CN116286746B - 利用液相色谱纯化淀粉酶的方法 - Google Patents

利用液相色谱纯化淀粉酶的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN116286746B
CN116286746B CN202310510465.0A CN202310510465A CN116286746B CN 116286746 B CN116286746 B CN 116286746B CN 202310510465 A CN202310510465 A CN 202310510465A CN 116286746 B CN116286746 B CN 116286746B
Authority
CN
China
Prior art keywords
amylase
liquid chromatography
solution
purifying
fermentation
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202310510465.0A
Other languages
English (en)
Other versions
CN116286746A (zh
Inventor
郭云
唐桢尧
郭贝亭
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Nanjing Nongfeng Biotechnology Co ltd
Original Assignee
Nanjing Nongfeng Biotechnology Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Nanjing Nongfeng Biotechnology Co ltd filed Critical Nanjing Nongfeng Biotechnology Co ltd
Priority to CN202310510465.0A priority Critical patent/CN116286746B/zh
Publication of CN116286746A publication Critical patent/CN116286746A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN116286746B publication Critical patent/CN116286746B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2405—Glucanases
    • C12N9/2408—Glucanases acting on alpha -1,4-glucosidic bonds
    • C12N9/2411—Amylases
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/07—Bacillus
    • C12R2001/125—Bacillus subtilis ; Hay bacillus; Grass bacillus

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Abstract

本发明公开了一种利用液相色谱纯化淀粉酶的方法，属于生物制剂技术领域。其包括以下步骤：（1）粗淀粉酶的制备：准备枯草芽孢杆菌，进行发酵得到发酵液，接着将发酵液进行离心，取上清液，得到粗淀粉酶溶液；（2）粗淀粉酶的纯化：将步骤（1）得到的粗淀粉酶溶液，先选择凝胶过滤，接着施加到色谱柱进行洗脱分离，即得到纯化后的淀粉酶溶液，然后烘干即可。本发明的工艺方法对于淀粉酶的纯化具有明显的提升作用，使用后不仅产率提升，而且酶活力的保留较大。

Description

利用液相色谱纯化淀粉酶的方法
技术领域
本发明属于生物制剂技术领域，具体地说，涉及一种利用液相色谱纯化淀粉酶的方法。
背景技术
淀粉酶作为一种基本的工业用酶，分为α-淀粉酶、β-淀粉酶和γ-淀粉酶。其中α-淀粉酶是一种应用较为广泛的工业用酶，它可以作用于淀粉和其它多糖的内部α-1-4糖苷键，从而产生葡萄糖和麦芽糖等多种物质，目前工业上利用其生产了乙醇、高果糖玉米糖浆、食品、纺织物和洗涤剂等。作为重要的大分子生物催化剂，酶分子具有高效性和特异性，是常用的化学催化剂的良好替代品。此外，酶促反应是在较为温和的条件下进行，所产生的副产物和污染少。因此，近年来，酶分子在制药、化工、生物、食品等行业的应用明显增加。然而，酶分子在极端条件下具有相对较低的稳定性，并且在商业应用中成本颇高。为了改善这些局限性，提高酶活力、稳定性、再利用能力和酶的效率成为了研究的热点。其中，研究多采用超声波处理、微波辐射、高静水压、超临界二氧化碳处理以及蛋白质工程修饰酶分子等方法对酶的特性进行改善。例如，通过对酶分子表面的多聚赖氨酸修饰可以有效提高肌氨酸氧化酶的pH稳定性和热稳定性；还有研究者通过改善亚临界和超临界处理条件进而增强了α-淀粉酶的酶活力等。由于生物技术在不断发展和吸引新方法，基于绿色和科学的原则，超声波作为绿色、科学以及高效的物理技术受到越来越多的关注。但是，现有技术对于淀粉酶的纯化产率较低，而且酶活力也较低。
