CN107624795A - 一种水稻纹枯病的防治方法 - Google Patents
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Abstract
一种水稻纹枯病的防治方法，涉及水稻病虫害的生物防治技术领域，包括以下步骤：制备NA固体培养基、制备LB液体培养液、制备种子液、制备发酵液、制备发酵液提取物、制备混配剂、制备艾蒿提取物、水稻定殖。发酵提取物混配井冈霉素对水稻纹枯病菌的防治具有协同作用，能显著增强井冈霉素对水稻纹枯病的防治效果，为提高井冈霉素对水稻纹枯病的防治效果提供了一定的理论依据，并为拓展拮抗细菌生物农药的应用提供了一条有效途径。艾篙提取物对植物病原菌的抑制特性,发现传统中药艾篙中的活性物质对植物病原菌也有很好的抑制活性。
Description
技术领域
本发明涉及水稻病虫害的生物防治技术领域，具体涉及一种水稻纹枯病的防治方法。
背景技术
水稻纹枯病，是影响我国水稻生长的常见病害，一般情况下水稻纹枯病会致使水稻减产10％-20％，严重时往往导致水稻倒伏枯死，减产量高达到50％-60％，对我国农业生产造成了巨大的经济损失。
然而，目前防治水稻纹枯病的有效药剂比较单一，主要是井冈霉素。由于长期使用，水稻纹枯病菌对井冈霉素产生了一定程度的抗药性，单一的井冈霉素对水稻纹枯病的防效已明显减弱，使得每年使用的次数逐渐增多，使用量也显著增加。因此，为了提高水稻纹枯病的防效，研发高效的新型药剂已迫在眉睫。生物防治是一种高效、安全控制水稻纹枯病的方法。近年来，国内外专家对水稻纹枯病拮抗菌进行了大量研究，取得了较大成果，然而，研究表明单一的生物防治效果并不理想，常常表现出较大的变异。
发明内容
为了解决现有技术中单一的生物防治存在的问题，本发明提供了一种水稻纹枯病的防治方法，采用混配剂混用防治水稻纹枯病具有增效效果。
本发明采用以下技术方案：
一种水稻纹枯病的防治方法，包括以下步骤：
步骤一：制备NA固体培养基，采用蛋白胨10.0g、牛肉粉3.0g、氯化钠5.0g、琼脂15.0g、葡萄糖2.5g，加蒸馏水溶解，定容至1L，PH调至7±0.1，分装后121℃灭菌20min；
步骤二：制备LB液体培养液，在950ml去离子水中加入胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaCl10g，搅拌直至溶质溶解，用5mol/LNaOH调pH至7.0，用去离子水定容至1L，在15psi高压下蒸汽灭菌21min；
步骤三：将拮抗细菌在NA固体培养基上于37℃活化24h，用无菌水制成菌体悬浮液，取10mL菌体悬浮液接种到装有100mLLB液体培养液的250mL锥形瓶中，在28℃的恒温条件下以220r/min的速率震荡培养48h，得到种子液；
步骤四：种子液以10％的接种量接入装有300mLLB液体培养液的1000mL锥形瓶中，磁力搅拌，转速为1000r/min，置于28℃的振荡培养箱中连续培养84h，得发酵液；
步骤五：将发酵液和乙酸乙酯以质量比1:2充分混匀萃取48h，取萃取液于40℃旋转蒸发仪中，以110r/min的转速旋转蒸发至膏状，用无菌水溶解，配成质量浓度为1000mg/L的发酵液提取物，置于4℃冰箱保存备用；
步骤六：在无菌条件下，将发酵液提取物和质量浓度500mg/L的井冈霉素按质量比4:1混合均匀得混配剂；
步骤七：将艾篙叶进行清洗，并放置在通风干燥处进行风干，将风干后的艾篙叶置于90℃条件下干燥8min，将干燥后的艾篙叶，放入粉碎机中粉碎，将粉碎后的艾篙叶过60目筛，得艾篙粉；
步骤八：称取100g艾篙粉，置于盛有500ml无水乙醇的容器中，在40℃水浴摇床下振荡提取24h，过滤后取出滤渣，向滤渣中加入200ml的无水乙醇并在40℃水浴摇床下振荡提取24，再次过滤后将两次滤液合并，并在58℃条件下进行旋转蒸发，浓缩至总体积为100ml，得艾篙提取物；
步骤九：水稻种子用质量浓度70％的乙醇溶液浸泡2min，然后用质量浓度3％的次氯酸钠水溶液浸泡30min，期间用玻璃棒搅动，无菌水冲洗3次，第3次冲洗持续10min，过夜干燥，置于铺有两层湿润滤纸片的培养皿中，再放于37℃恒温培养箱培养4d直至发芽，最后将发芽的水稻种子播种于田地，在水稻生长的第10、20、50和80天向水稻叶面喷洒混配剂，并在水稻生长的第20天向水稻叶面喷洒艾篙提取物。
优选的，所述的拮抗细菌为拮抗细菌SU8。
优选的，所述的拮抗细菌SU8为铜绿假单胞菌。
本发明的有益效果在于：
1)发酵提取物混配井冈霉素对水稻纹枯病菌的防治具有协同作用，能显著增强井冈霉素对水稻纹枯病的防治效果，为提高井冈霉素对水稻纹枯病的防治效果提供了一定的理论依据，并为拓展拮抗细菌生物农药的应用提供了一条有效途径。
2)艾篙提取物对植物病原菌的抑制特性,发现传统中药艾篙中的活性物质对植物病原菌也有很好的抑制活性，艾篙提取物可导致靶标病菌菌丝细胞畸形其抑菌活性物质主要为弱极性的中性或弱酸性精油对艾篙提取物对水稻纹枯病的防病机理研究表明,它还能明显抑制菌丝生长和菌核的形成,抑制菌丝的呼吸,使细胞膜受损,透性增加,内含物大量溶出,导致菌丝严重畸变和凋亡,对水稻有较好的保护作用,兼有一定的内吸治疗作用。研究结果表明,艾篙中的活性物质具有开发为新型植物源杀菌剂的潜力。
3)本发明的方法可以调控水稻植株的生长发育进程，包含有益的细茵群落在植株生长中具有促生、抗病、抗逆等功能。根据植物微生态理论，这些细菌和宿主之间在长期的进化过程中能够建立互惠互利的关系。从生物间巧生互作等关系考虑，这些细菌将更有利于生物的定殖，可更好地发挥生防作用。
4)本发明采用生物防治是发展绿色水稻产业的重要手段，拮抗细菌是防治水稻纹枯病的重要生防微生物。从植物中寻找具有生物活性的化合物，直接将其发成为新农药，是目前农药研发的一条重要途径。
具体实施方式
下面通过对实施例的描述，对本发明作进一步详细的说明，以帮助本领域技术人员对本发明的发明构思、技术方案有更完整、准确和深入的理解。
实施例1
一种水稻纹枯病的防治方法，包括以下步骤：
步骤一：制备NA固体培养基，采用蛋白胨10.0g、牛肉粉3.0g、氯化钠5.0g、琼脂15.0g、葡萄糖2.5g，加蒸馏水溶解，定容至1L，PH调至7±0.1，分装后121℃灭菌20min；
步骤二：制备LB液体培养液，在950ml去离子水中加入胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaCl10g，搅拌直至溶质溶解，用5mol/LNaOH调pH至7.0，用去离子水定容至1L，在15psi高压下蒸汽灭菌21min；
步骤三：将拮抗细菌在NA固体培养基上于37℃活化24h，用无菌水制成菌体悬浮液，取10mL菌体悬浮液接种到装有100mLLB液体培养液的250mL锥形瓶中，在28℃的恒温条件下以220r/min的速率震荡培养48h，得到种子液；
步骤四：种子液以10％的接种量接入装有300mLLB液体培养液的1000mL锥形瓶中，磁力搅拌，转速为1000r/min，置于28℃的振荡培养箱中连续培养84h，得发酵液；
步骤五：将发酵液和乙酸乙酯以质量比1:2充分混匀萃取48h，取萃取液于40℃旋转蒸发仪中，以110r/min的转速旋转蒸发至膏状，用无菌水溶解，配成质量浓度为1000mg/L的发酵液提取物，置于4℃冰箱保存备用；
步骤六：在无菌条件下，将发酵液提取物和质量浓度500mg/L的井冈霉素按质量比4:1混合均匀得混配剂；
步骤七：将艾篙叶进行清洗，并放置在通风干燥处进行风干，将风干后的艾篙叶置于90℃条件下干燥8min，将干燥后的艾篙叶，放入粉碎机中粉碎，将粉碎后的艾篙叶过60目筛，得艾篙粉；
步骤八：称取100g艾篙粉，置于盛有500ml无水乙醇的容器中，在40℃水浴摇床下振荡提取24h，过滤后取出滤渣，向滤渣中加入200ml的无水乙醇并在40℃水浴摇床下振荡提取24，再次过滤后将两次滤液合并，并在58℃条件下进行旋转蒸发，浓缩至总体积为100ml，得艾篙提取物；
步骤九：水稻种子用质量浓度70％的乙醇溶液浸泡2min，然后用质量浓度3％的次氯酸钠水溶液浸泡30min，期间用玻璃棒搅动，无菌水冲洗3次，第3次冲洗持续10min，过夜干燥，置于铺有两层湿润滤纸片的培养皿中，再放于37℃恒温培养箱培养4d直至发芽，最后将发芽的水稻种子播种于田地，在水稻生长的第10、20、50和80天向水稻叶面喷洒混配剂，并在水稻生长的第20天向水稻叶面喷洒艾篙提取物。
所述的拮抗细菌为拮抗细菌SU8；所述的拮抗细菌SU8为铜绿假单胞菌。
Claims (3)
1.一种水稻纹枯病的防治方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一：制备NA固体培养基，采用蛋白胨10.0g、牛肉粉3.0g、氯化钠5.0g、琼脂15.0g、葡萄糖2.5g，加蒸馏水溶解，定容至1L，PH调至7±0.1，分装后121℃灭菌20min；
步骤二：制备LB液体培养液，在950ml去离子水中加入胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaCl10g，搅拌直至溶质溶解，用5mol/LNaOH调pH至7.0，用去离子水定容至1L，在15psi高压下蒸汽灭菌21min；
步骤三：将拮抗细菌在NA固体培养基上于37℃活化24h，用无菌水制成菌体悬浮液，取10mL菌体悬浮液接种到装有100mLLB液体培养液的250mL锥形瓶中，在28℃的恒温条件下以220r/min的速率震荡培养48h，得到种子液；
步骤四：种子液以10％的接种量接入装有300mLLB液体培养液的1000mL锥形瓶中，磁力搅拌，转速为1000r/min，置于28℃的振荡培养箱中连续培养84h，得发酵液；
步骤五：将发酵液和乙酸乙酯以质量比1:2充分混匀萃取48h，取萃取液于40℃旋转蒸发仪中，以110r/min的转速旋转蒸发至膏状，用无菌水溶解，配成质量浓度为1000mg/L的发酵液提取物，置于4℃冰箱保存备用；
步骤六：在无菌条件下，将发酵液提取物和质量浓度500mg/L的井冈霉素按质量比4:1混合均匀得混配剂；
步骤七：将艾篙叶进行清洗，并放置在通风干燥处进行风干，将风干后的艾篙叶置于90℃条件下干燥8min，将干燥后的艾篙叶，放入粉碎机中粉碎，将粉碎后的艾篙叶过60目筛，得艾篙粉；
步骤八：称取100g艾篙粉，置于盛有500ml无水乙醇的容器中，在40℃水浴摇床下振荡提取24h，过滤后取出滤渣，向滤渣中加入200ml的无水乙醇并在40℃水浴摇床下振荡提取24，再次过滤后将两次滤液合并，并在58℃条件下进行旋转蒸发，浓缩至总体积为100ml，得艾篙提取物；
步骤九：水稻种子用质量浓度70％的乙醇溶液浸泡2min，然后用质量浓度3％的次氯酸钠水溶液浸泡30min，期间用玻璃棒搅动，无菌水冲洗3次，第3次冲洗持续10min，过夜干燥，置于铺有两层湿润滤纸片的培养皿中，再放于37℃恒温培养箱培养4d直至发芽，最后将发芽的水稻种子播种于田地，在水稻生长的第10、20、50和80天向水稻叶面喷洒混配剂，并在水稻生长的第20天向水稻叶面喷洒艾篙提取物。
2.根据权利要求1所述的一种水稻纹枯病的防治方法，其特征在于：所述的拮抗细菌为拮抗细菌SU8。
3.根据权利要求1所述的一种水稻纹枯病的防治方法，其特征在于：所述的拮抗细菌SU8为铜绿假单胞菌。
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