CN103627659B

CN103627659B - 一种枯草芽孢杆菌及其在水稻稻曲病防治中的应用

Info

Publication number: CN103627659B
Application number: CN201310607370.7A
Authority: CN
Inventors: 杨秀娟; 陈福如; 甘林; 石妞妞; 阮宏椿; 杜宜新
Original assignee: Institute of Plant Protection of FAAS
Current assignee: Institute of Plant Protection of FAAS
Priority date: 2013-11-27
Filing date: 2013-11-27
Publication date: 2015-10-28
Anticipated expiration: 2033-11-27
Also published as: CN103627659A

Abstract

本发明公开了一种枯草芽孢杆菌及其在水稻稻曲病生物防治中的应用技术，涉及植物病害生物防治技术领域，提供了一种对稻曲病菌生长具有明显抑菌活性的枯草芽孢杆菌T122F，采用改良的细菌发酵液体培养基培养枯草芽孢杆菌T122F，其发酵滤液能明显抑制稻曲病菌分生孢子萌发和菌丝扩展，使用枯草芽孢杆菌T122F对田间稻曲病具有较好防治效果，防治效果显著高于10%苯醚甲环唑水分散粒剂的正常使用剂量。本发明提供的枯草芽孢杆菌及其发酵液为制备防治水稻稻曲病的生物农药提供参考，本发明扩大了枯草芽孢杆菌T122F的应用范围，对保障我国水稻粮食的安全生产和增产，减少因化学农药的大量投入使用产生的环境污染等问题起着重要的意义。

Description

一种枯草芽孢杆菌及其在水稻稻曲病防治中的应用

技术领域

本发明涉及植物病害生物防治技术领域，更具体涉及一种枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）及其在水稻稻曲病生物防治中的应用。

背景技术

稻曲病(Ustilaginoidea virens (Cooke) Tak)为水稻穗部的真菌病害，又称假黑穗病、绿黑穗病，俗称“丰收病”。在中国、日本、菲律宾、印度、美国、澳大利亚、埃及、英国等五大洲40多个国家的水稻生产区都有分布。稻曲病也是近10年来在我国上升的主要水稻病害，特别是近年来，该病在我国常年危害面积为560~640万公顷，大流行年份发生与危害面积可达1000万公顷。一般田块的病穗率约为3%~5%，发病较重的田块病穗率高达90%，直接产量损失可达50%以上，有的甚至绝收，经济损失巨大。稻曲病发生不仅降低稻谷产量及米质，而且混杂于稻谷中的病粒及其病菌能产生对人畜有致畸作用的毒素，人畜食用这种稻米较多时会发生慢性中毒，影响健康。稻曲病的发生、流行及为害程度与(25~30℃)、高湿、寡日照利于病菌孢子萌发和侵染，开花期多阴天并带有降水有利于发病。

选用适量的化学农药是目前防治稻曲病的主要措施。目前生产中使用的药剂很多，铜制剂和有机锡等一些农药是防治稻曲病的有效药剂，但这些药剂对即将收获的稻谷残留及其重金属对周边植物的药害、环境的安全及人体的伤害均是令人关注的问题。目前国内外对稻曲病的生物防治研究较少，生产上发现用于防治水稻纹枯病的纹曲宁对水稻稻曲病具有一定的防治效果，纹曲宁是由枯草芽孢杆菌与井岗霉素进行复配而成的微生物农药，但纹曲宁中的井岗霉素是纹枯病的有效药剂，对稻曲病防治效果不理想，推测起防治作用的可能是枯草芽孢杆菌。

稻曲病菌的孢子有三种类型，分别是厚垣孢子、薄壁分生孢子和子囊孢子，厚垣孢子和子囊孢子萌发后均可形成薄壁的分生孢子，分生孢子萌发产生芽管能形成次生分生孢子。分生孢子目前被认为是稻曲病菌有效的侵染形态，稻曲病的分生孢子可以在水稻孕穗期幼颖的颖壳表面形成菌丝并伸展到颖壳内部[代光辉等. 稻曲病不同抗性水稻品种的组织化学及分生孢子侵染途径的初步观察. 植物病理学报, 2005,35(1): 37-42]，在水稻孕穗期采用人工喷雾接种和注射接种方法证实了稻曲病菌的分生孢子能引起水稻发病并产生稻曲球病粒 [王疏等. 稻曲病接种菌源及接种方法的研究. 辽宁农业科学, 1996（l）:33-35；杨秀娟等. 水稻稻曲病室内人工接种技术.植物保护学报, 2011,38(5):395-400] 。

