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

本发明内容还包括所述的抗菌蛋白PPIA-L20的获得方法，包括以下步骤：

1)伯氏致病杆菌(Xenorhabdus bovienii)NN6经发酵培养后通过提取纯化获得NN6胞外粗蛋白活性组分；

2)NN6胞外粗蛋白活性组分首先经阳离子交换树脂层析得到具有抗菌活性的蛋白分离组分，再经凝胶过滤层析进一步纯化后，得到抗菌活性的蛋白组分纯品；

3)采用SDS-PAGE电泳验证步骤2)中分离纯化得到的抗菌蛋白为纯品，并对抗菌蛋白进行质谱鉴定得到抗菌蛋白PPIA-L20。

其中，步骤2)的具体步骤如下：将本发明步骤1)中NN6胞外粗蛋白活性组分首先经阳离子交换树脂层析得到3个蛋白峰A1～A3，其中A3具有显著的抗菌活性。将经阳离子交换层析后的A3组分再经凝胶过滤层析进行进一步的分离纯化，得到4个蛋白峰B1～B4，经抑菌活性验证发现B4峰为具有抗菌活性的蛋白分离组分。

其中，步骤3)的具体步骤如下：将步骤2)中的活性蛋白分离组分B4经SDS-PAGE后验证为抗菌蛋白的纯品，对该抗菌蛋白进行质谱鉴定发现，该抗菌蛋白是peptidyloprolylisomerase A的类似物，相对分子质量为20.5kDa，由188Aa组成，命名为PPIA-L20。

本发明以尖孢镰刀菌西瓜专化型为供试真菌，以本实验室分离保存的Xenorhabdus bovienii NN6为材料，从LB(含有丙酮酸钠)、YS、YSG和TSB四种发酵培养基中筛选出培养后抗菌能力最强的培养基，不同发酵液的抑菌效果，得出最佳发酵培养基为YSG培养基(甘油0.69％、大豆蛋白胨2.517％、七水合硫酸镁0.157％、硫酸铵0.225％、磷酸二氢钾0.087％、磷酸氢二钾0.111％、硫酸钠0.181％、pH值7.0，用去离子水配置)。

其中，所述步骤1)中采用硫酸铵分级沉淀法进行提取分离NN6胞外粗蛋白。

其中，所述步骤2)中阳离子树脂为CM-Sepharose，所述凝胶为Superdex^TM 75。

其中，所述步骤3)的抗菌蛋白的分子量为20.5kDa，由188Aa组成。

本发明内容还包括所述的抗菌蛋白PPIA-L20、含有所述的抗菌蛋白PPIA-L20的NN6胞外粗蛋白在FON1、尖孢镰刀菌黄瓜专化型、禾谷镰刀菌B4-1、木贼镰刀菌、稻瘟菌、灰霉菌中的一种或几种的防治中的应用。

本发明从NN6菌株的发酵液中分离纯化出能抑制FON1的活性蛋白，利用质谱确定活性蛋白的序列，结合抗菌蛋白对FON1菌丝和孢子的显微和亚显微结构的影响推测其抑菌活性的作用方式。本发明从发酵后的伯氏致病杆菌(Xenorhabdus bovienii)NN6发酵液中分离出无细胞上清液，通过硫酸铵沉淀得到胞外粗蛋白，分别对尖孢镰刀菌西瓜专化型1号生理小种、尖孢镰刀菌黄瓜专化型、禾谷镰刀菌、灰霉菌和稻瘟病菌的菌丝进行抑菌试验，发现胞外粗蛋白除了对稻瘟病菌抑制效力稍弱外，对其他的病原真菌显示出较强的抑制效力。

本发明从从热稳定性、酸碱稳定性和贮藏时间稳定性评价了上述胞外粗蛋白对尖孢镰刀菌西瓜专化型和禾谷镰刀菌菌丝和孢子的抗菌能力。NN6胞外粗蛋白显示出较好的对温度和pH以及贮藏时间的稳定性。

