CN105454234A - 单方或复方壳寡糖制剂及其在防治番茄病毒病中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及农药技术领域，具体涉及一种单方或复方壳寡糖制剂及其在防治番茄病毒病中的应用。本发明通过单独施用壳寡糖水溶液或在壳寡糖中加入生防菌和/或有机肥、无机肥、无机复合肥一种或多种来防治番茄病毒病，解决了现有番茄病毒病防治所用化学农药带有的病毒防治率低，病情会反复，有农药残留的问题。本发明所需的壳寡糖来源丰富，且在农业上应用具有微量、高效、低成本、无公害的特点，它对植物的调控作用不同于传统的生物农药和化学农药，不但可以促进作物的生长，提高作物的品质，壳寡糖可诱导植物的抗病性，对多种真菌、细菌和病毒产生免疫和杀灭作用，非常适合于工业化大生产。

Description

单方或复方壳寡糖制剂及其在防治番茄病毒病中的应用

技术领域

本发明涉及农业技术领域，具体涉及一种单方或复方壳寡糖制剂及其在防治番茄病毒病中的应用。

背景技术

植物病毒病在植物病害中所占比例仅次于真菌病害，随着设施农业的发展，病毒病在经济作物上的危害愈来愈重。番茄病毒病一般发病率10%-30%，严重的50%-70%，产量损失大，对番茄生产造成了严重威胁。番茄病毒病是由烟草花叶病毒、黄瓜花叶病毒、苜蓿花叶病毒或其他病毒侵染引起，是番茄的重要病害之一，其病害症状主要表现为花叶型、蕨叶型、条纹型、丛生型、卷叶型和黄顶型。近年来由于反季节蔬菜栽培面积扩大，加上种子带菌传染和气候条件适宜，以花叶病毒为主病毒引起的番茄病毒病上升迅速，危害严重。目前生产上防治病毒病的药剂难以有效控制病毒病的危害。因此，为保证我国现代化农业可持续发展、保障居民健康安全以及生态环境的保护，发展新型安全高效的生物农药产业具有重要意义。

壳寡糖是水溶性的壳聚糖降解产物，壳聚糖(chitosan)是由甲壳素衍生而来的。甲壳素（chitin）又叫甲壳质或者几丁质，它广泛存在于微生物、酵母、蘑菇的细胞壁中，昆虫的表皮中，乌贼、贝壳等软体动物的骨骼内。尤其是虾、螃蟹等甲壳类的水生动物的甲壳中含有丰富的甲壳素。甲壳素在自然界的合成量仅次于纤维素，是地球上第二大再生资源。

壳寡糖（oligochitosan）是由2-10个氨基葡萄糖以β-1，4-糖苷键连接而成，它对植物的调控作用不同于传统的生物农药和化学农药，不但可以促进作物的生长，提高作物的品质，壳寡糖可诱导植物的抗病性，对多种真菌、细菌和病毒产生免疫和杀灭作用。

且壳寡糖在农业上应用具有微量(PPM级)、高效、低成本、无公害等特点，对我国农业可持续性发展具有重要意义。

发明内容

本发明的目的就是为了克服现有技术不足，提供了一种单方或复方壳寡糖制剂及其在防治番茄病毒病中的应用，现有番茄病毒病防治所用化学农药带有的病毒防治率低，病情会反复，有农药残留的问题。

为了解决上述技术问题，本发明通过下述技术方案得以解决：

一种壳寡糖制剂，所述壳寡糖是经壳聚糖酶酶解制得，该壳寡糖的聚合度为3~30，平均分子量为3kDa。

所述壳寡糖的制备方法如下：

1）壳聚糖酶解溶液的制备：

采用生产壳聚糖酶菌种JT-K1，通过菌体富集方法获得壳聚糖酶解溶液；该生产壳聚糖酶菌种JT-K1，购于华中农业大学。

培养条件：2.5%葡萄糖、1%蛋白胨、0.15%磷酸氢二钾、0.05%磷酸二氢钾、0.3%七水合硫酸镁，180转数/分、发酵温度30℃，进行40L发酵罐的高细胞密度发酵，发酵液离心取上清液，即为壳聚糖酶解溶液。