发明内容
1、要解决的问题
针对上述现有技术存在的问题，本发明提供一种利用液相色谱纯化淀粉酶的方法，本发明的工艺方法对于淀粉酶的纯化具有明显的提升作用，使用后不仅产率提升，而且酶活力的保留较大。具体来说，利用枯草芽孢杆菌进行有效发酵，可以得到高产率的淀粉酶，同时，合适的凝胶过滤的凝胶材质能够有效过滤杂质，起到提纯淀粉酶的效果，并利用合适的洗脱分离工艺实现淀粉酶活性的保留。
2、技术方案
一种利用液相色谱纯化淀粉酶的方法，
包括以下步骤：
（1）粗淀粉酶的制备：准备枯草芽孢杆菌，进行发酵得到发酵液，接着将发酵液进行离心，取上清液，得到粗淀粉酶溶液；
所述枯草芽孢杆菌的分类命名为枯草芽孢杆菌(Bacilus subtilis)，保藏编号为CGMCC NO.16139，保藏日期为2018年7月20日，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；
（2）粗淀粉酶的纯化：将步骤（1）得到的粗淀粉酶溶液，先选择凝胶过滤，接着施加到色谱柱进行洗脱分离，即得到纯化后的淀粉酶溶液，低温烘干，即可。
上述所述的利用液相色谱纯化淀粉酶的方法，
步骤（1）中发酵的培养基为NB营养肉汤；
所述的NB营养肉汤中添加氯化钙，其中氯化钙的终浓度为0.1mM。
上述所述的利用液相色谱纯化淀粉酶的方法，
步骤（1）中发酵的时间为24h；
步骤（1）中发酵的温度为35℃；
步骤（1）中发酵的摇床转速为120rm；
步骤（1）中发酵的pH值为7.0。
上述所述的利用液相色谱纯化淀粉酶的方法，
步骤（1）中离心的转速为12000rpm；
步骤（1）中离心的时间为15min；
步骤（1）中离心的温度为4℃。
上述所述的利用液相色谱纯化淀粉酶的方法，
步骤（2）中凝胶过滤的缓冲液为PBS缓冲液；
步骤（2）中凝胶过滤的凝胶材质，以重量份计，包括以下组分：
葡聚糖 150份-200份，
壳聚糖 80份-120份，
β-磷酸三钙 20份-60份，
环氧氯丙烷 0.5份-1.5份。
上述所述的利用液相色谱纯化淀粉酶的方法，
步骤（2）中所述的凝胶材质的制备方法如下：
将葡聚糖、壳聚糖、β-磷酸三钙、环氧氯丙烷，利用超声处理2min，升温至45℃，然后静置混合孵育72h，即可。
上述所述的利用液相色谱纯化淀粉酶的方法，
步骤（2）中洗脱分离的色谱柱为赛默飞生产的052962型离子交换色谱柱。
上述所述的利用液相色谱纯化淀粉酶的方法，
步骤（2）中洗脱分离的预平衡液为20mM的磷酸钠缓冲液。
上述所述的利用液相色谱纯化淀粉酶的方法，
步骤（1）中发酵的pH值为7.0的具体调节步骤如下：
101、每隔20min使用针管纵向等距离提取至少三个位置上的提取液，使用pH检测试纸分别检测采集位置的pH值，设定为，其中n为提取的总数最大值，/>为i高度上采集的提取液的pH值；
102、计算溶液中各个纵向位置上的氢离子浓度，，其中/>为i高度上采集的提取液的氢离子浓度，同时提取各个高度上的容器的直径大小设为，其中/>为i高度上容器的直径，计算容器中整体的氢离子浓度，，其中h为容器中溶液的高度；
103、将计算容器中整体的氢离子浓度代入pH值计算公式中，计算整体溶液的pH值；
104、根据计算整体溶液的pH值计算添加的酸碱中和剂的含量，以准确添加酸碱中和剂。
上述所述的利用液相色谱纯化淀粉酶的方法，
所述103中的pH值计算公式适配为：；所述104中计算添加的酸碱中和剂的含量的具体步骤为：1041、采集添加的酸碱中和剂的pH值，设为/>；1042、求出酸碱中和剂的需要添加量/>。
3、有益效果
相比于现有技术，本发明的有益效果为：
1.本发明的工艺方法对于淀粉酶的纯化具有明显的提升作用，使用后不仅产率提升，而且酶活力的保留较大。具体来说，利用枯草芽孢杆菌进行有效发酵，可以得到高产率的淀粉酶，同时，合适的凝胶过滤的凝胶材质能够有效过滤杂质，起到提纯淀粉酶的效果，并利用合适的洗脱分离工艺实现淀粉酶活性的保留。
2.通过设置的具体调节步骤策略对提取液中的pH值准确计算，然后准确计算酸碱中和剂的需要添加量，以保证pH值的准确调节，进一步提高了淀粉酶的纯化效果。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进一步进行描述。
实施例1
利用液相色谱纯化淀粉酶的方法，
包括以下步骤：
（1）粗淀粉酶的制备：准备枯草芽孢杆菌，进行发酵得到发酵液，接着将发酵液进行离心，取上清液，得到粗淀粉酶溶液；
所述枯草芽孢杆菌的分类命名为枯草芽孢杆菌(Bacilus subtilis)，保藏编号为CGMCC NO.16139，保藏日期为2018年7月20日，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；
（2）粗淀粉酶的纯化：将步骤（1）得到的粗淀粉酶溶液，先选择凝胶过滤，接着施加到色谱柱进行洗脱分离，即得到纯化后的淀粉酶溶液，低温烘干，即可。
上述的利用液相色谱纯化淀粉酶的方法，