有益效果：本发明与现有技术相比，优点在于：本发明筛选出最适合Xenorhabdusbovienii NN6抑菌的发酵培养基，发现NN6菌株胞外粗蛋白具有广谱抗菌性，对温度不敏感以及耐贮藏，本发明最大的创新点在于从粗蛋白中分离纯化出一种抗菌蛋白PPIA-L20，同时从显微和超微结构，发现其能显著破坏尖孢镰刀菌西瓜专化型菌丝和孢子的形态。该抗菌蛋白来源具有环保无毒性等特点，对于保护生态环境和提高农产品的附加值上具有重要意义。

附图说明

图1 NN6发酵液对FON1菌丝的抑菌率；

图2不同饱和度硫酸铵沉淀的NN6胞外粗蛋白对FON1菌丝和孢子的抑制活性；图2A表示菌丝抑制图，图2B表示菌丝抑菌圈直径，图2C表示不同处理后的孢子萌发情况；图2D表示孢子的萌发抑制率。图中的0～30％、30～40％、40～50％、50～60％、60～70％、70～80％分别表示不同饱和度的硫酸铵。

图3拮抗试验示意图；

图4胞外粗蛋白对不同病原真菌的抑菌活性。图4A、B、C、D、E和F分别表示Magnaporthe grisea、Botryis cinerea、F.graminearum B4-1、FON1、F.equiseti和FOC。图4G表示抑菌圈；

图5 NN6菌株胞外粗蛋白的热稳定性。图5A表示不同温度处理后胞外粗蛋白对FON和B4-1菌丝的影响，图5B表示不同温度处理后胞外粗蛋白对FON和B4-1孢子的影响；

图6 NN6菌株胞外粗蛋白的酸碱稳定性。图6A表示不同pH处理后胞外粗蛋白对FON和B4-1菌丝的影响，图6B表示不同pH处理后胞外粗蛋白对FON和B4-1孢子的影响；

图7抗菌蛋白的不同分离组分。图7A表示CM-Sepharose阳离子交换层析，得到A1、A2、A3组分，图7B表示Superdex^TM 75凝胶过滤层，得到B1、B2、B3和B4组分。

图8抗菌蛋白不同分离组分对FON1菌丝的抑制活性；

图9抗菌蛋白不同分离组分对FON1孢子的抑制活性。1、2、3、4、5、6和7分别表示Al、A2、A3、B1、B2、B3和B4。

图10抗菌蛋白各级分离的SDS-PAGE蛋白电泳图；

图11光学显微镜和冷冻扫描电子显微镜观察FON1菌丝和孢子形态。Al为菌丝对照组，A2&A3为菌丝处理组；A4为孢子对照组，A5&A6为孢子处理组。冷冻扫描电子显微镜观察FON1菌丝和孢子形态见图11B，其中B1&B2为菌丝的对照组，B3&B4为抗菌蛋白处理的菌丝，B5&B6为孢子对照组和，B7&B8为抗菌蛋白处理的孢子。

具体实施方式

下面通过具体的实施例对本发明进一步说明，应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些也应视为属于本发明的保护范围。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。

伯氏致病杆菌(X.bovienii)NN6是本实验室从加州大学河滨分校线虫学系的Dillman博士惠赠的俄勒冈斯氏线虫Steinernema oregonense中分离鉴定并保存的。该菌株伯氏致病杆菌的高毒力菌株NN6，保藏编号：CCTCC NO：M2020097，2020年4月29日保藏于中国典型培养物保藏中心，已在申请号为CN202010376156.5的发明专利中公开。本发明的昆虫病原线虫共生菌菌株NN6以甘油菌的形式保藏在-80℃冰箱中。

尖孢镰刀菌Fusarium oxysporum的西瓜专化型FON1由江苏省农业科学院蔬菜研究所惠赠，禾谷镰刀菌Fusarium graminearum B4-1、尖孢镰刀菌Fusarium oxysporum黄瓜专化型NFC1、灰葡萄孢Botrytis cinerea NBC1和木贼镰刀菌Fusarium equiseti均由南京农业大学植物保护学院农药学系惠赠，稻瘟菌Magnaporthe grisea GuyII由南京农业大学植物保护学院植物病理学系惠赠。这些菌株均由发明人进一步分纯后以滤纸片的形式保藏在-80℃冰箱中。本发明的％，如没有特殊注明均为质量百分比。