2）3%壳聚糖胶体溶液的制备：

称取壳聚糖粉末15g，加入150mL蒸馏水，溶胀30min,加入1mol/L的HAc135mL，持续搅拌2h，使壳聚糖粉末充分溶解，用1mol/L的NaAc缓慢调pH为5.0，用相同PH的0.2mol/L的HAc/NaAc缓冲液定容至500mL。

3）壳聚糖酶解：

3%壳聚糖胶体加酶量为7u/g,55℃水浴12h,待酶解完全后沸水浴10min来灭酶活，冷却后加NaOH调pH为8，除去大分子的壳聚糖，6000转/分离心15min,取上清液抽滤后，浓缩得到高浓度的壳寡糖，再用3kDa孔径的滤膜过滤得到分子量为3kD的壳寡糖。

所述壳寡糖制剂是壳寡糖水溶液，浓度为0.014%~0.1%，优选0.02%~0.03%。

所述壳寡糖制剂还包括生防菌、润湿剂和填料。

壳寡糖的含量为壳寡糖制剂总重量的3%~5%；所述生防菌为多粘芽孢杆菌、侧孢芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌中一种或多种；所述润湿剂为月桂醇聚氧乙烯醚或十二烷基苯磺酸钠；所述填料为高岭土或硅藻土。

壳寡糖制剂还包括有机肥、无机肥、无机复合肥中一种或多种。

所述壳寡糖的添加量为壳寡糖制剂总重量的0.1%~0.3%。

所述壳寡糖制剂为固体制剂，优选可湿性粉剂。

本发明还提供了一种壳寡糖制剂在预防或治疗番茄病毒病中的应用。

所述的番茄病毒为烟草花叶病毒、黄瓜花叶病毒、苜蓿花叶病毒。

本发明与现有技术相比，带来的意料不到的技术效果如下：

1、常用的是化学农药植病灵、病毒A、病毒速杀、杀毒矾等溶液，病毒防治率低，病情会反复，有农药残留；壳寡糖来源丰富，且在农业上应用具有微量(PPM级)、高效、低成本、无公害等特点，它对植物的调控作用不同于传统的生物农药和化学农药，不但可以促进作物的生长，提高作物的品质，壳寡糖可诱导植物的抗病性，对多种真菌、细菌和病毒产生免疫和杀灭作用。

2、壳寡糖组合物菌剂加入不同的生防菌内，既能防治病毒病，又能根据生防菌的不同功能使所得兼有其它作用。

具体实施方式

本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。壳聚糖：脱乙酰度为92%，粉末状，购于国药集团。壳寡糖标样[(GlcN)2-(GlcN)6]：大连中科格莱克生物科技有限公司

为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明进行详细说明。

一种壳寡糖制剂，所述壳寡糖是经壳聚糖酶酶解制得，该壳寡糖的聚合度为

3~30,平均分子量为3kDa。

该壳寡糖的制备方法如下：

1）壳聚糖酶解溶液的制备：

采用生产壳聚糖酶菌种JT-K1，通过菌体富集方法获得壳聚糖酶解溶液；该

生产壳聚糖酶菌种JT-K1，购于华中农业大学。

培养条件：2.5%葡萄糖、1%蛋白胨、0.15%磷酸氢二钾、0.05%磷酸二氢钾、0.3%七水合硫酸镁，180转/分、发酵温度30℃，进行40L发酵罐的高细胞密度发酵，发酵液离心取上清液，即为壳聚糖酶解溶液，4℃冷藏备用。

2）3%壳聚糖胶体溶液的制备：

称取壳聚糖粉末15g，加入150mL蒸馏水,溶胀30min,加入1mol/L的HAc135mL，持续搅拌2h，使壳聚糖粉末充分溶解，用1mol/L的NaAc缓慢调pH为5.0，用相同PH的0.2mol/L的HAc/NaAc缓冲液定容至500mL，4℃冷藏备用。

3）壳聚糖酶解：

3%壳聚糖胶体加酶量为7u/g,55℃水浴12h,待酶解完全后沸水浴10min来灭酶活，冷却后加NaOH调pH为8，除去大分子的壳聚糖，6000转/分离心15min,取上清液用砂芯漏斗抽滤后，用旋转蒸发仪浓缩得到高浓度的壳寡糖，再用3kDa孔径的滤膜过滤得到分子量为3kD的壳寡糖，收集壳寡糖放入真空冷冻干燥机制备成固体状，于4℃冰箱储存备用。

壳寡糖作为活性成分能制备如下制剂：具体为：

1、壳寡糖水溶液，室温配置成浓度为0.03%。

2、一种壳寡糖组合物菌的可湿性粉剂，由以下按重量百分比的组分组成：4%壳寡糖、5%十二烷基苯磺酸钠、3%多粘芽孢杆菌、高岭土补至100%，将上述各成分应用常规农药加工技术，制成可湿性粉剂。

该可湿性粉剂的生防菌能用侧孢芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌替代多粘芽孢杆菌；

该可湿性粉剂的生防菌也能用多粘芽孢杆菌、侧孢芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌按重量比为1:1:1混合菌替代。

3、一种壳寡糖和有机肥复合的可湿性粉剂，由以下按重量百分比的组分组成：0.2%壳寡糖、10%十二烷基苯磺酸钠、有机肥补至100%，将上述各成分应用常规农药加工技术，制成可湿性粉剂。

该有机肥为符合有机肥料标准要求的有机肥料，具体为唐山金土生物有机肥有限公司生产的冀农肥(2012)准字8601号。

上述可湿性粉剂的使用方法：将可湿性粉剂加水稀释100-300倍后进行叶面喷施。

本发明还提供了一种壳寡糖制剂在预防或治疗番茄病毒病中的应用。

该番茄病毒为烟草花叶病毒、黄瓜花叶病毒、苜蓿花叶病毒。

一、壳寡糖制剂预防或治疗番茄病毒病室内盆栽试验如下：

人工接种TMV（烟草花叶病毒）于盆栽的健康番茄叶片上。在接种TMV前和接种TMV后48h对叶片进行处理，壳寡糖用清水稀释1000倍、3000倍、5000倍、7000倍喷雾处理，每种处理20株，重复3次。采用清水喷施作为对照。调查：接种5d后调查枯斑数（个/叶），计算病斑抑制率。

病斑抑制率（%）=[（对照枯斑数-处理枯斑数）/对照枯斑数]×100

表1不同浓度壳寡糖对番茄病毒病防治效果

由表1可见，壳寡糖稀释1000~7000倍均能有效防治TMV的侵染。其中稀释3000~5000倍效果最好。

另外壳寡糖制剂在预防或治疗由黄瓜花叶病毒、苜蓿花叶病毒引起的番茄病毒病的效果与烟草花叶病毒的类似，具体疗效不再赘述。

二、壳寡糖预防或治疗番茄病毒病田间防治试验如下：

番茄小区面积为40m²，各小区随机区组排列，使用前用清水稀释壳寡糖1000倍、3000倍、5000倍、7000倍喷雾处理，喷施清水作为对照，设3次重复。于发病初期开始第一次喷施，每隔1周1次，共喷施3次。每小区5点取样，每点取样5株。第一次喷施前调查病情基数，然后于第1次施药后7d、第2次施药后14d调查病情。根据以下分级标准分别记录植株发病情况，计算防治效果。

病叶分级标准为：

0级：无任何症状；

1级：心叶明脉或1~2片叶呈现花叶；

3级：中上部叶片花叶；

5级：除多数叶片花叶外，少数叶片畸形；

7级：多数叶片重花叶、畸形、皱缩或植株矮化；

9级：多数叶片重花叶、畸形、植株明显矮化，甚至枯萎死亡。

病情指数=[（各级病株数×相对病级数值）/调查总株数]×100

防效(%)=(1-(处理区病情指数/CK病情指数))×100

表2不同浓度壳寡糖对番茄病毒病防治效果

壳寡糖防治番茄病毒病田间防效试验结果如表2所示，壳寡糖稀释3000~7000倍对番茄病毒病具有很好的防治效果。第一次喷施后7d防效达到62.3%以上，均高于清水的处理；第2次喷施后14d效果更加明显，防效达到77.0%~83.2%，优选的是壳寡糖5000倍稀释液。施壳寡糖水溶液后番茄植株无任何药害发生。

单方或复方壳寡糖的液体制剂或固体制剂，其预防或治疗番茄病毒病的有效成分均为壳寡糖，疗效与上述表1或表2类似，不再赘述。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种壳寡糖制剂，其特征在于：所述壳寡糖是经壳聚糖酶酶解制得，该壳寡糖的聚合度为3~30,平均分子量为3kDa。

2.如权利要求1所述的壳寡糖制剂，其特征在于：所述壳寡糖的制备方法如下：

1）壳聚糖酶解溶液的制备：

采用生产壳聚糖酶菌种JT-K1，通过菌体富集方法获得壳聚糖酶解溶液；

培养条件：2.5%葡萄糖、1%蛋白胨、0.15%磷酸氢二钾、0.05%磷酸二氢钾、0.3%七水合硫酸镁，180转/分、发酵温度30℃，进行40L发酵罐的高细胞密度发酵，发酵液离心取上清液，即为壳聚糖酶解溶液；

2）3%壳聚糖胶体溶液的制备：

称取壳聚糖粉末15g，加入150mL蒸馏水,溶胀30min,加入1mol/L的HAc135mL，持续搅拌2h，使壳聚糖粉末充分溶解，用1mol/L的NaAc缓慢调pH为5.0，用相同PH的0.2mol/L的HAc/NaAc缓冲液定容至500mL；

3）壳聚糖酶解：

3%壳聚糖胶体加酶量为7u/g,55℃水浴12h,待酶解完全后沸水浴10min来灭酶活，冷却后加NaOH调pH为8，除去大分子的壳聚糖，6000转/分离心15min,取上清液抽滤后，浓缩得到壳寡糖，再用3kDa孔径的滤膜过滤得到分子量为3kD的壳寡糖。

3.如权利要求1或2所述的壳寡糖制剂，其特征在于：所述壳寡糖制剂是壳寡糖水溶液，浓度为0.014%~0.1%，优选0.02%~0.03%。

4.如权利要求3所述的壳寡糖制剂，其特征在于：还包括生防菌、润湿剂和填料。

5.如权利要求4所述的壳寡糖制剂，其特征在于：壳寡糖的含量为壳寡糖制剂总重量的3%~5%；所述生防菌为多粘芽孢杆菌、侧孢芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌中一种或多种；所述润湿剂为月桂醇聚氧乙烯醚或十二烷基苯磺酸钠；所述填料为高岭土或硅藻土。

6.如权利要求1所述的壳寡糖制剂，其特征在于：还包括有机肥、无机肥、无机复合肥中一种或多种。

7.如权利要求6所述的壳寡糖制剂，其特征在于：所述壳寡糖的添加量为壳寡糖制剂总重量的0.1%~0.3%。

8.如权利要求4至7所述的任意一项壳寡糖制剂，其特征在于：所述壳寡糖制剂为固体制剂，优选可湿性粉剂。

9.权利要求1至8中所述任意一项壳寡糖制剂在预防或治疗番茄病毒病中的应用。

10.如权利要求9所述的番茄病毒为烟草花叶病毒、黄瓜花叶病毒、苜蓿花叶病毒。