CN101074246A - 一种褐藻胶寡糖的制备方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及糖类的制备及其应用，特别涉及的是一种以褐藻胶为原料制备作为抑菌剂的褐藻胶寡糖的方法，特点是用超声波对1－5％的褐藻胶溶液，在温度40－80℃、pH值为2－5下降解7－10小时后，降解液加入无水乙醇进行醇析，抽滤，烘干，研磨即得褐藻胶寡糖，其平均聚合度10以下。本发明还提出将制备的褐藻胶寡糖，用作细菌或真菌的抑菌剂应用。本发明通过抑菌实验，证明褐藻胶寡糖无论对革兰氏阴性菌或阳性菌，都能有效抑制其生长，表现出广谱抗菌活性；通过动物急性炎症实验，证明褐藻寡糖具有抗炎作用和一定的镇痛作用。本发明的制备方法具有操作及工艺路线简单，设备少，成本低等优点。

Description

一种褐藻胶寡糖的制备方法及应用

技术领域

本发明涉及糖类的制备及其应用，特别涉及的是一种以褐藻胶为原料制备作为抑菌剂的褐藻胶寡糖的方法。

背景技术

聚合度在2～20之间的糖基聚合体定义为寡糖，与褐藻胶高聚物相比，寡糖具有溶解性强、稳定性好、易被机体吸收等优点。近年来，不少专家学者对制备褐藻胶寡糖进行了研究，例2004年8月11日公告的CN1161368C的中国发明专利说明书中公开的“一种褐藻胶寡糖的制造方法”，该方法采用的是褐藻胶在氧化剂存在下的酸水解，存在需要在强酸环境中进行，工艺条件不易控制的不足；2004年12月29日公告的CN1182146C的中国发明专利说明书中公开的“一种利用化学氧化制备褐藻胶寡糖的方法”，由于过氧化氢的使用，存在化学残留和去除问题；2003年11月12日公开的CN1454992的中国发明专利说明书公开的“一种新的褐藻胶裂合酶及其制备方法和应用”，利用制得的褐藻胶裂合酶将褐藻胶酶解生产褐藻胶寡糖。虽然容易获得分子量集中的寡糖，但是，由于酶制备方法麻烦，成本偏高而受到限制。

近年来，由于抗菌素的大量使用，使环境受到污染，细菌基因突变而产生耐药性，并且耐药率逐渐提高，几乎所有细菌都获得耐药基因，这一问题已日趋严重。对付细菌耐药性除了合理运用抗生素外，主要对策就是研制开发对耐药菌株有效的新药和新制剂。近年来，褐藻胶的生理活性不断被揭示，尤其在促生长作用、增强机体免疫功能、抗肿瘤和对神经元损伤的保护作用等方面的研究，日益引起人们的关注，从而使褐藻胶得到进一步的应用。而褐藻胶寡糖的用途只在2004年8月4日公告的CN1160080C的中国发明专利说明书所公开的“褐藻胶寡糖作为制备预防因东莨菪碱所致痴呆药物的应用”中提出，是用作抗衰老和抗痴呆的药物。然而，褐藻胶寡糖作为天然的具有高效抑菌活性的抑菌剂，到目前为止，国内外还没有相关报道。

发明内容

为了克服现有技术中工艺条件不易控制、成本较高、化学物质残留等方面的不足，本发明提供一种操作及工艺路线简单，设备少，成本低的具有高效抑菌活性的褐藻胶寡糖的制备方法。

本发明解决技术问题所采用的技术方案是：一种褐藻胶寡糖的制备方法，特点是：用超声波对1-5％的褐藻胶溶液，在温度40-80℃、pH值为2-5下降解7-10小时后，降解液加入无水乙醇进行醇析，抽滤，烘干，研磨即得褐藻胶寡糖，其平均聚合度10以下。

上述的超声波的频率为150Hz。

上述的褐藻胶溶液是由褐藻胶固体与2.5％的醋酸溶液配制而成。

本发明还提出上述制备的褐藻胶寡糖，可用作细菌或真菌的抑菌剂。该褐藻胶寡糖作为天然的具有高效抑菌活性能弥补现有技术的不足。

所述的细菌可为藤黄微球菌或金黄色葡萄球菌或枯草芽孢杆菌或大肠杆菌。

所述的真菌可为啤酒酵母。

所述的对藤黄微球菌或金黄色葡萄球菌或大肠杆菌的最低抑菌浓度仅为0.2-0.7％，对枯草芽孢杆菌最低抑菌浓度为0.5-2.5％，

所述的对啤酒酵母的最低抑菌浓度则为1-10％。

本发明的制备方法具有操作及工艺路线简单，设备少，成本低等优点。本发明通过抑菌实验，证明褐藻胶寡糖无论对革兰氏阴性菌或阳性菌，都能有效抑制其生长，表现出广谱抗菌活性；通过动物急性炎症实验，证明褐藻寡糖具有抗炎作用和一定的镇痛作用。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明做进一步说明。