实施例1：最适培养基的筛选

摇瓶发酵液的制备方法，包括如下步骤：

1)取甘油菌管中Xenorhabdus bovienii NN6菌悬液，在NBTA平板培养基(酵母提取物0.3％、胰蛋白胨0.5％、NA(营养琼脂)20％、TTC(2，3，5-三苯基氯化四氮唑)0.01％、BTB(溴百里酚蓝)0.0025％、丙酮酸钠(SP)0.1％、pH为7.0，培养基用去离子水溶解配置)上划线，28℃培养24～48h得到蓝绿色单菌落；

2)挑取蓝绿色初生型菌落接种入LB(LB中含有千分之一培养基体积丙酮酸钠，下同)液体培养基，28℃下震荡培养24h得到种子液；

3)取步骤2)培养的菌液以5％的接种量再接种于LB、YS、YSG和TSB摇瓶发酵培养基中28℃震荡培养72h得到发酵液。

4)取步骤3)中发酵完成的NN6发酵液，用菌丝生长速率抑制法测抑菌效率。以新鲜灭菌的去离子水为阴性对照组，以四种培养基(LB、YS、YSG和TSB)发酵完成的NN6菌液作为处理组，每组取5mL加入45mL低温融化的PDA固体培养基中并倒平板，制成含药培养基。以尖孢镰刀菌西瓜专化型1号生理小种FON1为指示菌株，用真菌打孔器从新鲜生长的FON1菌落边缘切下直径为6mm的菌饼，放置于制好的PDA平板中央，25℃培养箱避光培养4～5d，测量菌落直径，计算相对抑制率。公式如下：拮抗宽度＝2个接菌点连线上的无菌区宽度；相对抑菌率(％)＝[(d_对照-6)-(d_处理-6)]/(d_对照-6)×100％。菌丝生长抑菌率统计见表1和图1。

表1不同培养基发酵培养基对FON1菌丝的影响

其中，步骤1)的NBTA平板培养基的组成为：胰蛋白胨1％、酵母提取物0.5％、氯化钠1％、琼脂1.5％、溴百里酚蓝0.000025％、丙酮酸钠0.1％、氯化三苯基四氮唑0.00004％、pH值7.4，用去离子水配置，总体积为1L。

其中，步骤2)和3)中的LB液体培养基的组成为：胰蛋白胨1％、酵母提取物0.5％、氯化钠1％、丙酮酸钠0.1％、pH值7.4，用去离子水配置，总体积为1L。

其中，步骤3)中的YS、YSG和TSB摇瓶发酵培养基组成为：YS：磷酸二氢铵0.05％、磷酸二氢钾0.05％、七水合硫酸镁0.02％、氯化钠0.5％、酵母提取物0.5％、pH值7.0；YSG：甘油0.69％、大豆蛋白胨2.517％、七水合硫酸镁0.157％、硫酸铵0.225％、磷酸二氢钾0.087％、磷酸氢二钾0.111％、硫酸钠0.181％、pH值7.0；TSB：胰蛋白1.5％、大豆蛋白胨0.5％，氯化钠0.5％、pH值7.0，以上培养基用去离子水配置，总体积为1L。