步骤（1）中发酵的培养基为NB营养肉汤；
的NB营养肉汤中添加氯化钙，其中氯化钙的终浓度为0.1mM。
上述的利用液相色谱纯化淀粉酶的方法，
步骤（1）中发酵的时间为24h；
步骤（1）中发酵的温度为35℃；
步骤（1）中发酵的摇床转速为120rm；
步骤（1）中发酵的pH值为7.0。
上述的利用液相色谱纯化淀粉酶的方法，
步骤（1）中离心的转速为12000rpm；
步骤（1）中离心的时间为15min；
步骤（1）中离心的温度为4℃。
上述的利用液相色谱纯化淀粉酶的方法，
步骤（2）中凝胶过滤的缓冲液为PBS缓冲液；
步骤（2）中凝胶过滤的凝胶材质，以重量份计，包括以下组分：
葡聚糖 150份，
壳聚糖 120份，
β-磷酸三钙 20份，
环氧氯丙烷 1.5份。
上述的利用液相色谱纯化淀粉酶的方法，
步骤（2）中的凝胶材质的制备方法如下：
将葡聚糖、壳聚糖、β-磷酸三钙、环氧氯丙烷，利用超声处理2min，升温至45℃，然后静置混合孵育72h，即可。
上述的利用液相色谱纯化淀粉酶的方法，
步骤（2）中洗脱分离的色谱柱为赛默飞生产的052962型离子交换色谱柱。
上述的利用液相色谱纯化淀粉酶的方法，
步骤（2）中洗脱分离的预平衡液为20mM的磷酸钠缓冲液。
上述的利用液相色谱纯化淀粉酶的方法，
步骤（1）中发酵的pH值为7.0的具体调节步骤如下：
101、每隔20min使用针管纵向等距离提取至少三个位置上的提取液，使用pH检测试纸分别检测采集位置的pH值，设定为，其中n为提取的总数最大值，为i高度上采集的提取液的pH值；
102、计算溶液中各个纵向位置上的氢离子浓度，，其中/>为i高度上采集的提取液的氢离子浓度，同时提取各个高度上的容器的直径大小设为，其中/>为i高度上容器的直径，计算容器中整体的氢离子浓度，，其中h为容器中溶液的高度；
103、将计算容器中整体的氢离子浓度代入pH值计算公式中，计算整体溶液的pH值；
104、根据计算整体溶液的pH值计算添加的酸碱中和剂的含量，以准确添加酸碱中和剂。
上述的利用液相色谱纯化淀粉酶的方法，
103中的pH值计算公式适配为：；104中计算添加的酸碱中和剂的含量的具体步骤为：1041、采集添加的酸碱中和剂的pH值，设为/>；1042、求出酸碱中和剂的需要添加量/>。
实施例2
利用液相色谱纯化淀粉酶的方法，
包括以下步骤：
（1）粗淀粉酶的制备：准备枯草芽孢杆菌，进行发酵得到发酵液，接着将发酵液进行离心，取上清液，得到粗淀粉酶溶液；
（2）粗淀粉酶的纯化：将步骤（1）得到的粗淀粉酶溶液，先选择凝胶过滤，接着施加到色谱柱进行洗脱分离，即得到纯化后的淀粉酶溶液，低温烘干，即可。
上述的利用液相色谱纯化淀粉酶的方法，
步骤（1）中发酵的培养基为NB营养肉汤；
的NB营养肉汤中添加氯化钙，其中氯化钙的终浓度为0.1mM。
上述的利用液相色谱纯化淀粉酶的方法，
步骤（1）中发酵的时间为24h；
步骤（1）中发酵的温度为35℃；
步骤（1）中发酵的摇床转速为120rm；
步骤（1）中发酵的pH值为7.0。
上述的利用液相色谱纯化淀粉酶的方法，
步骤（1）中离心的转速为12000rpm；
步骤（1）中离心的时间为15min；
步骤（1）中离心的温度为4℃。
上述的利用液相色谱纯化淀粉酶的方法，
步骤（2）中凝胶过滤的缓冲液为PBS缓冲液；
步骤（2）中凝胶过滤的凝胶材质，以重量份计，包括以下组分：
葡聚糖 200份，
壳聚糖 80份，
β-磷酸三钙 60份，
环氧氯丙烷 0.5份，
上述的利用液相色谱纯化淀粉酶的方法，
步骤（2）中的凝胶材质的制备方法如下：
将葡聚糖、壳聚糖、β-磷酸三钙、环氧氯丙烷，利用超声处理2min，升温至45℃，然后静置混合孵育72h，即可。
上述的利用液相色谱纯化淀粉酶的方法，
步骤（2）中洗脱分离的色谱柱为赛默飞生产的052962型离子交换色谱柱。
上述的利用液相色谱纯化淀粉酶的方法，
步骤（2）中洗脱分离的预平衡液为20mM的磷酸钠缓冲液。
上述的利用液相色谱纯化淀粉酶的方法，
步骤（1）中发酵的pH值为7.0的具体调节步骤如下：
101、每隔20min使用针管纵向等距离提取至少三个位置上的提取液，使用pH检测试纸分别检测采集位置的pH值，设定为，其中n为提取的总数最大值，为i高度上采集的提取液的pH值；
102、计算溶液中各个纵向位置上的氢离子浓度，，其中/>为i高度上采集的提取液的氢离子浓度，同时提取各个高度上的容器的直径大小设为，其中/>为i高度上容器的直径，计算容器中整体的氢离子浓度，，其中h为容器中溶液的高度；
103、将计算容器中整体的氢离子浓度代入pH值计算公式中，计算整体溶液的pH值；
104、根据计算整体溶液的pH值计算添加的酸碱中和剂的含量，以准确添加酸碱中和剂。
上述的利用液相色谱纯化淀粉酶的方法，
103中的pH值计算公式适配为：；104中计算添加的酸碱中和剂的含量的具体步骤为：1041、采集添加的酸碱中和剂的pH值，设为/>；1042、求出酸碱中和剂的需要添加量/>。
实施例3
利用液相色谱纯化淀粉酶的方法，
包括以下步骤：
（1）粗淀粉酶的制备：准备枯草芽孢杆菌，进行发酵得到发酵液，接着将发酵液进行离心，取上清液，得到粗淀粉酶溶液；