实施例1

褐藻胶寡糖按下列方法制备的：取粘均分子量为12.8万的褐藻胶固体5.0g，用2.5％的醋酸溶液配成1.25％的褐藻胶溶液400mL，当温度在60℃、pH值为4.0值时，用150Hz的超声波在功率为80％的条件下，进行超声波降解8小时，其降解液加入无水乙醇进行醇析，抽滤，烘干，研磨即得褐藻胶寡糖4.6g。其平均聚合度为8。

实施例2

褐藻胶寡糖按下列方法制备的：取粘均分子量为12.8万的褐藻胶固体12.0g，用2.5％的醋酸溶液配成3.0％的褐藻胶溶液400mL，当温度为80℃，pH值为3.0时，用150Hz的超声波在功率为80％的情况下，进行超声波降解10小时，其降解液加入无水乙醇进行醇析，抽滤，烘干，研磨即得褐藻胶寡糖10.5g。其平均聚合度为10。

下面通过对实验方法和实验结果说明褐藻胶寡糖可作为天然的具有高效抑菌活性的抑菌剂使用做详细叙述。

制备的褐藻胶寡糖抑菌实验的筛选及效果评价方法如下：

以2.5％褐藻胶，2.5％苯甲酸钠及生理盐水为对照，研究2.5％褐藻胶寡糖溶液对枯草芽孢杆菌等细菌的抑菌效果。经24h或72h培养后，观察样品液对不同菌种的抑制效果，用游标卡尺测量抑菌圈大小，具体数值如下表：

            褐藻胶寡糖对细菌的抑制效果(抑菌圈直径，mm)

菌种	2.5％寡糖	2.5％褐藻胶	2.5％苯甲酸钠	生理盐水
					枯草芽孢杆菌大肠杆菌藤黄微球菌金黄色葡萄球菌	20.1020.7828.0028.16	----	----	----

由表中可知，藤黄微球菌和金黄色葡萄球菌的抑菌圈最大，枯草芽孢杆菌和大肠杆菌的抑菌圈次之。说明，褐藻胶寡糖对藤黄微球菌和金黄色葡萄球菌的生长抑制作用最强，对枯草芽孢杆菌和大肠杆菌的生长抑制作用次之。由此可看出：褐藻胶寡糖对细菌的生长均有抑制作用。其中，对藤黄微球菌和金黄色葡萄球菌抑制效果较明显，对枯草芽孢杆菌和大肠杆菌生长抑制效果较次之。

同样，以5％苯甲酸钠和生理盐水为对照，研究5％褐藻胶寡糖溶液对青霉等真菌的抑制作用，实验数据如下表：

     褐藻胶寡糖对真菌的抑制效果(抑菌圈直径，mm)

菌种	5％寡糖	5％苯甲酸钠	生理盐水
				青霉黑曲霉啤酒酵母	--13.22	---	---

由表中表明：褐藻胶寡糖溶液对啤酒酵母稍有抑制作用外，对曲霉和青霉则无抑制效果。而对照组褐藻胶、苯甲酸钠溶液和生理盐水对细菌和真菌的生长均无抑制效果。

同时也考察了褐藻胶寡糖抑菌剂对细菌和真菌的最低抑菌浓度，实验数据如下表：

      褐藻胶寡糖对几种微生物的最低抑菌浓度

菌种	最低抑菌浓度(质量百分比浓度，％)
		枯草芽孢杆菌大肠杆菌藤黄微球菌金黄色葡萄球菌啤酒酵母	2.5％0.625％0.625％0.625％10.0％

得出：对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、藤黄微球菌的最低抑菌浓度仅为0.2-0.7％，对枯草芽孢杆菌最低抑菌浓度为0.5-2.5％，而对啤酒酵母的最低抑菌浓度则为1-10％。