本发明的NN6经不同发酵培养基发酵后对FON1的菌丝相对抑制率结果见图1，所示，发现经YSG培养基发酵后的发酵液抑菌能力最强，为70.01％。

实施例2：Xenorhabdus bovienii NN6胞外蛋白组分的制备及活性测定

本实施方式以FON1为供试真菌，探究不同饱和硫酸铵浓度下XenorhabdusbovieniiNN6胞外粗蛋白对FON1菌丝和孢子的抑制效率。

Xenorhabdus bovienii NN6经YSG发酵培养后，发酵液用8000g离心20min后分别收集无细胞上清液，经0.22μm滤膜除菌后即得无菌滤液。缓慢多次向无菌滤液中加入固体硫酸铵至30％饱和度，在4℃冰箱中静置过夜后，10,000g离心15min，分别收集上清和沉淀。再向上清液加入固体硫酸铵，并调节硫酸铵饱和度到40％、50％、60％、70％、80％，收集每一个饱和度的沉淀蛋白，用少量灭菌的25mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH 7.2)进行溶解，透析除盐(透析袋截留分子量为3.5kD)后用紫外分光光度计测定蛋白浓度并对各级沉淀蛋白进行生物活性的测定，4℃保存备用。

胞外粗蛋白对FON1菌丝生物活性测定采用牛津杯法：PDA平板接入病原真菌菌饼后，在距真菌2cm处放置牛津杯，牛津杯里注入浓度为1.0mg/mL的200μl NN6胞外粗蛋白，三个重复试验，28℃培养箱避光培养至对照组菌丝长出牛津杯范围，统计抑菌圈大小。

胞外粗蛋白对FON1孢子生物活性测定采用凹玻片孢子萌发抑制法：首先需要获得孢子悬液：从已在PDA板上培养5d的FON1菌体，用真菌打孔器接3-5菌饼于装有100mL液体PDA的250mL锥形瓶中，先在28℃摇床中180rpm培养2d，待溶液变成紫红色后，将摇床转速调为200rpm继续摇3-4d，直至溶液变成紫褐色。六层纱布过滤大部分菌丝后，滤液经3000g离心2min，弃上清后可见明显孢子沉淀，再加灭菌去离子水，再3000g离心2min，最后用灭菌离子水将孢子重悬至1×10⁵/mL。

NN6菌株胞外粗蛋白为处理组，用10μL处理液与10μL孢子悬液以及10uL 0.5％葡萄糖等量混匀，然后将混合液滴到凹面玻片中心，放到90mm培养皿中，皿中事先放一张用水湿润的滤纸，加盖于28℃培养箱保温培养，以灭菌去离子水作对照。10～12h后，在光学显微镜下观察孢子萌发情况，当对照组萌发率超过85％后，统计并计算孢子萌发率和相对萌发抑制率。当分生孢子芽管长度大于分生孢子短半径即视为萌发。根据下面公式A计算孢子萌发率，根据公式B计算相对萌发率，在根据公式C计算相对萌发抑制率(R代表分生孢子萌发率，Ng代表已萌发的分生孢子数，Nt代表调查的分生孢子总数；Rg代表经过处理的校正后的分生孢子发芽率，Rt代表处理组分生孢子萌发率，R0代表对照组分生孢子萌发率；I代表分生孢子萌发的相对抑制率)。

A：R＝Ng/Nt×100；B：Rg＝Rt/R0×100；C：I＝(R0-Rg)/R0×100。

将处理后的孢子悬液中取6μl均匀滴加到PDA平板上，观察孢子是否会正常萌发生长成菌丝。不同硫酸铵饱和度下沉淀的蛋白对FON1菌丝的抑制图和抑制率见图2A和B，不同处理后的孢子萌发情况见图2C，对孢子萌发的相对抑制率见图2D。结果显示，40％～80％饱和硫酸铵沉淀的NN6胞外粗蛋白对FON1的菌丝和孢子具有极显著的抑制能力，且被处理后的FON1孢子不能正常萌发。

实施例3：Xenorhabdus bovienii NN6胞外粗蛋白的广谱抗菌性

本实施方式的胞外粗蛋白是由实施例2中无菌滤液经40％饱和硫酸铵沉淀去除杂蛋白后再经80％饱和硫酸铵沉淀获得的NN6胞外粗蛋白活性组分，对尖孢镰刀菌西瓜专化型1号生理小种FON1和尖孢镰刀菌黄瓜专化型NFC1、禾谷镰刀菌F.graminearum B4-1、木贼镰刀菌F.equiseti、稻瘟菌Magnaporthe grisea GuyII和灰霉菌Botryis cinerea的抗菌能力。使用牛津杯法(示意图见图3)测NN6胞外粗蛋白对FON1、FOC、B4-1、F.equiseti、GuyII和NBC1菌丝的抑菌效应。抑菌效应图见图4A-F，胞外粗蛋白对不同病原真菌的抑菌圈见图4G，发现NN6胞外粗蛋白除了对稻瘟病菌抑制效力稍弱外，对其他的病原真菌显示出较强的抑制效力。

