CN103773712A

CN103773712A - 一种抗真菌肽高产菌株及其制备抗菌肽的方法

Info

Publication number: CN103773712A
Application number: CN201310662193.2A
Authority: CN
Inventors: 周志江; 赵鑫; 韩烨
Original assignee: Tianjin University
Current assignee: Tianjin University
Priority date: 2013-12-06
Filing date: 2013-12-06
Publication date: 2014-05-07

Abstract

本发明公开了一种芽胞杆菌BH072（Bacillus sp.BH072）及通过培养该菌株制备抗菌肽伊枯草菌素A（iturin A）的方法。采用发酵方法产生伊枯草菌素A（iturin A），从种子培养基中取6%-7%接种量接种于发酵培养基中，培养温度29℃-30℃，pH6.4-6.5，转速150rpm，培养60h，进行纯化提取。本发明的芽胞杆菌BH072对黑曲霉、尖刀镰孢菌、灰葡萄孢霉、腐霉等植物病原菌有显著的杀菌作用，具有广谱抗菌性，通过对发酵条件的优化不仅提高该菌株的利用率，而且也可为其他同类试验提供参考，采取有效的分离方法从发酵液中分离出伊枯草菌素A（iturin A）具有很强的抑真菌活性，对其进行鉴定和产量优化后，其产量为52.21mg/ml，与已经报道的菌株iturin A产量相比较高，适于开发后大规模工业化生产。

Description

一种抗真菌肽高产菌株及其制备抗菌肽的方法

技术领域

本发明涉及芽胞杆菌属的一株抗真菌肽高产菌株芽胞杆菌BH072（Bacillus sp.BH072）新菌株及通过培养该菌株制备抗菌肽伊枯草菌素A（iturin A）的方法。

背景技术

真菌在自然界广泛存在，据报道自然界大约有一百五十万种真菌，目前已知的仅有七万四千种。有些真菌可以引起植物病害，导致农作物减产，造成巨大的经济损失。所以控制粮食作物和食品中真菌污染，控制其生长繁殖和毒素的产生是我们面临的一个十分艰巨的任务。真菌的生物控制方法中，抗真菌肽的研究尤其成为当前研究的热点。据APD（the Antimicrobial Peptide Database）数据库记载，从人类、动物、爬行动物、鸟类、昆虫和微生物等不同生物分离出了756种不同的抗真菌肽。据报道，芽胞杆菌、假单孢菌、链霉菌、曲霉、食用菌等微生物均可产生具有不同杀真菌作用的抗真菌肽。其中尤以芽胞杆菌产生的抑菌物质种类多，芽胞杆菌产生的抗真菌物质有核糖体合成的抑菌蛋白和非核糖体合成的抗生素两种类型。核糖体合成的抑菌蛋白主要有细菌素、细胞壁降解酶类（如蛋白酶、几丁质酶、β-1，3-葡聚糖等）以及一些未鉴定的抑菌蛋白等。对细菌和真菌具有不同程度抑菌作用。非核糖体合成的抗生素主要是脂肽抗生素。芽胞杆菌产生的脂肽类抗生素有表面活性素（Surfactin）、伊枯草杆菌素（Iturins）和芬枯草菌素（Fengyein）三大类。脂肽类抗生素大多是带有D型和L型氨基酸的环肽，带有一个脂肪酸链，对丝状真菌和酵母都表现抑菌活性。

芽胞杆菌分布广泛，是土壤和植物体表根际的重要微生物种群，多数对人畜无毒无害，不污染环境，一些菌株产生拮抗有害病菌的抑菌物质。而且，芽胞杆菌对营养要求低，生长繁殖快，能产生耐热性内生芽胞，抗逆能力强，可以耐受各种不良环境。同时芽胞杆菌因其抑菌谱广且对多种植物病害具有较好防效而引起广泛注意。由于以上特点，芽胞杆菌成为了生物食品防腐和生物农药的研究热点。