前期研究发现，稻曲病菌分生孢子在含有枯草芽孢杆菌菌体的水琼脂培养基平板上不能正常萌发，表现为不萌发或已萌发产生的芽管短而干缩，说明在枯草芽孢杆菌菌体存在下，分生孢子萌发受抑制。在PSA培养基平板中，稻曲病菌菌落与枯草芽孢杆菌对峙生长4天后，在两者中间能产生宽度值约11mm的抑菌带，对峙生长20天后发现，稻曲病菌菌落形态萎缩，菌落边缘菌丝畸形膨大，原生质溢出，表明枯草芽孢杆菌产生的代谢物质也能抑制病菌菌丝的生长，并能杀死菌丝（附图1）。

枯草芽孢杆菌是一类嗜温、好氧或兼性厌氧的腐生细菌，在自然界中分布广泛，极易分离培养，对人畜无害，不污染环境。能够产生对热、紫外线、电磁辐射有很强抗性的芽孢，耐受各种不良的环境条件。产生多种抗菌素（如抗真菌肽、脂肽抗生素、小分子的多糖物质、大分子的抗菌蛋白）和酶（如蛋白酶、淀粉酶、酯酶、几丁质酶及乙酰基氨基葡糖苷酶等细胞壁降解酶），具有广谱抗菌活性和极强的抗逆能力。对植物多种病原菌（如香蕉枯萎病菌、小麦白粉病菌，稻瘟病菌、棉花立枯病菌、大豆根腐病菌、番茄灰霉病菌、辣椒炭疽病菌等）产生抑制，已经在黄瓜、辣椒、香蕉、水稻、小麦、玉米、棉花等农作物主要病害上表现出很好的防治效果。目前利用枯草芽孢杆菌及其菌剂生物防治水稻稻曲病的研究和应用较少，利用本发明的枯草芽孢杆菌及其代谢产物对稻曲病菌孢子萌发和菌丝生长的抑制作用，开发稻曲病菌的生防微生物菌剂用于农业生产，对保障我国水稻粮食的安全生产和增产，减少因化学农药的大量投入使用产生的环境污染等问题起着重要的意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种对水稻稻曲病菌具有较强抑制活性的枯草芽孢杆菌及其在稻曲病生物防治中的应用，利用本发明的枯草芽孢杆菌及其代谢产物对稻曲病菌孢子萌发和菌丝生长的抑制作用，开发稻曲病菌的生防微生物菌剂用于农业生产，解决使用化学农药对人、畜、环境等的危害，保障我国水稻粮食的安全生产和增产，减少因化学农药的大量投入使用产生的环境污染等问题。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

1.本发明的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）T122F菌株，其16s rDNA序列如SEQ ID NO:1所示。

2. 本发明的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）T122F菌株，已经于2009年4月19日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其简称CGMCC，保藏编号为：CGMCC No.3043。

3. 本发明的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）T122F菌株形态学鉴定：如下表1中所示：

表1 细胞形态和生理生化试验结果

所述枯草芽孢杆菌T122F菌株从香蕉植株体内分离筛选获得。

所述枯草芽孢杆菌T122F菌株用于抑制水稻稻曲病菌的生长及其病害的防治。

所述的枯草芽孢杆菌的选育方法为：切取健康香蕉植株假茎3-5g，用无菌水冲洗晾干后，用70% V/V酒精表面消毒20-40S后，再用0.1wt.%升汞表面消毒2-4min，无菌水冲洗3次后晾干；样品加10-15ml无菌水碾碎，静止15-20min，取50ul涂于KB培养基平板中，28℃黑暗培养48~72h，根据枯草芽孢杆菌的菌落形态、颜色等挑取单菌落，按常规方法用NA培养基进行菌株纯化和保存；菌株对稻曲病病原菌的生物测定采用平板对峙生长法，即在直径为9cm的PSA固体培养基平板中央接入直径为8mm的病原真菌菌块，同时在距菌块两侧2cm处用接种环点接一小环在28℃，NA培养基上培养24-26h的待测菌株菌落，接着28℃下黑暗培养6-8d，筛选获得对稻曲病菌生长具有明显抑制作用的枯草芽孢杆菌T122F。

