CN110257452A - 一种从酶解液中分离提纯褐藻寡糖单体的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种从酶解液中分离提纯褐藻寡糖单体的方法，采用酶解降解褐藻胶得到酶解液，再通过沉降法去除酶解液中的酶及大分子的褐藻胶得到粗提液，再将利用大孔树脂进行吸附；静止吸附候梯度洗脱，再通过减压浓缩得到产品单品。本发明工艺简单，生产成本低，适合于工业化生产，具有一定的社会、经济效益。
Description
技术领域
本发明涉及生物分离工程领域，主要涉及的一种从酶解液中分离提纯褐藻寡糖单体的方法。
背景技术
褐藻寡糖具有广阔的应用前景，目前研究表明，褐藻寡糖在抗癌、抗凝、降脂、免疫调节和抗衰老、促进植物生长等领域有明显的功能性表现。并且在自然界中褐藻寡糖分布十分广泛，在植物和微生物中都发现有褐藻寡糖的存在。特别是在海洋动植物体内有着较高的含量。
褐藻胶是由-1，4-甘露糖醛酸(M)和-1，4-古洛糖醛酸(G)不规则链接起来的线性长链分子，其通过裂解反应可以得到功能性寡糖即为褐藻寡糖。目前获得褐藻胶寡糖的制备方法主要有物理降解、化学降解法和酶解法。目前相对于物理法和化学法，生物酶法制备褐藻寡糖有着条件温和，副产物少，环境友好等特点，因此受到很多科研工作者的关注。聚合度高的褐藻寡糖可以作为材料使用，但生物功能活性低，不同聚合度的低聚褐藻寡糖具有不一样的生物功能性，但是在工业生产中，由于其理化性质的相似性，褐藻寡糖各个单体的分离纯化是一个难题。
发明内容
本发明针对褐藻寡糖单体分离难的问题，提出一种从酶解液中分离提纯褐藻寡糖单体的新方法。
本发明的技术方案为：一种从酶解液中分离提纯褐藻寡糖单体的方法，具体步骤如下：A、将枯草芽孢杆菌NJWGYHYH20130799活化后在发酵培养基中进行发酵培养得发酵液；B、将发酵液用超声机进行微生物细胞破碎，并通过离心去除细胞碎片，上清液即为粗酶液；C、将粗酶液添加于褐藻浆液或褐藻胶溶液中，进行酶解后再离心处理，取上清液，得到酶解液；D、将酶解液烘干后溶于高浓度的有机溶剂中，然后过滤，所得滤液的褐藻寡糖单体粗品；E、先将强阴离子交换树脂预处理后，将步骤D 得到的滤液pH值调到5.0～6.5并将其缓慢加到柱床上，然后用不同浓度的甲酸铵缓冲液进行梯度洗脱，洗脱液中含有的溶质即为褐藻寡糖寡聚单体。
上述步骤A中发酵培养基的组分为：海藻酸钠20～40g/L，酵母膏4～8g/L，蛋白胨8～15g/L，NaCl 2～6g/L。
优选步骤A中发酵培养的温度为35～38℃，转速为 150～180r/min，发酵培养时间为36～48小时。
优选步骤C中粗酶液的添加量为粗酶液添加入褐藻浆液或褐藻胶溶液中后粗酶液的体积百分含量为5～8.5％；所述的酶解为在35～38℃摇床内酶解 24～36h。
优选步骤D中所述的高浓度的有机溶剂为体积浓度为85％～95％的乙醇溶液。洗脱后得到聚合度为1～6的海藻寡糖。
优选步骤E中的强阴离子交换树脂为Dowex1×4强阴离子交换树脂；上述强阴离子交换树脂的预处理方式分别用浓度为1M的氢氧化钠溶液、盐酸溶液、氢氧化钠溶液依次浸泡活化，再用蒸馏水洗至中性。
优选洗脱液选取0.1M～2M浓度的甲酸铵缓冲液。
上述的枯草芽孢杆菌，其分类命名为枯草芽孢杆菌，菌种的拉丁学名是Bacillussubtilis，参据的微生物：NJWGYHYH20130799，保藏日期是2014年01月17日，保藏中心登记入册编号是CGMCC No.8734。
枯草芽孢杆菌具有下述性质：
(1)形态与培养特征：
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，是芽孢杆菌属的一种，革兰染色阳性菌，单个细胞0.7～0.8×2～μ3m，着色均匀。无荚膜，周生鞭毛，能运动。革兰氏阳性菌，芽孢0.6～0.9×1.0～1μ.5m，椭圆到柱状，位于菌体中央或稍偏，芽孢形成后菌体不膨大。菌落表面粗糙不透明，污白色或微黄色，在液体培养基中生长时，常形成皱醭，需氧菌。可利用蛋白质、多种糖及淀粉，分解色氨酸形成吲哚。
(2)生理生化特性：
主要生理生化特征见表1：
表1菌株的生理生化特征
注：+：阳性或生长；－：阴性或不生长
有益效果：
本发明工艺简单，生产成本低，适合于工业化生产，解决了褐藻寡糖单体分离难的问题，具有一定的社会、经济效益。
保藏信息
上述枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis CGMCC No.8734是由本实验室选育并保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区北辰西路1号院，中国科学院微生物所)，其简称为CGMCC，登记入册的编号是CGMCC No.8734，保藏日期是：2014年01月17日。得到聚合度为1～6的海藻寡糖。
具体实施方式
以下结合实例来进一步解释本发明，但实施案例并不对本发明做任何形式的限定。
实施例1：
将枯草芽孢杆菌NJWGYHYH20130799活化后进行发酵培养：发酵培养基为海藻酸钠20g/L，酵母膏8g/L，蛋白胨8g/L，NaCl 6g/L，35℃, 转速为180r/min培养42小时获得发酵液。将发酵液用KQ-100型超声机进行微生物细胞破碎，并通过离心去除细胞碎片，上清液即为粗酶液。将所述粗酶液按体积分数7％添加于褐藻浆液中，并于35℃摇床内酶解 24h后再离心处理，取上清液，得到所述酶解液。将酶解液烘干后溶于体积分数 90％浓度的乙醇过滤，所得滤液为聚合度为海藻寡糖单体。Dowex1×4强阴离子交换树脂用各自浓度为1M的氢氧化钠溶液、盐酸溶液、氢氧化钠溶液依次浸泡活化，再用蒸馏水洗至中性。将上述滤液用盐酸溶液将pH值调到5.0并将其缓慢加到柱床上，用0.1M、0.5M、1M、2M 浓度的甲酸铵缓冲液进行梯度洗脱，洗脱液即为所属海藻寡糖寡聚单体。TLC检测后将洗脱液组分相同的样本，汇集，浓缩。通过高效液相色谱检测，所得到的海藻寡糖单体(1糖到6糖)纯度依次为98.3％、98.5％、97.7％、 98.7％、97.3％、98.8％。
实施例2：
将枯草芽孢杆菌NJWGYHYH20130799活化后进行发酵培养：发酵培养基为海藻酸钠40g/L，酵母膏4g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 2g/L， 38℃，转速为160r/min培养36小时获得发酵液。将发酵液用KQ-100 型超声机进行微生物细胞破碎，并通过离心去除细胞碎片，上清液即为粗酶液。将所述粗酶液按体积分数8％添加于褐藻胶溶液中，并于37℃摇床内酶解36h后再离心处理，取上清液，得到所述酶解液。将酶解液烘干后溶于体积分数85％浓度的乙醇过滤，所得滤液为聚合度为海藻寡糖单体。
Dowex1×4强阴离子交换树脂用各自浓度为1M的氢氧化钠溶液、盐酸溶液、氢氧化钠溶液依次浸泡活化，再用蒸馏水洗至中性。将上述滤液用盐酸溶液将pH值调到5.5并将其缓慢加到柱床上，用0.1M、 0.5M、1M、2M浓度的甲酸铵缓冲液进行梯度洗脱，洗脱液即为所属海藻寡糖寡聚单体。TLC检测后将洗脱液组分相同的样本，汇集，浓缩。通过高效液相色谱检测，所得到的海藻寡糖单体(1糖到6糖)纯度依次为97.4％、 97.8％、97.1％、98.1％、97.7％、97.3％。
实施例3：
将枯草芽孢杆菌NJWGYHYH20130799活化后进行发酵培养：发酵培养基为海藻酸钠30g/L，酵母膏6g/L，蛋白胨15g/L，NaCl 4g/L， 38℃，转速为150r/min培养48小时获得发酵液。将发酵液用KQ-100 型超声机进行微生物细胞破碎，并通过离心去除细胞碎片，上清液即为粗酶液。将所述粗酶液按体积分数5％添加于褐藻浆液中，并于38℃摇床内酶解36h后再离心处理，取上清液，得到所述酶解液。将酶解液烘干后溶于体积分数95％浓度的乙醇过滤，所得滤液为聚合度为海藻寡糖单体。Dowex1×4 强阴离子交换树脂用各自浓度为1M的氢氧化钠溶液、盐酸溶液、氢氧化钠溶液依次浸泡活化，再用蒸馏水洗至中性。将上述滤液用盐酸溶液将pH值调到6.5并将其缓慢加到柱床上，用0.1M、0.5M、1M、 2M浓度的甲酸铵缓冲液进行梯度洗脱，洗脱液即为所属海藻寡糖寡聚单体。TLC检测后将洗脱液组分相同的样本，汇集，浓缩。通过高效液相色谱检测，所得到的海藻寡糖单体(1糖到6糖)纯度依次为96.7％、97.3％、 96.2％、97.6％、97.1％、97.7％。
Claims (6)
1.一种从酶解液中分离提纯褐藻寡糖单体的方法，具体步骤如下：A、将枯草芽孢杆菌NJWGYHYH20130799活化后在发酵培养基中进行发酵培养得发酵液；B、将发酵液用超声机进行微生物细胞破碎，并通过离心去除细胞碎片，上清液即为粗酶液；C、将粗酶液添加于褐藻浆液或褐藻胶溶液中，进行酶解后再离心处理，取上清液，得到酶解液；D、将酶解液烘干后溶于高浓度的有机溶剂中，然后过滤，所得滤液的褐藻寡糖单体粗品；E、先将强阴离子交换树脂预处理后，将步骤D得到的滤液pH值调到5.0～6.5并将其加到柱床上，然后用不同浓度的甲酸铵缓冲液进行梯度洗脱，洗脱液中含有的溶质即为褐藻寡糖寡聚单体。
2.按权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤A中发酵培养基的组分为：海藻酸钠20～40g/L，酵母膏4～8g/L，蛋白胨8～15g/L，NaCl 2～6g/L。
3.按权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤A中发酵培养的温度为35～38℃，转速为150～180r/min，发酵培养时间为36～48小时。
4.按权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤C中粗酶液的添加量为粗酶液添加入褐藻浆液或褐藻胶溶液中后粗酶液的体积百分含量为5～8.5％；所述的酶解为在35～38℃摇床内酶解24～36h。
5.按权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤D中所述的高浓度的有机溶剂为体积浓度为85％～95％的乙醇溶液。
6.按权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤E中的强阴离子交换树脂为Dowex1×4强阴离子交换树脂；洗脱液选取0.1M～2M浓度的甲酸铵缓冲液。
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