抗真菌肽抑制病原菌孢子产生和萌发，使得菌丝畸形；或通过阻止、破坏真菌细胞壁的合成，在脂膜上形成孔洞，使重要的内容物外泄，导致真菌死亡；有的与真菌细胞内线粒体、核酸作用导致真菌死亡。归纳起来，在抑菌物质的抑菌机理研究方面有三个假说，一是攻击细胞的细胞膜，比较公认的是所谓的桶板模型(barrel-stave model)理论，通常带正电荷的含α-螺旋抑菌肽单体与细胞膜上带负电荷的磷脂分子相互吸引而结合在细胞膜表面，多个抑菌肽分子形成多聚体,扰乱了质膜上蛋白质和脂质原有的排序，并以与膜表面垂直的排列方式将疏水基团插到磷脂双分子层,形成横跨细胞膜的离子通道,造成细胞质物质泄漏和电化学势丧失,细胞膜崩解而导致细胞死亡；二是抑制细胞壁的合成，如棘球白素(echinocandins)是1，3-β-葡聚糖合成酶的抑制物，通过抑制葡聚糖的合成而抑制真菌细胞生长；三是作用于胞内DNA、RNA、酶和蛋白质等分子，使其失去活性，从而达到杀菌作用。

迄今为止，国内外多家实验室通过分离纯化芽胞杆菌的发酵产物，得到了一些高分子量蛋白类的抗菌物质和低分子量的抗菌肽。Caldeira等分离到一株解淀粉芽胞杆菌CCMI1051（Bacillus amyloliquefaciens）对根霉L-122（Rhizopus sp.）和哈茨木霉CCMI783（Trichoderma harzianum）等具有强烈的抑制作用，Arrebola等报道解淀粉芽胞杆菌PPCB004可抑制Penicillium crustosum Thom等青霉属真菌的菌丝延伸，Lee等发现缓病类芽胞杆菌WJ5（Paenibacillus lentimorbus）菌株抑制灰霉（Botrytis cinerea）等多种植物致病菌，其抗真菌活性物质分泌于细胞外，并可被正丁醇提取，权春善等和郝建安等分别分离到对尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）和茄病镰刀菌（Fusarium solani）等真菌具有强抑制作用的解淀粉芽胞杆菌Q-12菌株和NK10.B菌株。研究表明，芽胞杆菌及其产生的抑菌物质在植物病害生物防治中具有巨大的应用潜力。

芽胞杆菌产生的抑菌肽在国内外已得到了一定程度的实际应用。美国有4株枯草芽胞杆菌生物防治菌株获得环境保护局（EPA）批准，可进行商品化或有限商品化生产应用，分别是GBO3、MBI600、QST713和Bacillus subtilis var.amyloliquefaciens FZB24。国内一些单位也对具有抑菌作用的枯草芽胞杆菌进行了研究，涉及的防治对象有大田作物的叶部病害、土传病害和果实病害等，初步揭示了不同菌株的抑菌活性和抑菌物质的性质。我国利用枯草芽胞杆菌防治植物病害的应用研究也达到了世界先进水平，现发成功并投入生产的商品制剂有亚宝、百抗、麦丰宁、纹曲宁、台湾宝等。枯草芽胞杆菌BS-208菌株分泌的抑菌物质可以抑制病菌孢子发芽和菌丝生通过竞争性生长繁殖占据生存空间的方式来阻止植物病原真菌的生长，从而预防与治疗的目的，对真菌病害的防治效果尤为明显。由其制成的“亚宝”性粉剂已经完成农药登记。云南农业大学和中国农业大学共同研制的微生物农药“百抗”已获得农业部登记注册，并在多个省推广使用，面积约4667公顷。百抗的主要有效成分是枯草芽胞杆菌B-908，大田应用中对水稻纹枯病防效达70%以上。它通过营养竞争、位点占领等机制对烟草、三七、花卉、小麦、白菜等作物易患的土传病害具有很好的防治效果，从而成为全国第一个在水稻上获得登记的芽胞杆菌杀菌剂，并将在泰国和越南等国推广应用。江苏省农业科学院植物保护研究所的陈志谊等人经过10多年生物防治水稻病害的研究获得B-916菌株对多种病原真菌和水稻白叶枯病菌都有显著抑制作用，对水稻纹枯病田间防效达50%～81%。2002年取得了国家农药“三证”，年使用面积达6.7万公顷以上，已在江苏等地得到广泛推广。南京农业大学开发的生防菌B3(商品名麦丰宁)对小麦纹枯病田间防效50%～80%。B3产生两种不同类型的抑菌物质，一种对植物病原真菌有抑菌作用，另一种对水稻白叶枯病菌等植物病原细菌有抑制作用，其防病机制主要表现在抑制小麦纹枯病病菌菌丝生长、菌核形成和菌核萌发。黑龙江省科学院微生物研究所研发的枯草芽胞杆菌水剂主要防治瓜类及保护地蔬菜枯萎病、立枯病和豆类根腐病，已在黑龙江省进行推广应用。