总而言之，无论是革兰氏阴性还是阳性菌，本发明中的褐藻胶寡糖作为抑菌剂都能有效抑制其生长，表现出广谱抗菌活性。

通过建立以血管通透性为主要改变的动物急性炎症模型来进一步说明褐藻胶寡糖对急性炎症的抑制作用及效果。

1、褐藻胶寡糖对二甲苯致小鼠耳肿胀的消炎效果

取小鼠50只，雌雄各半，随机分成5组，每组10只，暂养一段时间，待适应环境后开始实验。第1组颈背部皮下注射无菌生理盐水，作为阴性对照组；第2组注射剂量为25mg/kg鼠体重的氢化可的松稀乙醇溶液，作为阳性对照组；第3、4、5组分别注射剂量为50mg/kg、100mg/kg、200mg/kg鼠体重的褐藻胶寡糖溶液，注射量为每只0.5ml。各组分别在实验前一天给药，实验当天各组给药1.5h后，在每只小鼠右耳前后两面分别均匀涂布二甲苯0.02ml致炎。致炎约1h后，将小鼠颈椎脱臼致死，沿耳廓基线剪下两耳，用直径6mm打孔器分别在两耳的同一部位打下圆耳片，称重，精确到0.0001g。右耳片与左耳片的重量差即为肿胀度，肿胀抑制率计算公式如下：抑制率(％)＝100×(对照组平均肿胀度-给药组平均肿胀度)/对照组平均肿胀度。肿胀厚度经方差分析，比较给药组和生理盐水组组间差异。

2、褐藻胶寡糖对鸡蛋清致大鼠足爪肿胀的消炎效果评价

取大鼠21只，雌雄各半，随机分为3组，每组7只，暂养一段时间。第1组右腹部皮下注射无菌生理盐水，作为阴性对照组；第2组注射剂量为25ml/kg鼠体重的氢化可的松稀乙醇溶液，作为阳性对照组；第3组注射剂量为80mk/kg鼠体重的褐藻胶寡糖溶液，注射量为每只1.3ml。各组分别在实验前一天给药，实验当天各组给药约2h后，在每只大鼠右后足跖注射10％新鲜鸡蛋清0.1ml(生理盐水配制)。于致炎后30min，1.5h，2.5h，4.5h用游标卡尺测量足爪厚度，观察厚度达到高峰时间和消退时间。以致炎前后足爪厚度的差值为肿胀厚度，厚度减少百分率作为抑制率，计算公式如下：抑制率(％)＝100×(对照组平均肿胀厚度-给药组平均肿胀厚度)/对照组平均肿胀厚度。肿胀厚度经方差分析，比较给药组和生理盐水组间差异。

实验结果表明：所制备的褐藻胶寡糖能明显抑制二甲苯致小鼠耳肿胀炎症反应，对肿胀的抑制率呈明显的剂量依赖关系，抑制作用随剂量的增加而增加。当褐藻胶寡糖剂量为100mg/kg时，抑制二甲苯致小鼠耳肿胀作用优于剂量为25mg/kg的氢化可的松。褐藻胶寡糖对鸡蛋清致大鼠足爪肿胀有抑制作用，总体效果低于氢化可的松，当时间达到4.5h时，抑制率与氢化可的松相当，抑制作用较持久。

总之，褐藻胶寡糖对动物急性炎症模型具有抗炎作用和一定的镇痛作用，为临床研究提供了实验依据。

Claims (8)

1、一种褐藻胶寡糖的制备方法，其特征在于：用超声波对1-5％的褐藻胶溶液，在温度40-80℃、pH值为2-5下降解7-10小时后，降解液加入无水乙醇进行醇析，抽滤，烘干，研磨即得褐藻胶寡糖。

2、根据权利要求1所述的一种褐藻胶寡糖的制备方法，其特征在于：所述的超声波的频率为150Hz。

3、根据权利要求1或2所述的一种褐藻胶寡糖的制备方法，其特征在于：所述的褐藻胶溶液是由褐藻胶固体与2.5％的醋酸溶液配制而成。

4、根据权利要求1所述的一种褐藻胶寡糖的制备方法，其特征在于：用该方法制备的褐藻胶寡糖，用作细菌或真菌的抑菌剂。

5、根据权利要求4所述的一种褐藻胶寡糖的应用，其特征在于：所述的细菌可为藤黄微球菌或金黄色葡萄球菌或枯草芽孢杆菌或大肠杆菌。

6、根据权利要求4所述的一种褐藻胶寡糖的应用，其特征在于：所述的真菌为啤酒酵母。

7、根据权利要求5所述的一种褐藻胶寡糖的应用，其特征在于：所述的藤黄微球菌或金黄色葡萄球菌或大肠杆菌的最低抑菌浓度仅为0.2-0.7％，对枯草芽孢杆菌最低抑菌浓度为2.5-0.5％。

8、根据权利要求6所述的一种褐藻胶寡糖的应用，其特征在于：所述的啤酒酵母的最低抑菌浓度则为1-10％。