（2）粗淀粉酶的纯化：将步骤（1）得到的粗淀粉酶溶液，先选择凝胶过滤，接着施加到色谱柱进行洗脱分离，即得到纯化后的淀粉酶溶液，低温烘干，即可。
上述的利用液相色谱纯化淀粉酶的方法，
步骤（1）中发酵的培养基为NB营养肉汤；
的NB营养肉汤中添加氯化钙，其中氯化钙的终浓度为0.1mM。
上述的利用液相色谱纯化淀粉酶的方法，
步骤（1）中发酵的时间为24h；
步骤（1）中发酵的温度为35℃；
步骤（1）中发酵的摇床转速为120rm；
步骤（1）中发酵的pH值为7.0。
上述的利用液相色谱纯化淀粉酶的方法，
步骤（1）中离心的转速为12000rpm；
步骤（1）中离心的时间为15min；
步骤（1）中离心的温度为4℃。
上述的利用液相色谱纯化淀粉酶的方法，
步骤（2）中凝胶过滤的缓冲液为PBS缓冲液；
步骤（2）中凝胶过滤的凝胶材质，以重量份计，包括以下组分：
葡聚糖 170份，
壳聚糖 110份，
β-磷酸三钙 30份，
环氧氯丙烷 1.2份，
上述的利用液相色谱纯化淀粉酶的方法，
步骤（2）中的凝胶材质的制备方法如下：
将葡聚糖、壳聚糖、β-磷酸三钙、环氧氯丙烷，利用超声处理2min，升温至45℃，然后静置混合孵育72h，即可。
上述的利用液相色谱纯化淀粉酶的方法，
步骤（2）中洗脱分离的色谱柱为赛默飞生产的052962型离子交换色谱柱。
上述的利用液相色谱纯化淀粉酶的方法，
步骤（2）中洗脱分离的预平衡液为20mM的磷酸钠缓冲液。
上述的利用液相色谱纯化淀粉酶的方法，
步骤（1）中发酵的pH值为7.0的具体调节步骤如下：
101、每隔20min使用针管纵向等距离提取至少三个位置上的提取液，使用pH检测试纸分别检测采集位置的pH值，设定为，其中n为提取的总数最大值，为i高度上采集的提取液的pH值；
102、计算溶液中各个纵向位置上的氢离子浓度，，其中/>为i高度上采集的提取液的氢离子浓度，同时提取各个高度上的容器的直径大小设为，其中/>为i高度上容器的直径，计算容器中整体的氢离子浓度，，其中h为容器中溶液的高度；
103、将计算容器中整体的氢离子浓度代入pH值计算公式中，计算整体溶液的pH值；
104、根据计算整体溶液的pH值计算添加的酸碱中和剂的含量，以准确添加酸碱中和剂。
上述的利用液相色谱纯化淀粉酶的方法，
103中的pH值计算公式适配为：；104中计算添加的酸碱中和剂的含量的具体步骤为：1041、采集添加的酸碱中和剂的pH值，设为/>；1042、求出酸碱中和剂的需要添加量/>。
实施例4
利用液相色谱纯化淀粉酶的方法，
包括以下步骤：
（1）粗淀粉酶的制备：准备枯草芽孢杆菌，进行发酵得到发酵液，接着将发酵液进行离心，取上清液，得到粗淀粉酶溶液；
（2）粗淀粉酶的纯化：将步骤（1）得到的粗淀粉酶溶液，先选择凝胶过滤，接着施加到色谱柱进行洗脱分离，即得到纯化后的淀粉酶溶液，低温烘干，即可。
上述的利用液相色谱纯化淀粉酶的方法，
步骤（1）中发酵的培养基为NB营养肉汤；
的NB营养肉汤中添加氯化钙，其中氯化钙的终浓度为0.1mM。
上述的利用液相色谱纯化淀粉酶的方法，
步骤（1）中发酵的时间为24h；
步骤（1）中发酵的温度为35℃；
步骤（1）中发酵的摇床转速为120rm；
步骤（1）中发酵的pH值为7.0。
上述的利用液相色谱纯化淀粉酶的方法，
步骤（1）中离心的转速为12000rpm；
步骤（1）中离心的时间为15min；
步骤（1）中离心的温度为4℃。
上述的利用液相色谱纯化淀粉酶的方法，
步骤（2）中凝胶过滤的缓冲液为PBS缓冲液；
步骤（2）中凝胶过滤的凝胶材质，以重量份计，包括以下组分：
葡聚糖 180份，
壳聚糖 90份，
β-磷酸三钙 30份，
环氧氯丙烷 0.8份，
上述的利用液相色谱纯化淀粉酶的方法，
步骤（2）中的凝胶材质的制备方法如下：
将葡聚糖、壳聚糖、β-磷酸三钙、环氧氯丙烷，利用超声处理2min，升温至45℃，然后静置混合孵育72h，即可。
上述的利用液相色谱纯化淀粉酶的方法，
步骤（2）中洗脱分离的色谱柱为赛默飞生产的052962型离子交换色谱柱。
上述的利用液相色谱纯化淀粉酶的方法，
步骤（2）中洗脱分离的预平衡液为20mM的磷酸钠缓冲液。
上述的利用液相色谱纯化淀粉酶的方法，
步骤（1）中发酵的pH值为7.0的具体调节步骤如下：
101、每隔20min使用针管纵向等距离提取至少三个位置上的提取液，使用pH检测试纸分别检测采集位置的pH值，设定为，其中n为提取的总数最大值，/>为i高度上采集的提取液的pH值；
102、计算溶液中各个纵向位置上的氢离子浓度，，其中/>为i高度上采集的提取液的氢离子浓度，同时提取各个高度上的容器的直径大小设为，其中/>为i高度上容器的直径，计算容器中整体的氢离子浓度，，其中h为容器中溶液的高度；
103、将计算容器中整体的氢离子浓度代入pH值计算公式中，计算整体溶液的pH值；
104、根据计算整体溶液的pH值计算添加的酸碱中和剂的含量，以准确添加酸碱中和剂。
上述的利用液相色谱纯化淀粉酶的方法，
103中的pH值计算公式适配为：；104中计算添加的酸碱中和剂的含量的具体步骤为：1041、采集添加的酸碱中和剂的pH值，设为/>；1042、求出酸碱中和剂的需要添加量/>。