实施例4：Xenorhabdus bovienii NN6胞外粗蛋白的热稳定性

本实施方式的NN6胞外粗蛋白的热稳定性测定。试验中将实施例3中通过硫酸铵分级沉淀获得的NN6胞外粗蛋白活性组分用Tris-HCl缓冲液(25mmol/L，pH 7.2)配制成1.0mg/mL的蛋白液(以下都为此浓度)，然后将水浴锅分别调到40℃、60℃、80℃、100℃，将粗蛋白分别置于其中处理30min作为处理组，取处理后的200μL粗蛋白液于牛津杯中，以FON1和F.graminearum B4-1为供试真菌，统计菌丝抑制率；同时使用孢子萌发抑制法，将处理完的粗蛋白液进行对孢子的萌发抑制试验。结果见图5A和5B，结果显示NN6胞外粗蛋白具有良好的热稳定性。

实施例5：Xenorhabdus bovienii NN6胞外粗蛋白的酸碱稳定性

本实施方式的NN6胞外粗蛋白的热稳定性测定。试验中，直接使用pH计用0.5mol/LHCl和NaOH来调节实施例3中通过硫酸铵分级沉淀获得的NN6胞外粗蛋白活性组分的pH，使pH分别为2、3、4、5、6、8、9、10、11、12，处理30min后再调节回至7左右，之后将处理完的样品分别置于牛津杯中，以未处理的pH 7为对照组，以FON1和F.graminearum B4-1为供试真菌，统计菌丝抑制率；使用孢子萌发抑制法，将处理完的粗蛋白液进行对孢子的萌发抑制试验。结果见图6A和B，结果显示NN6胞外粗蛋白具有较好的酸碱稳定性。

实施例6：抗菌蛋白PPIA-L20的纯化制备

本实施方式是将实施例3中通过硫酸铵分级沉淀获得的NN6胞外粗蛋白活性组分，应用阳离子交换填充材料CM-Sepharose Fast Flow(2cm×10cm)，用25mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH 7.2)洗涤未吸附的蛋白后，用含有1mol/L NaCl的Tris-HCl缓冲液连续洗脱被吸附的蛋白，280nm处检测吸光度，按峰合并，脱盐冷冻干燥后检测抑菌活性，保留有拮抗活性的蛋白组分进行下一步纯化。将抑菌活性组分加入到AKTA Prime Plus液相层析系统中的Superdex^TM 75 16/60 column中，用25mmol/L Tris-HCl缓冲液流速为0.5mL/min进行洗脱，280nm处检测吸光度，按峰合并，脱盐冷冻干燥后检测抑菌活性，保留活性峰检测。在每个色谱步骤中，通过牛津杯法和凹玻片法以25mmol/L Tris-HCl缓冲液为对照组，测定每个分离组分的抗真菌活性。分离组分见图7A和7B。阳离子交换层析和凝胶过滤层析后不同组分对FON1菌丝的抑制效果见图8。阳离子交换层析和凝胶过滤层析后不同组分对FON1孢子的抑制效果见图9A和9B。其中不同分离组分A1、A2、A3是CM-Sepharose交换层析得到的蛋白分离组分，B1、B2、B3和B4是Superdex^TM 75凝胶过滤层析得到的蛋白分离组分。结果显示，经阳离子交换树脂层析得到的具有抑菌能力的活性蛋白组分为A3，再将A3组分经凝胶过滤层析得到具有抑菌能力的活性蛋白组分B4。

实施例7：抗菌蛋白纯化过程中的SDS-PAGE蛋白电泳

本实施方式用SDS-PAGE蛋白凝胶电泳来观测各纯化步骤的蛋白情况。试验中用到的4％浓缩胶和12％分离胶的配置见下表2。

表2 SDS-PAGE蛋白凝胶配置表

蛋白电泳：

(1)样品准备与加样：在10μL冷冻干燥稀释后的40％～80％硫酸铵沉淀的粗蛋白，A3(经实施例6中阳离子交换树脂层析后得到的活性蛋白分离组分，浓度为2.46mg/mL)和B4(经实施例6中凝胶过滤层析后得到的活性蛋白分离组分，浓度为2.75mg/mL)分别加入等体积的上样缓冲液，95℃沸水煮10min，瞬时离心后，直接上样，体积为20μl。

(2)电泳：室温条件下加入样品和标准蛋白Marker，设定浓缩胶电压为80V，分离胶电压为150V进行电泳，待样品进入分离胶时调节电压，当溴酚蓝迁移至距板下端2cm时，关闭电源停止电泳。

(3)剥胶及染色：电泳结束后，从玻璃板上轻轻剥下凝胶(保持凝胶完整)，蒸馏水冲洗3次后加入30mL考马斯亮蓝，用微波炉温火加热2min，在摇床上100r/min振荡15min，染液回收利用。用脱色液脱色6h，每2h换一次脱色液，直至有清晰的蛋白质条带出现为止。蛋白电泳结果图见图10。其中M表示蛋白maker，A表示40％～80％硫酸铵沉淀的粗蛋白，A3(经实施例6中阳离子交换树脂层析后得到的活性蛋白分离组分，浓度为2.46mg/mL)和B4(经实施例6中凝胶过滤层析后得到的活性蛋白分离组分，浓度为2.75mg/mL)分别表示有活性的蛋白组分。

实施例8：抗菌蛋白的鉴定及定性分析

将B4组分用考马斯亮蓝染色、脱色后剪出蛋白条带，去除多余染色。以上样品送到北京诺禾致源科技股份有限公司进行质谱鉴定。抗菌蛋白的鉴定过程：先将胶条用脱色液(50mM TEAB+50％乙腈)脱色，再加入50％乙腈脱水处理至完全变白，后依次加入10mM DTT和50mM IAM，在用乙腈脱色、风干。胶内酶解用10ng/μL胰酶冰上静置30min后加入100mMTEAB缓冲液至总体积为100μL，37℃过夜，离心后上清加入0.1％甲酸振荡5min，C18柱除盐后冻干。将冻干粉末溶解后使用液质检测，先使用EASY-nLCTM 1200纳升级UHPLC系统，再使用Q ExactiveTM HFX质谱仪，质谱采用数据依赖型采集模式，质谱全扫描范围为m/z 350-1500，一级质谱分辨率设为60000(200m/z)，再选取全扫描中离子强度TOP 40的母离子使用高能碰撞裂解(HCD)方法碎裂，进行二级质谱检测，生成质谱检测数据。分析采用Blast方法在NCBI数据库的ASM2722v1 protein数据库中对得到的序列进行比对，以收集与抗菌蛋白相似的蛋白质信息。根据对应的unique多肽碎裂情况选取定量值排序前5位的二级肽段的二级质谱图数据进行比对分析(结果信息如表3所示)。通过ASM2722v1 protein数据库的搜索比对，发现抗菌蛋白与肽基脯氨酰异构酶A的Score为377.1，序列覆盖率为76％，因此判断该蛋白是肽基脯氨酰异构酶A(peptidylprolyl isomerase A)类似物，命名为PPIA-L20，它在Xenorhabdus bovienii参考数据库中的NCBI登录号为WP_012990369.1。本发明获得了一个新抗菌蛋白以及新序列，抗菌蛋白的具体序列信息如SEQ ID NO：1和2所示。