所述的KB培养基配方为：蛋白胨20.0g，MgSO₄·7H₂O 1.5g，K₂HPO₄·H₂O 1.8g，甘油10.0ml，琼脂16.0~18.0g，蒸馏水1000.0ml，pH7.0-7.2；

培养用的NA培养基配方为：NA：蛋白胨5.0g,牛肉浸膏3.0g，葡萄糖2.5g，琼脂16.0~18.0g，蒸馏水1000.0ml，pH 7.0~7.2；

对峙培养用的PSA固体培养基配方为：马铃薯200.0g，蔗糖20.0g，琼脂20g，蒸馏水1000.0ml，pH 7.0~7.2。

所述枯草芽孢杆菌T122F菌株在抑制水稻稻曲病菌生长作用中的具体步骤为：

（1）T122F菌株培养：将所述T122F菌株在37℃条件下用改良细菌发酵液体培养基振荡培养3天，培养液含菌量约为50~100亿活芽孢/mL，获得的发酵培养液4℃保存备用；

（2）T122F无菌培养滤液制作：将所述T122F菌株在37℃条件下用改良细菌发酵液体培养基振荡培养3天，发酵液用无菌的双层滤纸过滤后，在10000rpm条件下离心10-20min，取离心后的上清液，用0.22μm滤膜过滤除菌，得到无菌体上清液，4℃保存备用；

（3）稻曲病菌的分离和培养：从水稻田中采集新鲜的黄色、黄绿色或绿色稻曲球，采用改良的厚垣孢子悬浮液法分离稻曲病菌；用无菌挑针刮取单粒稻曲球表面上的厚垣孢子粉，置于无菌培养皿中，加入0.5mL的无菌水悬浮制成厚垣孢子悬浮液，将厚垣孢子悬浮液与无菌水按1：5比例稀释2～3个梯度，用移液枪吸已稀释好的厚垣孢子悬浮液0.2mL于分离用胁本哲氏固体培养基表面，并用无菌玻璃三角棒均匀涂抹，再将含有上述培养基的培养皿倒置放入恒温箱中28℃黑暗培养6-7天，用尖头挑针挑取黄色或白色小菌落移至培养用PSA固体培养基中纯化培养10-11天；用直径5 mm的打孔器在分离到的稻曲病菌菌落边缘打取菌饼，用接种针将菌饼3块接入到PSB液体培养基中，28 ℃，150rpm，恒温振荡培养7-8d，培养液中即产生大量的分生孢子；用双层无菌纱布滤去菌丝，收集滤液，用无菌水稀释孢子悬浮液，使分生孢子终浓度为4-6×10⁶个/mL，备用；

（4）含稻曲病菌分生孢子培养基的制作：吸取步骤（3）中的稻曲病菌分生孢子悬浮液1mL加入45-55℃的99 mL PSA固体培养基中，混匀，然后倒入15-25 mL 的培养基于直径9cm的无菌培养皿中，制成含病菌孢子的PSA平板；

（5）T122F无菌培养滤液对稻曲病菌分生孢子萌发的抑制作用测定：在步骤（4）的含病菌孢子的PSA平板中央放置1个6mm×8mm×10mm无菌牛津杯，待牛津杯自然沉降10-15min，往每个牛津杯中加入步骤（2）的 T122F无菌发酵滤液200μL，28 ℃，黑暗培养4-5d后，测量各个处理的抑菌圈直径。

所述的改良细菌发酵液体培养基配方组成为：豆粕40g，玉米粉20g，氯化钠5g，乳糖2g，碳酸钙2g，蛋白胨3g，酵母粉5g，硫酸亚铁含七水 0.3g，硫酸镁0.5g，磷酸二氢钾0.5g，加水定容至1000mL，pH6.5~6.8，在121℃下高压湿热灭菌35-45min备用；