目前，国内外有许多关于枯草芽胞杆菌产生的脂肽物质如表面活性剂（surfactant）、伊枯草素（iturin）、芬荠素（fengycin）的报道，但大多都趋向于对脂肽物质的分离纯化或对枯草芽胞杆菌产脂肽物质的培养基成分优化，对发酵条件的优化相对较少，抗菌肽的产量较低，抗菌基因种类单一。

发明内容

本发明的目的是提供一种芽胞杆菌BH072新菌株，该菌株具有三个抗菌基因，可产生大量抗真菌肽。

本发明另一个目的是提供一种通过培养该芽胞杆菌BH072制备抗菌肽伊枯草菌素A（iturin A）的方法及其纯化提取方法，解决现有技术中抗菌肽伊枯草菌素A产量低的问题。

芽胞杆菌BH072从国内蜂蜜样品中分离，并发现其对真菌具有显著的抑制作用。经形态学和生理生化试验研究，发现该菌为芽胞杆菌，并将其命名为芽胞杆菌BH072（Bacillus sp.BH072）。

本发明芽胞杆菌BH072主要有以下特性（表1、表2）：

表1形态学观察结果汇总

表2芽胞杆菌BH072生理生化鉴定结果

‘+’indicates reaction-positive,‘-’indicates reaction-negative.

本发明的抗真菌肽高产菌株芽孢杆菌（Bacillus sp.）已经于2013年11月15日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京)保藏，编号为CGMCC No.8473，地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

采用芽胞杆菌BH072制备抗菌肽伊枯草菌素A（iturin A）的方法，采用发酵方法产生伊枯草菌素A（iturin A），从种子培养基中取6%-7%接种量接种于发酵培养基中，培养温度29℃-30℃，pH6.4-6.5，转速150rpm，培养60h，进行纯化提取。

所述发酵培养基成分为0.90%-0.95%大豆粉，0.95%-1.00%蔗糖和0.90%-0.95%Mg²⁺。

所述纯化提取采用甲醇抽提法提取发酵液中的伊枯草菌素A，并通过HPLC方法纯化获得高纯度产物。所述甲醇抽提指将发酵液先于4200rpm，4℃，离心20min后取上清，再用浓HCl调节pH至2.0,至于4℃，过夜，然后4200rpm，4℃，离心20min后取沉淀，冷冻干燥，将残留物用甲醇抽提24h，甲醇抽提产物经60℃烘干后，进行称重，即可得iturin A的质量浓度。

本发明的有益效果为：抑菌实验表明，本发明的芽胞杆菌BH072对黑曲霉、尖刀镰孢菌、灰葡萄孢霉、腐霉等植物病原菌有显著的杀菌作用，具有广谱抗菌性，经蛋白酶K处理表明抑菌产物属于蛋白质性质的物质。本发明通过对发酵条件的优化不仅提高该菌株的利用率，而且也可为其他同类试验提供参考，采取有效的分离方法从发酵液中分离出伊枯草菌素A（iturin A）具有很强的抑真菌活性，对其进行鉴定和产量优化后，其产量为52.21mg/ml，与已经报道的菌株iturin A产量相比较高，适于开发后大规模工业化生产，在农业生产中作为生物农药的使用具有很大的潜力，为后续利用其防治多种植物真菌性病害和抗菌肽的产业化研究奠定了基础。

附图说明

图1芽胞杆菌BH07216S rDNA序列系统进化树。

具体实施方式

实施例1

芽胞杆菌BH072的鉴定

从蜂蜜中分离到的微生物中，偶然发现了一株具有抗真菌作用的微生物，经形态学和生理生化试验研究，发现该菌为芽胞杆菌，并将其命名为芽胞杆菌BH072（Bacillus sp.BH072）。进一步通过分子生物学鉴定，该具有抗真菌活性的细菌鉴定为芽胞杆菌BH072。

鉴定过程具体操作方法如下。

（1）芽胞杆菌BH072的分离

本实验室已从某蜂蜜中已分离出来的目标菌株，将其命名为芽胞杆菌BH072。

①从蜂蜜中分离至固体牛肉膏蛋白胨平板中，置于37℃，培养24h。

②纯培养：从上述平板中挑取单菌落接种于固体斜面培养基中，置于37℃，培养24h。（重复两次）。

③甘油保存：从上述斜面培养基中挑取菌，接种于液体试管培养基中，置于37℃，培养12h。再取1mL该菌悬液，加入0.5mL甘油于Ep管中，-20℃保存。

（2）菌落特征的观察

将菌种划线接种于普通固体平板培养基，置于37℃，培养24h。观察记录以下结果：

①菌落大小，用格尺测量菌落的直径，大菌落为5mm以上，中等菌落为3-5mm，小菌落为1-2mm，露滴状菌落为1mm以下；

②表面形状：光滑而湿润或者皱缩而干燥；

③凸起情况：分为平坦、低凸起、凸起、高凸起；

④边缘情况：整齐，或较粗糙，如波浪状、锯齿形等；

⑤菌落形状：圆形或不规则状；

⑥表面光泽：分为闪光、金属光泽或无光泽；

⑦菌落质地：分为松软、粘稠、脆硬等；

⑧菌落颜色：分为白色、奶油色、红色、粉红色等；

⑨透明程度：分为透明、不透明或半透明；

⑩气味：有无酿酒香味，面包发酵香味或者异味，恶臭味等。

将菌种接种于普通液体培养基，置于37℃，培养12h。观察菌体存在的位置，液面是否有菌醭、菌环、菌岛，底层是否有沉淀，菌液是否混浊，培养液颜色及有无气泡产生等。

（3）细胞形态观察

革兰氏染色观察：

1.涂片：取95%酒精中的洁净无油的载玻片用洁净滤纸擦酒精，然后在酒精灯火焰上烤几次，再用滤纸擦拭干净，干燥固定菌体。本次试验采用固体材料，在载玻片上滴一滴无菌生理盐水，用接种环以无菌操作从斜面或平板培养物上挑取少许菌苔于水滴中，混匀并涂成薄膜。2.干燥固定：将涂片的涂面朝上，以钟摆速度通过火焰3-4次，略微加热固定。3.初染：滴加结晶紫（以刚好将菌膜覆盖为宜）于玻片的涂面上，染色1-2min，倾去染色液，细水冲洗至洗出液为无色，将载玻片上水甩净。自然干燥或用滤纸吸干水分。4.媒染：滴加碘液媒染约1min，水洗。5。脱色：用滤纸吸去玻片上的残水，将玻片倾斜，在白色背景下，用滴灌流加95%的乙醇脱色，直至流出的乙醇无紫色时，立即水洗，终止脱色，将载玻片上水甩净。脱色时间一般为20-30s。6.复染：在涂片上滴加番红液复染2-3min，水洗，然后用吸水纸吸干。7.镜检：用滤纸吸干水分，油镜检查。

（4）生理生化实验

①糖发酵实验

测试的糖类为葡萄糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖。

将普通培养液用移液管分装于含杜氏小管的试管，即发酵管中，0.1MPa灭菌15min。注意分装与灭菌后，杜氏小管内不要有气泡。用无菌水将测试的糖类配成10%的溶液，煮沸15 分钟，冷却后用无菌移液管吸取一定量的糖液分装于试管内的豆芽汁中的，使糖液浓度达到2%。再用接种环将新鲜的菌种接入以上发酵管中，每株菌做两个平行实验，以不加测试糖、不接菌的的发酵管作为空白对照，置于37℃培养，每天观察杜氏小管中是否有气泡产生。

②尿素分解实验

用接种环将供试菌接种于水解尿素琼脂斜面培养基上，每株菌做两个平行实验，以不接菌的试管斜面作为空白对照，置于37℃培养，每天观察培养基的变化，若斜面呈淡红色则实验为阳性，否则为阴性。

③酪蛋白分解实验

牛津杯检测法：将酪素培养基20mL均匀涂布于固体牛肉膏蛋白胨平板表面，37℃培养6h，4℃培养1h，成为检测平板。检测时在平板放置牛津杯，每杯中点200μL芽胞杆菌发酵上清液(液体LB，30%，180r/min，培养24h后4℃，12000r/min，20min)或粗蛋白溶液，30℃温箱培养1d后，观察透明圈大小。

④淀粉分解实验

取分解淀粉化合物平板培养基，用接种针在其上划线接种，每株菌做两个平行实验，以不划线接种的培养皿为空白对照，置于37℃倒置培养1—2周后，待菌落生长正常时，在菌落表面及其周围滴1—2滴鲁格斯碘液，观察现象，若菌落周围呈现出蓝色，则实验为阳性。

⑤明胶液化实验

将供试菌种穿刺接于明胶培养基中，每株菌做两个平行实验，以不接菌的试管作为空白对照，置于37℃培养箱中培养1—3周，观察液化的深度。

⑥盐耐受性实验

用接种环将测试菌种分别接于氯化钠浓度为0%，5%，10%的平板培养基中，每种菌做两个平行实验，其中以氯化钠浓度为0%的培养基，即无盐培养基作为对照，置于37℃恒温培养2周，观察两种氯化钠浓度培养基上是否有菌落生长。

⑦有机酸耐受性实验

用接种环将测试菌种分别接于冰醋酸浓度为0%，1%的平板培养基中，每种菌做两个平行实验，其中以冰醋酸浓度为0%的培养基，即正常培养基作为对照，置于37℃恒温培养2周，观察两种冰醋酸糖浓度培养基上是否有菌落生长。

⑧pH对其生长的影响

取不同pH的普通培养基平板，pH值分别为5、6、7、8、9、10，将过夜菌悬液稀释到最适菌落计数倍数，取100μL涂布于上述平板中，置于37℃，培养24h。取出进行菌落计数。

⑨温度对其生长的影响

取一定pH的普通培养基平板，将过夜菌悬液稀释到最适菌落计数倍数，取100μL涂布于上述平板中，分别置于15℃、28℃、37℃、43℃、55℃、65℃、100℃培养箱中，培养24h。取出进行菌落计数。

鉴定结果见表1、表2。

（5）16S rDNA鉴定

为了进一步研究该菌确切的种属、抑菌谱、抑菌物质的化学本质以及抑菌机理，进而设计寡核苷酸引物，进行PCR实验。

①细菌DNA的制备：1菌体培养：将此菌接种于普通液体培养基中，37℃振荡培养18h，获得足够菌体。2菌体收集：取1.5mL培养液于1.5mL离心管中，12000r/min离心30s，弃上清，收集菌体（注意吸干多余水分）。3向每管加入200μL裂解缓冲液（40mmol/L Tris-HCl，pH8.0，2mmol/L CH3COONa，1mmol/L EDTA，1%SDS），用吸管头迅速强烈抽吸，悬浮和裂解细胞，再加入50μL，100μg/mL溶菌酶，37℃处理30min。4加入10μL，10mg/mL蛋白酶K，37℃，30min。5加入66μL，5mol/L NaCl溶液，充分混匀后，12000r/min，10min。除去Pro复合物及细胞壁等残渣。6将上清转移到新管中，加入等体积Tris饱和苯酚，充分混匀后，12000r/min，3min，进一步沉淀Pro。7取离心后水层，加等体积氯仿，充分混匀，12000r/min，3min，除苯酚。8取上清，加2倍体积预冷的无水乙醇沉淀，30min以上（时间越长越好）。之后15000r/min高速离心15min，弃上清。9用400μL70%乙醇洗涤2次，12000r/min，2min，弃上清。10用真空干燥后，50μL超纯水溶解DNA，-20℃放置备用。

②PCR引物设计

根据大肠杆菌16S rDNA序列设计的PCR引物为：

上游引物8F：5’-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3’；

下游引物1492R：5’-ACGGTTACCTTGTTACGACTT-3’。

③PCR扩增

PCR反应的条件为：95℃预变性3min，然后95℃变性30s，54℃复性60s，72℃延伸90s，经30个循环后再72℃延伸5min。PCR扩增产物于1%琼脂糖凝胶电泳后进行观察

④琼脂糖凝胶电泳

（1）制胶：称取琼脂糖粉末，置于三角瓶中，加入TAE缓冲液配成1.5%的浓度，加热使琼脂糖全部融化于缓冲液中，待溶液温度降至65℃时，立即倒入制胶槽中，插入样品梳。在室温放置0.5-1h，待凝胶全部凝结后，轻轻拔出样品梳。然后在电泳槽中加入电泳缓冲液直到浸没凝胶为止。（2）加样：取5μL左右的样品，加入1μL的loading buffer，混匀后小心地加到样品槽中。同时加入标准DNAmarker，在同一凝胶板上进行电泳。（3）电泳：维持恒压100V，电泳0.5-1h，直到溴酚蓝指示剂移动到凝胶底部，停止电泳。（4）染色：将凝胶取出后浸入0.5mg/mL溴乙锭溶液中，染色0.5-1h。染液可反复多次使用。（5）观察：将凝胶板置于紫外灯下进行观察。DNA存在的位置呈现橙黄色荧光。

⑤16S rDNA测序

筛选得到的芽胞杆菌通过16S rDNA和Blast检测进行菌种鉴定。16S rDNA的纯化和测序由上海生工生物工程技术服务有限公司完成。

⑥序列比对

将获得的16S rDNA序列在GenBank中对比，使用N-J法构建序列进化树（图1），获得鉴定结果，结果表明该株菌有可能属于芽胞杆菌中新亚种。

使用的主要化学试剂：

蛋白胨，分析纯，天津市江天化工技术有限公司。

酵母浸提物，分析纯，天津市江天化工技术有限公司。

牛肉膏，分析纯，天津市江天化工技术有限公司。

葡萄糖（C₆H₁₂O₆），分析纯，天津市江天化工技术有限公司。

氯化钠（NaCl），分析纯，天津市江天化工技术有限公司。

三氯甲烷（CHCl₃），分析纯，天津市江天化工技术有限公司。

饱和酚，分析纯，天津市江天化工技术有限公司。

十二烷基硫酸钠（SDS），sigma分装，北京鼎国生物技术公司。

Tris-HCl，Genview分装，北京鼎国生物技术公司。

实施例2

抑菌物质基因的克隆

根据已发表的芽胞杆菌若干抑菌物质的基因设计引物、以芽胞杆菌DNA为模板，用PCR方法进行扩增，克隆并测定抑菌物质的基因。通过查阅相关文献，设计6对抗真菌基因引物，如表3所示。以芽胞杆菌BH072的DNA作为模板，用PCR反应扩增抗菌基因。PCR反应的条件为：95℃预变性3min，然后95℃变性30s，51℃复性60s，72℃延伸90s，经30个循环后再72℃延伸5min。PCR扩增产物于1%琼脂糖凝胶电泳后进行观察。将PCR产物克隆至pUCm-T Vector载体，重组质粒转化大肠杆菌DH5α，筛选含有重组质粒的转化子，提取其重组质粒，测定重组质粒中芽胞杆菌BH072的各抗菌肽基因的核苷酸序列。

表3芽胞杆菌抗真菌肽基因引物

测定重组质粒中芽胞杆菌BH072的各抗菌肽基因的核苷酸序列（SEQ ID NO.1(tasA)、NO.2(ituA)、NO.3(hag)）。

为了证明这株菌同时拥有该三种抗真菌基因的特殊性，我们将其与其他芽胞杆菌进行比较，结果见下表。

表4芽胞杆菌中抗真菌基因检测

‘+’indicates reaction-positive,‘-’indicates reaction-negative.

所用的主要试剂：

Taq DNA Ploymerase，上海生工生物工程有限公司。

dNTP、标准分子量核酸5000bp DNA Marker，上海生工生物工程有限公司。

实施例3

芽胞杆菌BH072抑菌谱的测定

使用牛津杯法进行抑菌试验。

为了测试抗真菌活性，将BH072菌株接种至10mL的LB液体培养基中，37℃,150rpm培养12h，然后转移到500mL摇瓶中进行发酵培养24h。在4200rpm，0℃条件下将发酵液离心30分钟，无菌上清液、即为抗菌物质粗提取液。接下来用牛津杯法检测抗菌物质活性。首先将1mL真菌孢子悬浮液均匀加入100mL40-50℃的PDA培养基中，并涂布在放有牛津杯的固体牛肉膏蛋白胨板上。凝固后，拔出牛津杯，并将5μL粗提取液加入牛津杯留下的孔中，30℃下培养48h，测量抑菌圈的直径。指示菌有黑曲霉、尖刀镰孢菌、腐霉、灰葡萄孢霉、黄瓜炭疽菌、酵母菌、青霉菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌。

抑菌谱如下表所示。

表5芽胞杆菌BH072的抑菌谱

‘+’indicates reaction-positive,‘-’indicates reaction-negative.