实施例5
利用液相色谱纯化淀粉酶的方法，
包括以下步骤：
（1）粗淀粉酶的制备：准备枯草芽孢杆菌，进行发酵得到发酵液，接着将发酵液进行离心，取上清液，得到粗淀粉酶溶液；
（2）粗淀粉酶的纯化：将步骤（1）得到的粗淀粉酶溶液，先选择凝胶过滤，接着施加到色谱柱进行洗脱分离，即得到纯化后的淀粉酶溶液，低温烘干，即可。
上述的利用液相色谱纯化淀粉酶的方法，
步骤（1）中发酵的培养基为NB营养肉汤；
的NB营养肉汤中添加氯化钙，其中氯化钙的终浓度为0.1mM。
上述的利用液相色谱纯化淀粉酶的方法，
步骤（1）中发酵的时间为24h；
步骤（1）中发酵的温度为35℃；
步骤（1）中发酵的摇床转速为120rm；
步骤（1）中发酵的pH值为7.0。
上述的利用液相色谱纯化淀粉酶的方法，
步骤（1）中离心的转速为12000rpm；
步骤（1）中离心的时间为15min；
步骤（1）中离心的温度为4℃。
上述的利用液相色谱纯化淀粉酶的方法，
步骤（2）中凝胶过滤的缓冲液为PBS缓冲液；
步骤（2）中凝胶过滤的凝胶材质，以重量份计，包括以下组分：
葡聚糖 175份，
壳聚糖 100份，
β-磷酸三钙 40份，
环氧氯丙烷 1份，
上述的利用液相色谱纯化淀粉酶的方法，
步骤（2）中的凝胶材质的制备方法如下：
将葡聚糖、壳聚糖、β-磷酸三钙、环氧氯丙烷，利用超声处理2min，升温至45℃，然后静置混合孵育72h，即可。
上述的利用液相色谱纯化淀粉酶的方法，
步骤（2）中洗脱分离的色谱柱为赛默飞生产的052962型离子交换色谱柱。
上述的利用液相色谱纯化淀粉酶的方法，
步骤（2）中洗脱分离的预平衡液为20mM的磷酸钠缓冲液。
上述的利用液相色谱纯化淀粉酶的方法，
步骤（1）中发酵的pH值为7.0的具体调节步骤如下：
101、每隔20min使用针管纵向等距离提取至少三个位置上的提取液，使用pH检测试纸分别检测采集位置的pH值，设定为，其中n为提取的总数最大值，/>为i高度上采集的提取液的pH值；
102、计算溶液中各个纵向位置上的氢离子浓度，，其中/>为i高度上采集的提取液的氢离子浓度，同时提取各个高度上的容器的直径大小设为，其中/>为i高度上容器的直径，计算容器中整体的氢离子浓度，，其中h为容器中溶液的高度；
103、将计算容器中整体的氢离子浓度代入pH值计算公式中，计算整体溶液的pH值；
104、根据计算整体溶液的pH值计算添加的酸碱中和剂的含量，以准确添加酸碱中和剂。
上述的利用液相色谱纯化淀粉酶的方法，
103中的pH值计算公式适配为：；104中计算添加的酸碱中和剂的含量的具体步骤为：1041、采集添加的酸碱中和剂的pH值，设为/>；1042、求出酸碱中和剂的需要添加量/>。
对比例1
利用液相色谱纯化淀粉酶的方法，
包括以下步骤：
（1）粗淀粉酶的制备：准备枯草芽孢杆菌，进行发酵得到发酵液，接着将发酵液进行离心，取上清液，得到粗淀粉酶溶液；
（2）粗淀粉酶的纯化：将步骤（1）得到的粗淀粉酶溶液，先选择凝胶过滤，接着施加到色谱柱进行洗脱分离，即得到纯化后的淀粉酶溶液，低温烘干，即可。
上述的利用液相色谱纯化淀粉酶的方法，
步骤（1）中发酵的培养基为NB营养肉汤；
的NB营养肉汤中添加氯化钙，其中氯化钙的终浓度为0.1mM。
上述的利用液相色谱纯化淀粉酶的方法，
步骤（1）中发酵的时间为24h；
步骤（1）中发酵的温度为35℃；
步骤（1）中发酵的摇床转速为120rm；
步骤（1）中发酵的pH值为7.0。
上述的利用液相色谱纯化淀粉酶的方法，
步骤（1）中离心的转速为12000rpm；
步骤（1）中离心的时间为15min；
步骤（1）中离心的温度为4℃。
上述的利用液相色谱纯化淀粉酶的方法，
步骤（2）中凝胶过滤的缓冲液为PBS缓冲液；
步骤（2）中凝胶过滤的凝胶材质，以重量份计，包括以下组分：
葡聚糖 175份，
β-磷酸三钙 40份，
环氧氯丙烷 1份。
上述的利用液相色谱纯化淀粉酶的方法，
步骤（2）中的凝胶材质的制备方法如下：
将葡聚糖、β-磷酸三钙、环氧氯丙烷，利用超声处理2min，升温至45℃，然后静置混合孵育72h，即可。
上述的利用液相色谱纯化淀粉酶的方法，
步骤（2）中洗脱分离的色谱柱为赛默飞生产的052962型离子交换色谱柱。
上述的利用液相色谱纯化淀粉酶的方法，
步骤（2）中洗脱分离的预平衡液为20mM的磷酸钠缓冲液。
对比例2
利用液相色谱纯化淀粉酶的方法，
包括以下步骤：
（1）粗淀粉酶的制备：准备枯草芽孢杆菌，进行发酵得到发酵液，接着将发酵液进行离心，取上清液，得到粗淀粉酶溶液；
（2）粗淀粉酶的纯化：将步骤（1）得到的粗淀粉酶溶液，先选择凝胶过滤，接着施加到色谱柱进行洗脱分离，即得到纯化后的淀粉酶溶液，低温烘干，即可。
上述的利用液相色谱纯化淀粉酶的方法，
步骤（1）中发酵的培养基为NB营养肉汤；
的NB营养肉汤中添加氯化钙，其中氯化钙的终浓度为0.1mM。
上述的利用液相色谱纯化淀粉酶的方法，
步骤（1）中发酵的时间为24h；
步骤（1）中发酵的温度为35℃；
步骤（1）中发酵的摇床转速为120rm；
步骤（1）中发酵的pH值为7.0。
上述的利用液相色谱纯化淀粉酶的方法，
步骤（1）中离心的转速为12000rpm；