分离用的胁本哲氏培养基的配方为：马铃薯300g、蛋白胨5g、蔗糖 15g、Ca(NO₃)₂·4H₂O 0.5g、Na₂HPO₄·12H₂0 2.0g、琼脂16g、加水定容至1000mL，在121℃下高压湿热灭菌20～25min，待培养基冷却至45℃～50℃时加入抑制细菌生长的氯霉素50μg/ml混匀，倒入培养皿中凝固后备用；

培养用的PSA固体培养基的配方为：马铃薯200g、琼脂20g、蔗糖20g、加水定容至1000mL，在121℃下高压湿热灭菌20-30min后备用；

培养用的PSB液体培养基的配方为：马铃薯200g、蔗糖20g、加水定容至1000mL，在121℃下高压湿热灭菌20-30min后备用。

所述枯草芽孢杆菌T122F菌株在田间水稻稻曲病防治中的应用，具体步骤为：将T122F发酵液与清水按1：100倍稀释后，在水稻稻曲病常发病田进行试验，在水稻破口前5～7d第一次用药，在50%水稻齐穗后再次施药一次；采用手动喷雾器，全株均匀喷施，每公顷用水量750-800L；在水稻黄熟期时调查不同处理的水稻稻曲病的病穗数及病穗的病粒数。

本发明的优点在于：枯草芽孢杆菌T122F对稻曲病菌菌丝生长、孢子萌发具有很强的抑制作用，培养出的枯草芽孢杆菌T122F发酵液在水稻孕穗期和抽穗期采用喷雾处理方式对田间水稻稻曲病菌具有较好的防治效果。本发明提供的枯草芽孢杆菌及其发酵液为制备和研发防治水稻稻曲病的生物农药提供参考，本发明扩大了枯草芽孢杆菌T122F的应用范围。

附图说明

图1：枯草芽孢杆菌T122F菌株对稻曲病菌菌丝生长的抑制情况；

1-a: 枯草芽孢杆菌T122F和稻曲病菌平板对峙4天；

1-b：枯草芽孢杆菌T122F和稻曲病菌平板对峙22天；

1-c：健康的稻曲病菌菌丝；

1-d：被抑制生长的稻曲病菌菌丝；

1-e：被抑制的菌丝膨大畸形。

图2：枯草芽孢杆菌T122F发酵液对稻曲病菌分生孢子萌发的抑制情况；

2-a: T122F菌株发酵滤液处理的抑菌圈；

2-b: BS菌株发酵滤液处理的抑菌圈；

2-c: 发酵液体培养基对照；

2-d: 墨水显色圈对比；

2-e：抑菌圈中分生孢子萌发畸形。

具体实施方式

实施例1：枯草芽孢杆菌T122F对稻曲病菌分生孢子萌发的抑制作用

一、材料与方法

1、供试培养基

（1）枯草芽孢杆菌培养用的改良细菌发酵液体培养基配方组成为：豆粕40g，玉米粉20g，氯化钠5g，乳糖2g，碳酸钙2g，蛋白胨3g，酵母粉5g，硫酸亚铁（七水）0.3g，硫酸镁0.5g，磷酸二氢钾0.5g，加水定容至1000mL，pH6.5，在121℃下高压湿热灭菌35min后备用。

（2）稻曲病菌分离用的胁本哲氏培养基配方组成为：马铃薯300g、蛋白胨5g、蔗糖 15g、Ca(NO₃)₂·4H₂O 0.5g、Na₂HPO₄·12H₂0 2.0g、琼脂16g、加水定容至1000mL，在121℃下高压湿热灭菌20min，待培养基冷却至45℃时加入抑制细菌生长的氯霉素50μg/ml混匀，倒入培养皿中凝固后备用。

(3) 稻曲病菌培养用的PSA固体培养基的配方组成为：马铃薯200g、琼脂20g、蔗糖20g、加水定容至1000mL，在121℃下高压湿热灭菌20min后备用。

(4) 稻曲病菌培养用的PSB液体培养基的配方组成为：马铃薯200g、蔗糖20g、加水定容至1000mL，在121℃下高压湿热灭菌20min后备用。

（2）供试芽孢杆菌发酵培养滤液的制备

分别将本发明的枯草芽孢杆菌T122F和对照菌株枯草芽孢杆菌BS（市售得到的枯草芽孢杆菌）用改良细菌发酵液体培养基在接种量2%、培养温度37℃、通气量20%、转速220rpm条件下振荡培养3天，发酵液用无菌的双层滤纸过滤后，在10000rpm条件下离心10min后，取离心后的上清液，用0.22μm滤膜过滤除菌，得到无菌体上清液，4℃保存备用。