表3抗菌蛋白鉴定结果

实施例9：抗菌蛋白PPIA-L20对尖孢镰刀菌西瓜专化型菌丝和孢子结构的影响

本实施方式是以新鲜灭菌的25mmol/L(pH 7.2)Tris-HCl为阴性对照组，以浓度为500μg/mL的PPIA-L20抗菌蛋白为处理组，将1200μL的PDA培养基冷却至40℃与300μL的抗菌蛋白混合，加入到直径为60mm培养皿上，接入FON1菌丝进行处理，25℃避光培养5d；用孢子萌发抑制法以抗菌蛋白为处理组，处理12h后，取适量FON1孢子滴加到(5mm×5mm)培养基上进行观察。分别取FON1对照组和处理组菌丝以及孢子，在光学显微镜下观察形态变化；同时分别从菌丝和孢子的处理组和对照组中取样取适量的样品固定在样品拖上，菌丝从培养基中取长方体培养基(连同培养基的菌落)，孢子中直接取少量样品，再安放于冷冻/真空转移杆上，样品用液氮冷冻干燥后，置于冷冻扫描电镜制备系统冷台上，进行冷冻扫描电子显微镜观察菌丝形态。光学显微镜下观察FON1菌丝和孢子形态见图11A，其中A1为菌丝对照组，A2&A3为菌丝处理组；A4为孢子对照组，A5&A6为孢子处理组。冷冻扫描电子显微镜观察FON1菌丝和孢子形态见图11B，其中B1&B2为菌丝的对照组，B3&B4为抗菌蛋白处理的菌丝，B5&B6为孢子对照组和，B7&B8为抗菌蛋白处理的孢子。结果显示，光学显微镜下发现FON1处理后的菌丝明显比对照组细，菌丝生长紊乱，多处生长不连续(图11A2&A3)；处理后孢子比对照组小，无孢子萌发(图11A5&A6)。冷冻扫描电子显微镜发现FON1对照组菌丝生长旺盛，表面光滑、连续且粗壮(图11 B1&B2)；FON1处理组的菌丝形态被破坏，萎缩塌陷，菌丝变细，表面黏连且多处不连续等(图11 B3&B4)。FON1对照组孢子饱满，形态正常(图11 B5&B5)；处理组孢子胞壁塌陷，出现干瘪，形态受到严重破坏(图11 B7&B8)。观察结果表明，抗菌蛋白破坏了FON1菌丝和孢子的形态和结构。

序列表

<110> 南京农业大学

<120> 抗菌蛋白PPIA-L20及其在生物防治中的应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 576

<212> DNA

<213> 抗菌蛋白PPIA-L20(peptidyloprolyl isomerase A)

<400> 1

atgctattaa taatagataa ctacgattct tttacattca atttatatca atatttttgc 60

gagttaggga caaatgtttt agttaagcgt aatgatgaat tacagcttga agatatcgag 120

aagttggcgc ccacacattt agtgatttcg ccggggcctt gtacgccaaa tgaagcaggg 180

atttcactag aggccattgc gcattttgcc ggcaaattgc caatcctcgg tgtgtgccta 240

gggcatcagg ctattgggca ggcttttggt gcgagtgtgg tcaaagcccg cgaggtgatg 300

cacggaaaaa acagcttgat ccaccataat caacaaggag tattcaaagg attgaaccgt 360

ccactgactg ttactcgtta tcattctctg gtgattgctg ctgaaaccct gccagcatcg 420

tttgaagtga ccgcatggag tcagcataac ggtaatgtag atgaaattat gggaatacgt 480

caccgtactt tgccattgga aggtgtgcaa tttcaccctg aaagcattct cagtgaacag 540

ggacatgatt tgttgaataa ttttctcaga tattaa 576

<210> 2

<211> 188

<212> PRT

<213> 抗菌蛋白PPIA-L20(peptidyloprolyl isomerase A)

<400> 2

Met Pro Leu Ala Ile Pro Val Ser Leu Met Ala Ala Cys Ala Ile Ser

1 5 10 15

Val Met Ala Thr Pro Ala Leu Ala Ala Gly Thr His Val Leu Leu Val

20 25 30

Thr Ser Ala Gly Gly Ile Gly Leu Ala Leu Ala Ser Ala Leu Ala Pro

35 40 45

Ile Thr Thr Leu Ala Pro Ile Gly Thr Val Ala Gly Gly Pro Thr Ala

50 55 60

Ala Thr Ile Pro His Ala Ile Ile Pro Gly Pro Met Val Gly Gly Gly

65 70 75 80

Gly Pro Thr Leu Ala Met Leu Gly Leu Val Thr Leu Ala Pro Ile Leu

85 90 95

Ala Gly Ala Ala Ala Gly Leu Ala Ala Leu Ala Gly Thr Ile Ala Met

100 105 110

Ala Ala Thr Ala Ala Leu Ala Ser Ala Thr Ser Gly Pro Pro Ile Ala

115 120 125

Val Thr Ala Ala Ala Pro Leu Ala His Gly Gly Ala Ala Pro Gly Thr

130 135 140

Ala Val Pro Gly Leu Val Ile Leu Gly Met Ala Val Val Ala Leu Ile

145 150 155 160

Ser Gly Val Leu Thr Gly Ala Val Gly Pro Thr Gly Ala Val Pro Val

165 170 175

Leu Pro Ile Val Ile Leu Ser Ala Leu Val Ala Pro

180 185

Claims

1.一种抗菌蛋白PPIA-L20的获得方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）伯氏致病杆菌（Xenorhabdus bovienii）NN6经发酵培养后通过提取纯化获得NN6胞外粗蛋白活性组分；所述伯氏致病杆菌（Xenorhabdus bovienii）NN6的保藏编号为CCTCCNO: M 2020097；

2）NN6胞外粗蛋白活性组分首先经阳离子交换树脂层析得到具有抗菌活性的蛋白分离组分，再经凝胶过滤层析进一步纯化后，得到抗菌活性的蛋白组分纯品；

3）采用SDS-PAGE电泳验证步骤2）中分离纯化得到的抗菌蛋白为纯品，并对抗菌蛋白进行质谱鉴定得到抗菌蛋白PPIA-L20。

2.根据权利要求1所述的抗菌蛋白PPIA-L20的获得方法，其特征在于，所述步骤1）中所述提取纯化方法为采用硫酸铵分级沉淀法进行提取分离NN6胞外粗蛋白活性组分。

3.根据权利要求1所述的抗菌蛋白PPIA-L20的获得方法，其特征在于，所述步骤1）中发酵培养基为YSG培养基，所述YSG培养基组分包括甘油、大豆蛋白胨、七水合硫酸镁、硫酸铵、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、硫酸钠、去离子水，pH值6.0~9.0。

4.根据权利要求1所述的抗菌蛋白PPIA-L20的获得方法，其特征在于，所述步骤2）中阳离子树脂为CM-Sepharose，所述凝胶为Superdex^TM 75。

5.根据权利要求4所述的抗菌蛋白PPIA-L20的获得方法，其特征在于，所述步骤3）的抗菌蛋白的相对分子质量为 20.5 kDa，由188 Aa组成。

6.权利要求1~4任一项所述方法得到的抗菌蛋白PPIA-L20、含有所述的抗菌蛋白PPIA-L20的NN6胞外粗蛋白在尖孢镰刀菌西瓜专化型、尖孢镰刀菌黄瓜专化型、禾谷镰刀菌、木贼镰刀菌、稻瘟菌、灰霉菌中的一种或几种的防治中的应用，其特征在于，所述NN6胞外粗蛋白是采用硫酸铵分级沉淀法进行提取分离得到，所述硫酸铵为40%~80%饱和硫酸铵。

7.权利要求1~4任一项所述方法得到的抗菌蛋白PPIA-L20、含有所述的抗菌蛋白PPIA-L20的NN6胞外粗蛋白在防治西瓜枯萎病中的应用，其特征在于，所述NN6胞外粗蛋白是采用硫酸铵分级沉淀法进行提取分离得到，所述硫酸铵为40%~80%饱和硫酸铵。