步骤（1）中离心的时间为15min；
步骤（1）中离心的温度为4℃。
上述的利用液相色谱纯化淀粉酶的方法，
步骤（2）中凝胶过滤的缓冲液为PBS缓冲液；
步骤（2）中凝胶过滤的凝胶材质，以重量份计，包括以下组分：
葡聚糖 175份，
壳聚糖 100份，
环氧氯丙烷 1份。
上述的利用液相色谱纯化淀粉酶的方法，
步骤（2）中的凝胶材质的制备方法如下：
将葡聚糖、壳聚糖、环氧氯丙烷，利用超声处理2min，升温至45℃，然后静置混合孵育72h，即可。
上述的利用液相色谱纯化淀粉酶的方法，
步骤（2）中洗脱分离的色谱柱为赛默飞生产的052962型离子交换色谱柱。
上述的利用液相色谱纯化淀粉酶的方法，
步骤（2）中洗脱分离的预平衡液为20mM的磷酸钠缓冲液。
对比例3
利用液相色谱纯化淀粉酶的方法，
包括以下步骤：
（1）粗淀粉酶的制备：准备枯草芽孢杆菌，进行发酵得到发酵液，接着将发酵液进行离心，取上清液，得到粗淀粉酶溶液；
（2）粗淀粉酶的纯化：将步骤（1）得到的粗淀粉酶溶液，先选择凝胶过滤，接着施加到色谱柱进行洗脱分离，即得到纯化后的淀粉酶溶液，低温烘干，即可。
上述的利用液相色谱纯化淀粉酶的方法，
步骤（1）中发酵的培养基为NB营养肉汤；
的NB营养肉汤中添加氯化钙，其中氯化钙的终浓度为0.1mM。
上述的利用液相色谱纯化淀粉酶的方法，
步骤（1）中发酵的时间为24h；
步骤（1）中发酵的温度为35℃；
步骤（1）中发酵的摇床转速为120rm；
步骤（1）中发酵的pH值为7.0。
上述的利用液相色谱纯化淀粉酶的方法，
步骤（1）中离心的转速为12000rpm；
步骤（1）中离心的时间为15min；
步骤（1）中离心的温度为4℃。
上述的利用液相色谱纯化淀粉酶的方法，
步骤（2）中凝胶过滤的缓冲液为PBS缓冲液；
步骤（2）中凝胶过滤的凝胶材质，以重量份计，包括以下组分：
明胶 175份，
壳聚糖 100份，
β-磷酸三钙 40份，
环氧氯丙烷 1份。
上述的利用液相色谱纯化淀粉酶的方法，
步骤（2）中的凝胶材质的制备方法如下：
将明胶、壳聚糖、β-磷酸三钙、环氧氯丙烷，利用超声处理2min，升温至45℃，然后静置混合孵育72h，即可。
上述的利用液相色谱纯化淀粉酶的方法，
步骤（2）中洗脱分离的色谱柱为赛默飞生产的052962型离子交换色谱柱。
上述的利用液相色谱纯化淀粉酶的方法，
步骤（2）中洗脱分离的预平衡液为20mM的磷酸钠缓冲液。
实施例6
选择实施例1-5配制的淀粉酶及对比例1-3配制的淀粉酶，进行下述测试。
参照在先文献（ema Agüloğlu Fincan, Sadin Özdemir, Adem Karakaya, BarışEnez, Sibel Demiroğlu Mustafov, Mehmet Sefa Ulutaş, Fatih Şen, Purificationand characterization of thermostable α-amylase produced from Bacilluslicheniformis So-B3 and its potential in hydrolyzing raw starch, LifeSciences, Volume 264, 2021, 118639, ISSN 0024-3205, https://doi.org/10.1016/j.lfs.2020.118639.）进行相关指标测定，结果见下表1：
表1实施例1-5及对比例1-3配制的淀粉酶的酶活力和产率测试结果
酶活力（U/mg） 产率（%）
对比例1 101 4.25
对比例2 94 3.87
对比例3 82 4.56
实施例1 133 7.23
实施例2 135 7.44
实施例3 141 7.67
实施例4 147 7.82
实施例5 150 7.85
从以上结果（表1）可以看出，本发明的工艺方法对于淀粉酶的纯化具有明显的提升作用，使用后不仅产率提升，而且酶活力的保留较大。具体来说，利用枯草芽孢杆菌进行有效发酵，可以得到高产率的淀粉酶，同时，合适的凝胶过滤的凝胶材质能够有效过滤杂质，起到提纯淀粉酶的效果，并利用合适的洗脱分离工艺实现淀粉酶活性的保留。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术专利，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术专利也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。

Claims (7)

1.利用液相色谱纯化淀粉酶的方法，其特征在于：
包括以下步骤：
（1）粗淀粉酶的制备：准备枯草芽孢杆菌，进行发酵得到发酵液，接着将发酵液进行离心，取上清液，得到粗淀粉酶溶液；步骤（1）中发酵的pH值为7.0；步骤（1）中发酵的pH值为7.0的具体调节步骤如下：
101、每隔20min使用针管纵向等距离提取至少三个位置上的提取液，使用pH检测试纸分别检测采集位置的pH值，设定为，其中n为提取的总数最大值，/>为i高度上采集的提取液的pH值；