2、稻曲病菌的分离和培养

从水稻田中采集新鲜的黄色、黄绿色或绿色稻曲球，采用改良的厚垣孢子悬浮液法分离稻曲病菌。用无菌挑针刮取单粒稻曲球表面上的厚垣孢子粉，置于无菌培养皿中，加入0.5mL的无菌水悬浮制成厚垣孢子悬浮液，将厚垣孢子悬浮液与无菌水按1：5比例稀释3个梯度后，用移液枪吸已稀释好的厚垣孢子悬浮液0.2mL于分离用胁本哲氏固体培养基表面，并用无菌玻璃三角棒均匀涂抹，再将含有上述培养基的培养皿倒置放入恒温箱中28℃黑暗培养6天后，用尖头挑针挑取黄色或白色小菌落移至培养用PSA固体培养基中纯化培养10天。用直径5 mm的打孔器在分离到的稻曲病菌菌落边缘打取菌饼，用接种针将菌饼3块接入到PSB液体培养基中，28 ℃，150 rpm，恒温振荡培养7 d后，培养液中即可产生大量的分生孢子。用双层无菌纱布滤去菌丝，收集滤液，用无菌水稀释孢子悬浮液，使分生孢子终浓度约为5×10⁶个/mL。

3、含稻曲病菌分生孢子培养基的制作

吸取稻曲病菌分生孢子悬浮液1mL加入55 ℃的PSA培养基（99 mL）中，混匀，然后倒入约20 mL 的培养基于培养皿中，制成含病菌孢子的PSA平板。

4、枯草芽孢杆菌无菌培养滤液对稻曲病菌分生孢子萌发的抑制作用测定

在含病菌孢子的PSA平板中央放置1个无菌牛津杯（6mm×8mm×10mm），待牛津杯自然沉降10 min后，往每个牛津杯中加入枯草芽孢杆菌无菌发酵滤液200 μL，28 ℃，黑暗培养4d后，采用十字交叉法测量各处理的抑菌圈直径。每个处理重复4次，以牛津杯加入改良细菌发酵液体培养基的离心上清液200 μL作为对照，以牛津杯加入墨汁200 μL作为显色圈直径对比。

二、结果与分析

试验结果如表2所示，在含菌的PSA平板中，T122F菌株发酵滤液处理的平板具有较大的抑菌圈，抑菌圈直径平均达2.83 cm，用于对比试验的枯草芽孢杆菌BS发酵滤液处理的平板，形成的抑菌圈直径平均达2.03 cm，改良细菌发酵液体培养基的离心上清液对无透明的抑菌圈形成，用墨汁处理能形成直径为3.2cm的抑菌圈。显微镜观察发现抑菌圈中的分生孢子萌发产生的芽管畸形、膨大，甚至断裂，无菌丝扩展（图2）。说明枯草芽孢杆菌T122F发酵滤液对稻曲病菌的孢子萌发具有较强的抑菌活性。

表2 T122F发酵滤液对稻曲病菌分生孢子萌发的抑制情况（4天）

*注：对照平板菌落直径为8.8cm。

实施例2：枯草芽孢杆菌T122F发酵液对水稻稻曲病的田间防治效果测定

一、材料与方法

1、供试的枯草芽孢杆菌T122F发酵液

枯草芽孢杆菌T122F发酵液体培养基组成及菌株的培养条件同实施例1。

2、供试的杀菌剂

250克/升戊唑醇水乳剂由安徽绩溪农华生物科技有限公司提供，10wt.%苯醚甲环唑水分散粒剂由安徽绩溪农华生物科技有限公司提供，2.5wt.%井岗霉素、100亿枯草活芽孢水剂（纹曲宁）由江苏省苏科农业有限责任公司提供。

3、枯草芽孢杆菌T122F发酵液与不同杀菌剂对水稻稻曲病田间药效测定

在福建省建阳市麻纱镇水稻稻曲病常发病田进行试验，试验地为壤质土，肥力中等，正常肥水管理，在试验期间无防治其他病虫。试验水稻品种为甬优9号。每处理小区面积100 m²，小区随机排列，4次重复。在水稻破口前7d第一次用药，50%水稻齐穗后再次施药一次。采用“利农牌”DH400型可控压手动喷雾器，全株均匀喷施，每公顷用水量750L。枯草芽孢杆菌T122F发酵液施用量为7500 mL/hm²；250克/升戊唑醇水乳剂施药量为450 mL/hm²；10%苯醚甲环唑水分散粒剂施药量为450 g/hm²；纹曲宁水剂施药量为6000mL/hm²，以清水为对照。

在水稻黄熟期进行发病情况调查。按平行跳跃取样法，每小区共查30丛，调查不同处理的水稻稻曲病的病穗数及病穗的病粒数，统计病穗率和病穗平均病粒数，依据病穗率计算防治效果。

防治效果（%）=［（CK病穗率—处理病穗率）÷ CK病穗率］×100

二、结果与分析

从表3可以看出，枯草芽孢杆T122F发酵液、2.5%井岗霉素.100亿枯草活芽孢水剂和250克/升戊唑醇水乳剂对水稻稻曲病具有较好的田间防治效果，防效分别为88.93%、87.87%和84.65%，而10%苯醚甲环唑水分散粒剂对水稻稻曲病田间防治效果较差，防治效果70.11%。与其它3种杀菌剂处理相比，枯草芽孢杆T122F发酵液处理的病穗平均病粒数最低，为1.32粒。说明枯草芽孢杆T122F发酵液在田间水稻破口前7d和50%水稻齐穗后各施药一次，能有效防治水稻稻曲病。

表3 枯草芽孢杆菌T122F发酵液与不同杀菌剂对水稻稻曲病田间防效比较

注：表中的小写字母表示0.05水平下的显著性差异。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 福建省农业科学院植物保护研究所

<120> 一种枯草芽孢杆菌及其在水稻稻曲病防治中的应用

<130> 1

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1353

<212> DNA

<213> 枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）

<400> 1

tgctccatga ttcagcggcg gacgggtgag taatgcctag gaatctgcct ggtagtgggg 60

gacaacgttt cgaaaggaac gctaataccg catacgtcct acgggagaaa gtgggggatc 120

ttcggacctc acgctatcag atgagcctag gtcggattag ctagttgttg aggtaaaggc 180

tcaccaaggc gacgatccgt aactggtctg ataggatgat cagtccacct ggaactgaga 240

cacggtccag actcctacgg gaggcagcag tggggaatat tggagaatgg gcgaaaggct 300

gatccagcca tgccgcgtgt gtgaagaagg tcttcggatt gtaaagcact ttaagttggg 360

aggaagggca gttagttaat accttgctgt tttgacgtta ccaacagaat aagcaccggc 420

taacttcgtg ccagcagccg cggtaatacg aagggtgcaa gcgttaatcg gaattactgg 480

gcgtaaagcg cgcgtaggtg gttcgttaag ttggatgtga aagccccggg ctcaacctgg 540

gaactgcatc caaaactggc gagctagagt atggcagagg gtggtggaat ttcctgtgta 600

gcggtgaaat gcgtagatat aggaaggaac accagtggcg aaggcgacca cctgggctaa 660

tactgacact gatgtgcgaa agcgtgggga gcaaacagga ttagataccc tggtagtcca 720

cgccgtaaac gatgtcgact agccgttggg atccttgaga tcttagtggc gcagctaacg 780

cattaagtcg accgcctggg gagtacggcc gcaaggttaa aactcaaatg aattgacggg 840

ggcccgcaca agcggtggag catgtggttt aattcgaagc aacgcgaaga accttaccag 900

gccttgacat gcagagaact ttccagagat ggattggtgc cttcgggaac tctgacacag 960

gtgctgcatg gctgtcgtca gctcgtgtcg tgagatgttg ggttaagtcc cgtaacgagc 1020

gcaacccttg ttcttagtta ccagcacgtt aaggtgggca ctctaaggag actgccggtg 1080

acaaaccgga ggaaggtggg gatgacgtca agtcatcatg gcccttacgg cctgggctac 1140

acacgtgcta caatggtcgg tacaaagggt tgccaagccg cgaggtggag ctaatcccat 1200

aaaaccgatc gtagtccgga tcgcagtctg caactcgact gcgtgaagtc ggaatcgcta 1260

gtaatcgtga atcagaatgt cacggtgaat acgttcccgg gccttgtaca caccgcccgt 1320

cacaccatgg gagtggtttg ctccagaagt agc 1353

Claims

1.一种枯草芽孢杆菌的应用，其特征在于：所述枯草芽孢杆菌T122F菌株用于抑制水稻稻曲病菌的生长及其病害的防治；所述枯草芽孢杆菌T122F菌株的保藏号为CGMCC No.3043，其16s rDNA序列如SEQ ID NO:1所示。