抑菌实验表明，芽胞杆菌BH072对黑曲霉、尖刀镰孢菌、灰葡萄孢霉、腐霉等植物病原菌有显著的杀菌作用，具有广谱抗菌性，经蛋白酶K处理表明抑菌产物属于蛋白质性质的物质。对细菌和酵母菌没有抑制作用。

实施例4

抗菌肽iturinA的纯化提取及其产量优化

从种子培养基中取5%接种量接种于发酵培养基中（1.0%蛋白胨，1.0%氯化钠和0.5%酵母浸提物），30℃，pH6.4，150rpm培养60h。4200rpm，4℃，离心20min后取上清。用浓HCl调节pH至2.0,至于4℃，过夜。4200rpm，4℃，离心20min后取沉淀，冷冻干燥。将残留物用甲醇抽提24h，取甲醇溶液进行LC-MS(Thermo Fisher Corporate,USA)。质谱分析表明，分子量1000-1100Da的物质为iturin A。甲醇抽提产物经60℃烘干后，进行称重，即可得iturin A的质量浓度mg/mL。对影响iturin A产量的发酵条件和培养基成分进行优化，优化后发酵条件为：接种量6%-7%，培养温度29℃-30℃，pH6.4-6.5，转速150rpm，培养60h；发酵培养基成分为0.90%-0.95%大豆粉，0.95%-1.00%蔗糖和0.90%-0.95%Mg²⁺。最终优化结果为iturin A的质量浓度达52.21mg/mL，与脂肽类抗真菌物质优化相比产量较高，比较结果见下表。

表6抗菌肽iturinA产量优化比较

使用的主要化学试剂：

大豆粉，分析纯，天津市江天化工技术有限公司。

蔗糖，分析纯，天津市江天化工技术有限公司。

氯化镁（MgCl₂），分析纯，天津市江天化工技术有限公司。

以上参照附图对本发明进行了示意性描述，该描述没有限制性。本领域的普通施工技术人员均能理解，在实际应用中，本发明中各部件的设置方式均可能发生某些改变，而其他人员在其启示下也可能做出相似设计。需要指出的是，只要不脱离本发明的设计宗旨，所有显而易见的改变及其相似设计，均包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种抗真菌肽高产菌株芽胞杆菌BH072（Bacillus sp.BH072）CGMCC No.8473。

2.一种采用权利要求1所述芽胞杆菌BH072（Bacillus sp.BH072）制备抗菌肽伊枯草菌素A（iturin A）的方法，其特征在于，采用发酵方法产生伊枯草菌素A（iturin A），从种子培养基中取6%-7%接种量接种于发酵培养基中，培养温度29℃-30℃，pH6.4-6.5，转速150rpm，培养60h，进行纯化提取。

3.根据权利要求2所述制备抗菌肽伊枯草菌素A（iturin A）的方法，其特征在于，所述发酵培养基成分为0.90%-0.95%大豆粉，0.95%-1.00%蔗糖和0.90%-0.95%Mg²⁺。

4.根据权利要求2所述制备抗菌肽伊枯草菌素A（iturin A）的方法，其特征在于，所述纯化提取采用甲醇抽提法提取发酵液中的伊枯草菌素A，并通过HPLC方法纯化获得高纯度产物。

5.根据权利要求4所述制备抗菌肽伊枯草菌素A（iturin A）的方法，其特征在于，所述甲醇抽提指将发酵液先于4200rpm，4℃，离心20min后取上清，再用浓HCl调节pH至2.0,至于4℃，过夜，然后4200rpm，4℃，离心20min后取沉淀，冷冻干燥，将残留物用甲醇抽提24h，甲醇抽提产物经60℃烘干后，进行称重，即可得iturin A的质量浓度。