102、计算溶液中各个纵向位置上的氢离子浓度，，其中/>为i高度上采集的提取液的氢离子浓度，同时提取各个高度上的容器的直径大小设为/>，其中为i高度上容器的直径，计算容器中整体的氢离子浓度，/>，其中h为容器中溶液的高度；
103、将计算容器中整体的氢离子浓度代入pH值计算公式中，计算整体溶液的pH值；
104、根据计算整体溶液的pH值计算添加的酸碱中和剂的含量，以准确添加酸碱中和剂；
所述103中的pH值计算公式适配为：；
所述104中计算添加的酸碱中和剂的含量的具体步骤为：
1041、采集添加的酸碱中和剂的pH值，设为；
1042、求出酸碱中和剂的需要添加量；
所述枯草芽孢杆菌的分类命名为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，保藏编号为CGMCC NO.16139，保藏日期为2018年7月20日，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；
（2）粗淀粉酶的纯化：将步骤（1）得到的粗淀粉酶溶液，先选择凝胶过滤，接着施加到色谱柱进行洗脱分离，即得到纯化后的淀粉酶溶液，然后烘干；步骤（2）中凝胶过滤的缓冲液为PBS缓冲液；
步骤（2）中凝胶过滤的凝胶材质，以重量份计，包括以下组分：
葡聚糖 150份-200份，
壳聚糖 80份-120份，
β-磷酸三钙 20份-60份，
环氧氯丙烷 0.5份-1.5份。
2.根据权利要求1所述的利用液相色谱纯化淀粉酶的方法，其特征在于：
步骤（1）中发酵采用的培养基为NB营养肉汤；
所述NB营养肉汤中添加氯化钙，其中氯化钙的终浓度为0.1mM。
3.根据权利要求1所述的利用液相色谱纯化淀粉酶的方法，其特征在于：
步骤（1）中发酵的时间为24h；
步骤（1）中发酵的温度为35℃；
步骤（1）中发酵的摇床转速为120rm。
4.根据权利要求1所述的利用液相色谱纯化淀粉酶的方法，其特征在于：
步骤（1）中离心的转速为12000rpm；
步骤（1）中离心的时间为15min；
步骤（1）中离心的温度为4℃。
5.根据权利要求4所述的利用液相色谱纯化淀粉酶的方法，其特征在于：
步骤（2）中所述凝胶材质的制备方法如下：
将葡聚糖、壳聚糖、β-磷酸三钙、环氧氯丙烷，利用超声处理2min，升温至45℃，然后静置混合孵育72h。
6.根据权利要求1所述的利用液相色谱纯化淀粉酶的方法，其特征在于：
步骤（2）中洗脱分离的色谱柱为052962型离子交换色谱柱。
7.根据权利要求1所述的利用液相色谱纯化淀粉酶的方法，其特征在于：
步骤（2）中洗脱分离采用的预平衡液为20mM的磷酸钠缓冲液。
CN202310510465.0A 2023-05-08 2023-05-08 利用液相色谱纯化淀粉酶的方法 Active CN116286746B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202310510465.0A CN116286746B (zh) 2023-05-08 2023-05-08 利用液相色谱纯化淀粉酶的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202310510465.0A CN116286746B (zh) 2023-05-08 2023-05-08 利用液相色谱纯化淀粉酶的方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN116286746A CN116286746A (zh) 2023-06-23
CN116286746B true CN116286746B (zh) 2023-08-15

Family

ID=86798049

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202310510465.0A Active CN116286746B (zh) 2023-05-08 2023-05-08 利用液相色谱纯化淀粉酶的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN116286746B (zh)

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB1222396A (en) * 1970-06-02 1971-02-10 Forsch Die Gaerungsindustrie E A process of producing glucane decomposing enzymes
SU841351A1 (ru) * 1979-01-10 1983-11-23 Всесоюзный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов Способ получени @ -амилазы
SU1573025A1 (ru) * 1988-05-12 1990-06-23 Всесоюзный научно-исследовательский противочумный институт "Микроб" Способ получени @ -амилазы