2.一种如权利要求1所述的枯草芽孢杆菌的应用，其特征在于：所述枯草芽孢杆菌T122F菌株在抑制水稻稻曲病菌生长作用中的具体步骤为：

（3）稻曲病菌的分离和培养：从水稻田中采集新鲜的黄色、黄绿色或绿色稻曲球，采用改良的厚垣孢子悬浮液法分离稻曲病菌；用无菌挑针刮取单粒稻曲球表面上的厚垣孢子粉，置于无菌培养皿中，加入0.5mL的无菌水悬浮制成厚垣孢子悬浮液，将厚垣孢子悬浮液与无菌水按1：5比例稀释2～3个梯度，用移液枪吸已稀释好的厚垣孢子悬浮液0.2mL于分离用胁本哲氏固体培养基表面，并用无菌玻璃三角棒均匀涂抹，再将含有上述培养基的培养皿倒置放入恒温箱中28℃黑暗培养6-7天，用尖头挑针挑取黄色或白色小菌落移至培养用PSA固体培养基中纯化培养10-11天；用直径5 mm的打孔器在分离到的稻曲病菌菌落边缘打取菌饼，用接种针将菌饼3块接入到PSB液体培养基中，28 ℃，150 rpm，恒温振荡培养7-8d，培养液中即产生大量的分生孢子；用双层无菌纱布滤去菌丝，收集滤液，用无菌水稀释孢子悬浮液，使分生孢子终浓度为4-6×10⁶个/mL，备用；

（4）含稻曲病菌分生孢子培养基的制作：吸取步骤（3）中的稻曲病菌分生孢子悬浮液1mL加入45-55℃的99 mL PSA培养基中，混匀，然后倒入15-25 mL 的培养基于直径9cm的无菌培养皿中，制成含病菌孢子的PSA平板；

3.根据权利要求2所述的枯草芽孢杆菌的应用，其特征在于：所述的改良细菌发酵液体培养基配方组成为：豆粕40g，玉米粉20g，氯化钠5g，乳糖2g，碳酸钙2g，蛋白胨3g，酵母粉5g，硫酸亚铁含七水 0.3g，硫酸镁0.5g，磷酸二氢钾0.5g，加水定容至1000mL，pH6.5~6.8，在121℃下高压湿热灭菌35-45min备用；

胁本哲氏培养基的配方为：马铃薯300g、蛋白胨5g、蔗糖 15g、Ca(NO₃)₂·4H₂O 0.5g、Na₂HPO₄·12H₂0 2.0g、琼脂16g、加水定容至1000mL，在121℃下高压湿热灭菌20～25min，待培养基冷却至45℃～50℃时加入抑制细菌生长的氯霉素50μg/ml混匀，倒入培养皿中凝固后备用；

PSA固体培养基的配方为：马铃薯200g、琼脂20g、蔗糖20g、加水定容至1000mL，在121℃下高压湿热灭菌20-30min后备用；

PSB液体培养基的配方为：马铃薯200g、蔗糖20g、加水定容至1000mL，在121℃下高压湿热灭菌20-30min后备用。

4.一种如权利要求1所述的枯草芽孢杆菌的应用，其特征在于：所述枯草芽孢杆菌T122F菌株在田间水稻稻曲病防治中的应用，具体步骤为：将T122F发酵液与清水按1：100倍稀释后，在水稻稻曲病常发病田进行试验，在水稻破口前5～7d第一次用药，在50%水稻齐穗后再次施药一次；采用手动喷雾器，全株均匀喷施，每公顷用水量750-800L；在水稻黄熟期时调查不同处理的水稻的病穗数及病穗的病粒数。