CN107400681A - 一种水稻纹枯病的生物防控技术 - Google Patents

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Abstract

一种水稻纹枯病的生物防控技术，涉及水稻病虫害的生物防治技术领域，包括以下步骤：制备NA固体培养基、制备LB液体培养液、制备种子液、制备发酵液、制备发酵液提取物、制备混配剂、制备鸭粪提取物、水稻定殖。发酵提取物混配井冈霉素对水稻纹枯病菌的防治具有协同作用，能显著增强井冈霉素对水稻纹枯病的防治效果，为提高井冈霉素对水稻纹枯病的防治效果提供了一定的理论依据，并为拓展拮抗细菌生物农药的应用提供了一条有效途径。鸭粪提取物对水稻纹枯病菌有抑制作用，其中鸭粪乙醇提取物对水稻纹枯病原菌的最高抑制率可达80％以上。

Description

一种水稻纹枯病的生物防控技术
技术领域
本发明涉及水稻病虫害的生物防治技术领域，具体涉及一种水稻纹枯病的生物防控技术。
背景技术
水稻纹枯病，是影响我国水稻生长的常见病害，一般情况下水稻纹枯病会致使水稻减产10％-20％，严重时往往导致水稻倒伏枯死，减产量高达到50％-60％，对我国农业生产造成了巨大的经济损失。
然而，目前防治水稻纹枯病的有效药剂比较单一，主要是井冈霉素。由于长期使用，水稻纹枯病菌对井冈霉素产生了一定程度的抗药性，单一的井冈霉素对水稻纹枯病的防效已明显减弱，使得每年使用的次数逐渐增多，使用量也显著增加。因此，为了提高水稻纹枯病的防效，研发高效的新型药剂已迫在眉睫。生物防治是一种高效、安全控制水稻纹枯病的方法。近年来，国内外专家对水稻纹枯病拮抗菌进行了大量研究，取得了较大成果，然而，研究表明单一的生物防治效果并不理想，常常表现出较大的变异。
发明内容
为了解决现有技术中单一的生物防治存在的问题，本发明提供了一种水稻纹枯病的生物防控技术，采用混配剂混用防治水稻纹枯病具有增效效果。
本发明采用以下技术方案：
一种水稻纹枯病的生物防控技术，包括以下步骤：
步骤一：制备NA固体培养基，采用蛋白胨10.0g、牛肉粉3.0g、氯化钠5.0g、琼脂15.0g、葡萄糖2.5g，加蒸馏水溶解，定容至1L，PH调至7±0.1，分装后121℃灭菌20min；
步骤二：制备LB液体培养液，在950ml去离子水中加入胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaCl10g，搅拌直至溶质溶解，用5mol/LNaOH调pH至7.0，用去离子水定容至1L，在15psi高压下蒸汽灭菌21min；
步骤三：将拮抗细菌在NA固体培养基上于37℃活化24h，用无菌水制成菌体悬浮液，取10mL菌体悬浮液接种到装有100mLLB液体培养液的250mL锥形瓶中，在28℃的恒温条件下以220r/min的速率震荡培养48h，得到种子液；
步骤四：种子液以10％的接种量接入装有300mLLB液体培养液的1000mL锥形瓶中，磁力搅拌，转速为1000r/min，置于28℃的振荡培养箱中连续培养84h，得发酵液；
步骤五：将发酵液和乙酸乙酯以质量比1:2充分混匀萃取48h，取萃取液于40℃旋转蒸发仪中，以110r/min的转速旋转蒸发至膏状，用无菌水溶解，配成质量浓度为1000mg/L的发酵液提取物，置于4℃冰箱保存备用；
步骤六：在无菌条件下，将发酵液提取物和质量浓度500mg/L的井冈霉素按质量比4:1混合均匀得混配剂；
步骤七：称取鸭粪粉末500g，按质量比1:4加入2000mL无水乙醇，50℃浸提24h，抽滤，滤渣用2000mL无水乙醇复提取1次，合并滤液，用旋转蒸发仪减压浓缩至浸膏状，得粗提物于4℃保存备用；
步骤八：称取10g粗提物，用有机溶剂溶解后装入500mL容器中，用乙酸乙酯萃取4次，每次100mL，合并有机相，减压浓缩至浸膏状，制得乙酸乙酯组分，再用丙酮配制成80mg·mL-1，既得鸭粪提取物药液；