CN103224920A (zh) * 2013-02-04 2013-07-31 江南大学 一种枯草芽孢杆菌耐高温β-淀粉酶分离纯化的方法
CN104630084A (zh) * 2013-11-14 2015-05-20 邵素英 一株产耐高温α-淀粉酶的枯草芽孢杆菌
CN108823127A (zh) * 2018-06-22 2018-11-16 天津大学 用于产α-淀粉酶的菌株和α-淀粉酶的分离纯化方法

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB1222396A (en) * 1970-06-02 1971-02-10 Forsch Die Gaerungsindustrie E A process of producing glucane decomposing enzymes
SU841351A1 (ru) * 1979-01-10 1983-11-23 Всесоюзный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов Способ получени @ -амилазы
SU1573025A1 (ru) * 1988-05-12 1990-06-23 Всесоюзный научно-исследовательский противочумный институт "Микроб" Способ получени @ -амилазы
CN103224920A (zh) * 2013-02-04 2013-07-31 江南大学 一种枯草芽孢杆菌耐高温β-淀粉酶分离纯化的方法
CN104630084A (zh) * 2013-11-14 2015-05-20 邵素英 一株产耐高温α-淀粉酶的枯草芽孢杆菌
CN108823127A (zh) * 2018-06-22 2018-11-16 天津大学 用于产α-淀粉酶的菌株和α-淀粉酶的分离纯化方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN116286746A (zh) 2023-06-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Zambare Solid state fermentation of Aspergillus oryzae for glucoamylase production on agro residues
CN109750070B (zh) 一种功能性桑叶低聚糖及其制备方法和应用
CN113832083B (zh) 一种贝莱斯芽孢杆菌及其在食醋酿造中的应用
CN103695341B (zh) 一种由海洋细菌分泌的褐藻胶裂解酶及其制备方法
NL2028177B1 (en) Process for producing acetoin by utilizing wheat b-starch
CN114292827A (zh) 一种含甘油葡萄糖苷和酵母发酵产物的组合物及其制备方法
CN102093989B (zh) 微生物发酵生产低温生淀粉糖化酶的方法
CN104877911B (zh) 一种黑曲霉及其在低聚异麦芽糖生产中的应用
CN116286746B (zh) 利用液相色谱纯化淀粉酶的方法
CN108531418B (zh) 一种壳聚糖酶的制备方法
CN109456898B (zh) 一种球毛壳菌右旋糖酐酶的发酵制备及其应用
CN112662572B (zh) 一种高产壳聚糖酶的菌株及其应用
CN106929489B (zh) 一种耐热耐酸葡萄糖氧化酶的发酵制备及分离纯化方法
CN106929425B (zh) 一种耐高温酸性嗜热子囊菌纤维素酶、其制备方法和应用
CN112358985B (zh) 普沙根瘤菌及其在制备水溶性β-1，3葡聚糖中的应用
CN112094762B (zh) 一株葡萄牙棒孢酵母菌株及其应用
CN107365730A (zh) 枯草芽孢杆菌菌株及利用该菌株生产支链淀粉酶的方法
CN107236772A (zh) 一种制备褐藻寡糖的方法
CN107937318B (zh) 一株降解小麦戊聚糖的枯草芽孢杆菌mxt-1及其应用
CN113564079A (zh) 一种产蔗糖磷酸化酶的多黏类芽孢杆菌及其应用
Mostafa et al. Optimization of Aeration and Agitation for α-amylase production by Aspergillus flavus from water hyacinth
CN110257452A (zh) 一种从酶解液中分离提纯褐藻寡糖单体的方法
CN117417869B (zh) 一株约氏黄杆菌w24h及其生产2,3-丁二醇的应用
CN102994487B (zh) 酸性脲酶的生产方法
CN114134057B (zh) 一株酿酒酵母swgcjm001及其培养方法和应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant