CN108823127A - 用于产α-淀粉酶的菌株和α-淀粉酶的分离纯化方法 - Google Patents

用于产α-淀粉酶的菌株和α-淀粉酶的分离纯化方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种不依赖钙离子α‑淀粉酶的分离纯化方法，将10％(v/v)芽孢杆菌(Bacillus sp.)BH 072种子液接于LB产酶发酵培养基中，在初始培养温度为37℃，摇床转速160rpm条件下，培养24h，得到粗酶液。采用硫酸铵沉淀法至溶液硫酸铵终饱和浓度达到80％(w/v)使酶充分沉淀，复溶，透析；利用阴离子交换层析和凝胶过滤层析等步骤纯化α‑淀粉酶，同时进行酶学性质分析，纯α‑淀粉酶的分子量为68kDa，比酶活为975U/mg，纯化倍数达到21.2倍，最适pH为6.5、最适温度为65℃，且α‑淀粉酶活性不依赖钙离子。本方法得到的α‑淀粉酶纯度高、纯化倍数高。

Description

用于产α-淀粉酶的菌株和α-淀粉酶的分离纯化方法
技术领域
本发明涉及一种不依赖钙离子α-淀粉酶的分离纯化方法。
背景技术
α-淀粉酶是一种普遍存在于自然界中的淀粉酶，其来源十分丰富。作为一种具有最长研究历史的酶类，现已报道可以大量从动物、植物和微生物中提取α-淀粉酶。19世纪20年代开始，工业α-淀粉酶研究领域蓬勃发展，微生物来源的α-淀粉酶研究受到重视，现已陆续分离出来自细菌、真菌和酵母等不同微生物来源的α-淀粉酶。随着纯化手段的发展，α-淀粉酶研究领域向更加精确化方向不断深化。同时，纯化的α-淀粉酶通过蛋白质序列分析技术，可得到相应氨基酸和基因序列，他们作为分子生物学基础，为α-淀粉酶的结构、功能和基因调控、表达等机理研究提供依据。作为酶学研究极其重要的基础部分，为不同特性的α-淀粉酶探索便捷、高效且经济的分离纯化方法一直是国内外相关研究的重点内容。
发明内容
为了解决现有技术中的问题，本发明提供一种用于产α-淀粉酶的菌株和α-淀粉酶的分离纯化方法，解决现有技术中α-淀粉酶分离纯度和回收率不高的问题。
本发明的技术方案为：一种用于产α-淀粉酶的菌株，其芽孢杆菌BH 072，分类命名：芽孢杆菌(Bacillus),现于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)保藏，保藏中心登记入册编号为CGMCC No.8473。保藏时间为2013年11月15日，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编100101。
一种不依赖钙离子α-淀粉酶的分离纯化方法，包括粗酶液制备、硫酸铵沉淀、阴离子交换层析、凝胶过滤层析和酶学性质分析的步骤。
一种不依赖钙离子α-淀粉酶的分离纯化方法，按以下步骤进行：
1)种子活化：将Bacillus sp.BH 072接种于液体LB培养基，37℃培养12h；
2)发酵培养：将10％(v/v)种子液接种到产酶发酵培养基中，37℃，160rmp培养24h；
3)粗酶液的制备：将发酵液进行冷冻高速离心，取上层清液；
4)硫酸铵沉淀：取上清粗酶液缓慢加硫酸铵饱和溶液，至溶液硫酸铵终饱和浓度达到80％ (w/v)使其充分沉淀，离心后将沉淀溶于pH 6.5的磷酸缓冲液中，充分复溶后透析、聚乙二醇20000浓缩，即为粗酶液；
5)阴离子交换层析：将粗酶液上样到阴离子交换柱中，用pH 6.5磷酸缓冲液平衡，用0-1 mol/L NaCl缓冲液，1.5mL/min流速线性洗脱，边洗脱边测量280nm处的吸光度，收集洗脱峰内的液体；
6)凝胶过滤层析：将步骤5)收集的液体上样至凝胶过滤层析柱中，用相同缓冲液，0.5 mL/min洗脱，边洗脱边测量280nm处的吸光度，收集洗脱峰内的液体，即为纯酶液。
有益效果：本发明通过系列生物化学技术获得菌株发酵产物α-淀粉酶，采用现代提取技术对发酵液提取纯化获得高纯度及高回收率的α-淀粉酶。经过系列实验验证，说明所获的α-淀粉酶菌株具有不依赖钙离子的特性。
附图说明
图1Bacillus subsp.BH072菌体生长曲线；
图2硫酸铵浓度-淀粉酶活力回收曲线；
图3DEAE Sepharose Fast Flow阴离子交换层析洗脱图谱；
图4Sephadex G-100凝胶过滤层析洗脱图谱；
图5pH对Bacillus subsp.BH072淀粉酶活性的影响；
图6温度对Bacillus subsp.BH072淀粉酶活性的影响；
图7金属离子对Bacillus subsp.BH072淀粉酶活性的影响；
图8纯化过程SDS-PAGE电泳图谱。
具体实施方式
实施例1：一种α-淀粉酶的发酵方法
本实施例一种α-淀粉酶的发酵方法，按以下步骤进行：
1)制备种子液
将Bacillus subsp.BH072接种于液体LB培养基中，160rmp培养12h至对数生长期，即为种子液。
2)发酵培养
将种子液按10％(v/v)的接种量接入液体产酶发酵培养基，37℃，160rmp培养24h。取发酵液4℃，11000rmp离心15min，取上层清液即为粗酶液，所得粗酶液4℃保藏备用。
实施例2：一种α-淀粉酶的分离纯化方法
1)硫酸铵分级沉淀
上清粗酶液中加入饱和硫酸铵溶液至80％(w/v)饱和硫酸铵浓度，4℃过夜沉淀。将溶液 11000rmp，4℃离心20min，弃上清，收集沉淀。
将沉淀用pH 6.5磷酸缓冲液充分复溶后，装于透析袋中4℃过夜透析，每3h换一次去离子水，除去粗酶液中大量硫酸铵，并用聚乙二醇20000浓缩。
2)DEAE Sepharose Fast Flow阴离子交换层析
将浓缩所得粗酶液以0.5mL/min上样至经pH 6.5磷酸缓冲液平衡好的DEAESepharose Fast Flow阴离子层析柱(2cm*40cm)，用0-1mol/L NaCl缓冲液，1.5mL/min流速线性洗脱，边洗脱边测量280nm处的吸光度，收集洗脱峰内液体，测量α-淀粉酶酶活，合并活性峰收集液装于透析袋中，利用聚乙二醇20000浓缩。
3)Sephadex G-100凝胶过滤层析
将上述浓缩酶液，上样至经pH 6.5磷酸缓冲液平衡的Sephadex G-100凝胶层析柱(2cm*60 cm)，并用相同缓冲液，0.5mL/min洗脱，边洗脱边测量280nm处的吸光度，收集洗脱峰内的液体，测量α-淀粉酶酶活。将收集液装于透析袋中，利用聚乙二醇20000浓缩，得到纯α- 淀粉酶。
4)SDS-PAGE凝胶电泳
采用10％分离胶，5％浓缩胶。取酶液20μL与5μL 5×样品缓冲液混合，100℃煮沸5min， 12000rmp离心5min上样。浓缩胶电压为80V，分离胶电压为120V。
用考马斯亮蓝R-250染色电泳后凝胶。分子量标准从大到小依次为：116.0、66.2、45.0、 35.0、25.0(单位kDa)。
本实施例获得的α-淀粉酶的分子量为68kDa，比酶活975U/mg，纯化倍数达到21.2倍。
实施例3：一种α-淀粉酶的酶学性质
1)α-淀粉酶的最适pH
在不同pH值(pH 4.5-10.0)缓冲液配置的1％(w/v)可溶性淀粉溶液中，加入等量的酶, 用DNS法测定65℃时淀粉酶活力，绘制pH-酶活曲线，确定酶的最适pH。
2)α-淀粉酶的pH稳定性
将α-淀粉酶分别加于不同pH值的缓冲体系中，65℃保温1h，备用。用pH 6.5的1％(w/v) 可溶性淀粉溶液作为底物，加入保温后的酶液，测定酶的剩余酶活。
缓冲体系(100mM)分别为：醋酸酸缓冲液(pH 4.5-6.0)，磷酸缓冲液(pH 6.0-7.5)Tris-HCl 缓冲液(pH 7.5-9.0)，氨基乙酸-NaOH缓冲液(pH 9.0-11.0)。
3)α-淀粉酶的最适温度
用DNS法测定酶在pH 6.5的可溶性淀粉底物溶液中，不同反应温度(30-90℃)下的酶活，绘制温度-酶活函数线，确定酶的最适反应温度。
4)α-淀粉酶的热稳定性
将α-淀粉酶加于pH 6.5的磷酸缓冲液中，分别于30-90℃保温1h，立即于冰水中冷却，备用。用DNS法测定剩余酶活。
5)金属离子对α-淀粉酶的影响
在酶活测定反应体系中分别加入终浓度为5mmol/L钙、钠、锰、镁、钾、铜、亚铁、锌离子的氯化物，4℃静置1h，测定酶活。
本实施例获得的不依赖钙离子α-淀粉酶的分子量为68kDa，比酶活975U/mg，纯化倍数达到21.2倍，最适pH为6.5，最适温度为65℃，Na+显著促进α-淀粉酶活性，Fe2+显著抑制α- 淀粉酶活性，Ca2+对α-淀粉酶活性没有影响。

Claims (3)

1.一种用于产α-淀粉酶的菌株，其特征在于：为芽孢杆菌BH 072，于2013年11月15日保藏至中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC NO.8473。
2.一种α-淀粉酶的分离纯化方法，其特征在于：包括粗酶液制备、硫酸铵沉淀、阴离子交换层析、凝胶过滤层析和酶学性质分析的步骤。
3.根据权利要求2所述的α-淀粉酶的分离纯化方法，其特征在于：采取芽孢杆菌BH 072为出发菌株按一下步骤进行：
1)菌株活化：将Bacillus sp.BH 072接种于液体LB培养基，在37℃培养12h；
2)发酵培养：将种子按体积比10％接种到发酵培养基中，37℃，160rmp培养24h；
3)粗酶液的制备：将发酵液进行高速离心，取上层清液；
4)硫酸铵沉淀：取粗酶液缓慢加硫酸铵饱和溶液，至溶液硫酸铵终饱和浓度达到80％使酶充分沉淀，离心后将沉淀溶于pH 6.5磷酸缓冲液中，充分复溶后透析、聚乙二醇20000浓缩，即为粗酶液；
5)阴离子交换层析：将粗酶液上样到阴离子交换柱中，用pH 6.5磷酸缓冲液平衡，用0-1mol/L NaCl缓冲液，1.5mL/min流速线性洗脱，边洗脱边测量280nm处的吸光度，收集洗脱峰内的液体；
6)凝胶过滤层析：将步骤5)收集的液体上样至凝胶过滤层析柱中，用相同缓冲液，0.5mL/min洗脱，边洗脱边测量280nm处的吸光度，收集洗脱峰内的液体，即为纯酶液。
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