步骤九：水稻种子用质量浓度70％的乙醇溶液浸泡2min，然后用质量浓度3％的次氯酸钠水溶液浸泡30min，期间用玻璃棒搅动，无菌水冲洗3次，第3次冲洗持续10min，过夜干燥，置于铺有两层湿润滤纸片的培养皿中，再放于37℃恒温培养箱培养4d直至发芽，最后将发芽的水稻种子播种于田地，在水稻生长的第10、20、50和80天向水稻叶面喷洒混配剂，并在水稻生长的第20天向水稻叶面喷洒鸭粪提取物药液。
优选的，所述的拮抗细菌为拮抗细菌SU8。
优选的，所述的拮抗细菌SU8为铜绿假单胞菌。
本发明的有益效果在于：
1)发酵提取物混配井冈霉素对水稻纹枯病菌的防治具有协同作用，能显著增强井冈霉素对水稻纹枯病的防治效果，为提高井冈霉素对水稻纹枯病的防治效果提供了一定的理论依据，并为拓展拮抗细菌生物农药的应用提供了一条有效途径。
2)鸭粪提取物对水稻纹枯病菌有抑制作用，其中鸭粪乙醇提取物对水稻纹枯病原菌的最高抑制率可达80％以上。
3)本发明的方法可以调控水稻植株的生长发育进程，包含有益的细茵群落在植株生长中具有促生、抗病、抗逆等功能。根据植物微生态理论，这些细菌和宿主之间在长期的进化过程中能够建立互惠互利的关系。从生物间巧生互作等关系考虑，这些细菌将更有利于生物的定殖，可更好地发挥生防作用。
4)本发明采用生物防治是发展绿色水稻产业的重要手段，拮抗细菌是防治水稻纹枯病的重要生防微生物。从植物中寻找具有生物活性的化合物，直接将其发成为新农药，是目前农药研发的一条重要途径。
具体实施方式
下面通过对实施例的描述，对本发明作进一步详细的说明，以帮助本领域技术人员对本发明的发明构思、技术方案有更完整、准确和深入的理解。
实施例1
一种水稻纹枯病的生物防控技术，包括以下步骤：
步骤一：制备NA固体培养基，采用蛋白胨10.0g、牛肉粉3.0g、氯化钠5.0g、琼脂15.0g、葡萄糖2.5g，加蒸馏水溶解，定容至1L，PH调至7±0.1，分装后121℃灭菌20min；
步骤二：制备LB液体培养液，在950ml去离子水中加入胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaCl10g，搅拌直至溶质溶解，用5mol/LNaOH调pH至7.0，用去离子水定容至1L，在15psi高压下蒸汽灭菌21min；
步骤三：将拮抗细菌在NA固体培养基上于37℃活化24h，用无菌水制成菌体悬浮液，取10mL菌体悬浮液接种到装有100mLLB液体培养液的250mL锥形瓶中，在28℃的恒温条件下以220r/min的速率震荡培养48h，得到种子液；
步骤四：种子液以10％的接种量接入装有300mLLB液体培养液的1000mL锥形瓶中，磁力搅拌，转速为1000r/min，置于28℃的振荡培养箱中连续培养84h，得发酵液；
步骤五：将发酵液和乙酸乙酯以质量比1:2充分混匀萃取48h，取萃取液于40℃旋转蒸发仪中，以110r/min的转速旋转蒸发至膏状，用无菌水溶解，配成质量浓度为1000mg/L的发酵液提取物，置于4℃冰箱保存备用；
步骤六：在无菌条件下，将发酵液提取物和质量浓度500mg/L的井冈霉素按质量比4:1混合均匀得混配剂；
步骤七：称取鸭粪粉末500g，按质量比1:4加入2000mL无水乙醇，50℃浸提24h，抽滤，滤渣用2000mL无水乙醇复提取1次，合并滤液，用旋转蒸发仪减压浓缩至浸膏状，得粗提物于4℃保存备用；
步骤八：称取10g粗提物，用有机溶剂溶解后装入500mL容器中，用乙酸乙酯萃取4次，每次100mL，合并有机相，减压浓缩至浸膏状，制得乙酸乙酯组分，再用丙酮配制成80mg·mL-1，既得鸭粪提取物药液；
步骤九：水稻种子用质量浓度70％的乙醇溶液浸泡2min，然后用质量浓度3％的次氯酸钠水溶液浸泡30min，期间用玻璃棒搅动，无菌水冲洗3次，第3次冲洗持续10min，过夜干燥，置于铺有两层湿润滤纸片的培养皿中，再放于37℃恒温培养箱培养4d直至发芽，最后将发芽的水稻种子播种于田地，在水稻生长的第10、20、50和80天向水稻叶面喷洒混配剂，并在水稻生长的第20天向水稻叶面喷洒鸭粪提取物药液。
所述的拮抗细菌为拮抗细菌SU8；所述的拮抗细菌SU8为铜绿假单胞菌。

Claims (3)

1.一种水稻纹枯病的生物防控技术，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一：制备NA固体培养基，采用蛋白胨10.0g、牛肉粉3.0g、氯化钠5.0g、琼脂15.0g、葡萄糖2.5g，加蒸馏水溶解，定容至1L，PH调至7±0.1，分装后121℃灭菌20min；
步骤二：制备LB液体培养液，在950ml去离子水中加入胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaCl10g，搅拌直至溶质溶解，用5mol/LNaOH调pH至7.0，用去离子水定容至1L，在15psi高压下蒸汽灭菌21min；
步骤三：将拮抗细菌在NA固体培养基上于37℃活化24h，用无菌水制成菌体悬浮液，取10mL菌体悬浮液接种到装有100mLLB液体培养液的250mL锥形瓶中，在28℃的恒温条件下以220r/min的速率震荡培养48h，得到种子液；
步骤四：种子液以10％的接种量接入装有300mLLB液体培养液的1000mL锥形瓶中，磁力搅拌，转速为1000r/min，置于28℃的振荡培养箱中连续培养84h，得发酵液；
步骤五：将发酵液和乙酸乙酯以质量比1:2充分混匀萃取48h，取萃取液于40℃旋转蒸发仪中，以110r/min的转速旋转蒸发至膏状，用无菌水溶解，配成质量浓度为1000mg/L的发酵液提取物，置于4℃冰箱保存备用；
步骤六：在无菌条件下，将发酵液提取物和质量浓度500mg/L的井冈霉素按质量比4:1混合均匀得混配剂；
步骤七：称取鸭粪粉末500g，按质量比1:4加入2000mL无水乙醇，50℃浸提24h，抽滤，滤渣用2000mL无水乙醇复提取1次，合并滤液，用旋转蒸发仪减压浓缩至浸膏状，得粗提物于4℃保存备用；
步骤八：称取10g粗提物，用有机溶剂溶解后装入500mL容器中，用乙酸乙酯萃取4次，每次100mL，合并有机相，减压浓缩至浸膏状，制得乙酸乙酯组分，再用丙酮配制成80mg·mL-1，既得鸭粪提取物药液；
步骤九：水稻种子用质量浓度70％的乙醇溶液浸泡2min，然后用质量浓度3％的次氯酸钠水溶液浸泡30min，期间用玻璃棒搅动，无菌水冲洗3次，第3次冲洗持续10min，过夜干燥，置于铺有两层湿润滤纸片的培养皿中，再放于37℃恒温培养箱培养4d直至发芽，最后将发芽的水稻种子播种于田地，在水稻生长的第10、20、50和80天向水稻叶面喷洒混配剂，并在水稻生长的第20天向水稻叶面喷洒鸭粪提取物药液。
2.根据权利要求1所述的一种水稻纹枯病的生物防控技术，其特征在于：所述的拮抗细菌为拮抗细菌SU8。
3.根据权利要求1所述的一种水稻纹枯病的生物防控技术，其特征在于：所述的拮抗细菌SU8为铜绿假单胞菌。
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