CN109456853A - 抑制克罗诺杆菌生物被膜的清洗剂及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及抑制克罗诺杆菌生物被膜的清洗剂及其制备方法与应用。所述清洗剂包括氨基寡糖或其衍生物或褐藻寡糖、阴离子表面活性剂、两性离子表面活性剂、非离子表面活性剂、甘油和水。本发明清洗剂对克罗诺杆菌生物被膜具有良好的抑制效果，尤其是在被膜形成前期能有效抑制菌体的粘附。相对于普通市售清洗剂，含氨基寡糖或其衍生物或褐藻寡糖、阴离子表面活性剂、两性离子表面活性剂、非离子表面活性剂的新型清洗剂对生物被膜的抑制效果显著提高。
Description
技术领域
本发明属于生物医学技术领域，尤其是涉及一种抑制克罗诺杆菌生物被膜的清洗剂及其制备方法与应用。
背景技术
克罗诺杆菌(Cronobacter spp.)是一种无芽孢、有周生鞭毛、能运动、兼性厌氧的革兰氏阴性杆菌。它能引起各个年龄段人群的感染，特别是早产儿、体重偏轻或身体状况较差的婴幼儿以及经常使用抗生素治疗、免疫功能低下、有医疗移植史的成人和老年人。婴儿感染克罗诺杆菌可引起致命性的坏死性结肠炎、败血症和脑膜炎，并带来严重的神经系统后遗症。成人感染克罗诺杆菌会出现如结膜炎、胆原性脓毒症、尿路败血症、肺炎等一系列症状。美国国立卫生研究所表示，人类细菌性感染约有80％是由生物被膜引起的。
生物被膜又称作生物膜。是一种由非游离细胞与其所分泌的胞外基质所组成的细菌菌落，通常粘附在固液相交界处，是微生物在自然界存在的一种重要方式。生物被膜中除了水和细菌外，还含有细菌分泌的胞外聚合物，如多糖、蛋白、核酸等。有研究表明，99％的细菌都能以生物被膜的形式存在。生物被膜能保护细菌抵御外界不良环境，增强其抗性。
克罗诺杆菌能够在各种材料表面粘附并形成生物被膜，如不锈钢、玻璃、聚丙烯和硅胶等常见的食品加工设备及餐具表面。克罗诺杆菌生物被膜对于常见的消毒剂如过氧乙酸和二氧化氯还有着较强的抗性，这使得附着在这些设备和餐具上的克罗诺杆菌生物被膜难以被清除并随着被膜的成熟释放出菌体而形成新的污染。Kim等人报道了克罗诺杆菌污染的肠管在人体内形成生物被膜，能抵御胃酸的冲击进而进入肠道，引发一系列的肠道疾病。Peng Fei等人研究了克罗诺杆菌对抗生素以及干燥、高渗环境的抗性。因此，对于广泛存在于生鲜农产品、食品加工环境中的克罗诺杆菌来说，抑制菌体的生长已远远不够，若残存的菌体能继续形成生物被膜污染，这又大大加剧了克罗诺杆菌污染防控的难度。虽然克罗诺杆菌生物被膜的危害性正逐渐得到重视，但目前对其抑制方法的研究依然较少，并且存在着种种的不足。如具有杀菌效果的消毒剂、防腐剂或植物提取物，这些物质不仅起效浓度高，用在食品相关的器具上，还对人体健康存在潜在威胁。CN20180208430公开的一种壳寡糖-抗生素偶联物及其制备方法和应用中，主要利用壳寡糖-氯霉素类抗生素，针对革兰氏阳性菌生物被膜进行抑制，但是抗生素的使用会造成细菌耐药性的频发，并且该药物组合物主要针对革兰式阳性细菌，对革兰式阴性细菌特别是克罗诺杆菌却并无报道，同时该组合物的制备方法复杂。
目前有关克罗诺杆菌生物被膜的有效抑制方法还未见专利报道。
发明内容
本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种抑制克罗诺杆菌生物被膜的清洗剂及其制备方法与应用。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
本发明提供第一种抑制克罗诺杆菌生物被膜的清洗剂，包括以下重量百分含量的组分：
第一种抑制克罗诺杆菌生物被膜的清洗剂，优选地包括以下重量百分含量的组分：
本发明提供第二种抑制克罗诺杆菌生物被膜的清洗剂，包括以下重量百分含量的组分：
第二种抑制克罗诺杆菌生物被膜的清洗剂，优选地包括以下重量百分含量的组分：
进一步地，所述阴离子表面活性剂为月桂酰肌氨酸钠。
进一步地，所述两性离子表面活性剂为椰油酰胺丙基甜菜碱。
进一步地，所述非离子表面活性剂为癸基葡糖苷。
进一步地，所述氨基寡糖或其衍生物选自以下物质中的一种或多种混合：
氨基葡萄糖、N-乙酰氨基葡萄糖、几丁类寡糖或分子量低于5kDa的低分子量壳聚糖；
进一步地，所述几丁类寡糖选自以下物质中的一种或多种混合：
壳二糖、壳三糖、壳四糖、壳五糖、壳六糖、壳七糖、壳八糖、壳九糖、壳十糖、壳十一糖、壳十二糖、壳十三糖、壳十四糖、壳十五糖、壳十六糖、壳十七糖、壳十八糖、壳十九糖、壳二十糖、几丁二糖、几丁三糖、几丁四糖、几丁五糖、几丁六糖、几丁七糖、几丁八糖、几丁九糖、几丁十糖、几丁十一糖、几丁十二糖、几丁十三糖、几丁十四糖、几丁十五糖、几丁十六糖、几丁十七糖、几丁十八糖、几丁十九糖、几丁二十糖。
本发明所述抑制克罗诺杆菌生物被膜的清洗剂的制备方法，包括以下步骤：
按重量百分含量配料：氨基寡糖或其衍生物0.1％-30％或褐藻寡糖2％-20％，阴离子表面活性剂钠2％-15％，两性离子表面活性剂2％-20％，非离子表面活性剂2％-15％，甘油2％-10％，水余量；
除水以外的组分在水中混合并加热搅拌至清亮。
本发明还提供所述抑制克罗诺杆菌生物被膜的清洗剂的应用，所述清洗剂直接使用或稀释使用。
本发明还提供所述抑制克罗诺杆菌生物被膜的清洗剂的应用，所述清洗剂使用方法分为直接清洗和浸泡清洗。
所述直接清洗方法可实现方式是：取适量清洗剂于浸湿的海绵、清洁布等上，揉起泡沫后使用，后用清水冲漂洗净即可。
所述的浸泡清洗方法可实现方式是：取适量清洗剂稀释，浸入待洗物品，浸泡一段时间，取出物品后用水冲净即可。
本发明还提供所述抑制克罗诺杆菌生物被膜的清洗剂的应用，所述清洗剂用于儿童用品或食品的清洗；
所述儿童用品包括但不限于奶瓶、奶嘴、儿童用餐具或玩具；
所述食品包括水果或蔬菜。
本发明抑制克罗诺杆菌生物被膜的高效清洗剂不仅制备简单，配方天然，环境友好，温和无刺激，并且高效安全，使用方便。这将有助于克罗诺杆菌生物被膜污染的防治。
与现有技术相比，本发明具有以下优点及有益效果：
(1)本发明清洗剂中氨基寡糖或其衍生物或褐藻寡糖可与克罗诺杆菌细胞膜上相关位点进行特异性结合，改变细胞膜的通透性并影响菌体之间的相互作用，干扰菌体的正常代谢。氨基寡糖或其衍生物或褐藻寡糖还可进入细胞，干扰遗传信息的复制、信号分子的表达，也能与细胞器及细胞质结合，影响其生长繁殖。本发明所述的清洗剂对克罗诺杆菌生物被膜的形成具有良好的抑制效果，尤其是在生物被膜形成前期，即菌体的粘附阶段具有较强的抑制作用，能减少被膜形成后带来的污染及危害。
(2)本发明清洗剂中月桂酰肌氨酸钠为阴离子表面活性剂，具有乳化、渗透、发泡、去污、抑菌等功效；椰油酰胺丙基甜菜碱为两性离子表面活性剂，具有去污、发泡、增稠等功效；癸基葡糖苷为非离子表面活性剂，具有去污、发泡、乳化、抑菌等功效；甘油可护肤保湿，水为溶剂。与氨基寡糖或其衍生物或褐藻寡糖相结合，辅料作用明显增强，且具有抑制克罗诺杆菌生物被膜形成的作用。
(3)本发明清洗剂绿色安全，环境友好，不含色素、香精、防腐剂等，避免化学物质的残留，更适合在儿童用品中的应用，减少婴幼儿或免疫力低下的成年人感染患病。
附图说明
图1不同清洗剂清洗后生物被膜的形成情况(A本发明清洗剂；B对照组1；C对照组2)。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。
实施例1：壳寡糖混合物制备
取脱乙酰度95％的壳聚糖用壳聚糖酶水解获得混合物，该混合物含壳二糖16.7％、壳三糖11.7％、壳四糖13.6％、壳五糖9.5％、壳六糖8.3％、壳七糖7.6％、壳八糖6.2％、壳九糖5.1％、壳十糖4.9％、壳十一糖3.1％、壳十二糖2.2％、壳十三糖1.3％、壳十四糖1.2％、壳十五糖1.6％、壳十六糖1.2％、壳十七糖1.3％、壳十八糖1.8％、壳十九糖1.5％、壳二十糖1.2％，以上百分含量均指质量分数。
实施例2：几丁寡糖混合物制备
取几丁质用几丁质酶水解获得混合物，该混合物含几丁二糖12.8％、几丁三糖16.7％、几丁四糖8.6％、几丁五糖7.6％、几丁六糖10.3％、几丁七糖6.2％、几丁八糖7.9％、几丁九糖8.1％、几丁十糖3.3％、几丁十一糖1.8％、几丁十二糖2.3％、几丁十三糖2.8％、几丁十四糖2.5％、几丁十五糖2.1％、几丁十六糖1.9％、几丁十七糖1.2％、几丁十八糖1.3％、几丁十九糖1.5％、几丁二十糖1.1％，以上百分含量均指质量分数。
实施例3：不同清洗剂清洗后生物被膜形成情况
(1)在本实施例中，对本发明所述清洗剂及普通清洗剂对生物被膜表观形态的影响进行了比较。具体实施如下：壳寡糖混合物15份，月桂酰肌氨酸钠7份，椰油酰胺丙基甜菜碱8份，癸基葡糖苷6份，甘油4份，水60份，加热温度为35℃，搅拌混合至清亮。同时设置对照组1：普通市售奶瓶餐具清洗剂(国产产品，成分为：甘油4％、椰油酰胺丙基甜菜碱8％、癸基葡糖苷6％、芦荟提取物3％、其余为水；对照组2：普通市售奶瓶餐具清洗剂(进口产品，成分：甘油4％、椰油酰胺丙基甜菜碱8％、月桂酰肌氨酸钠7％、甲基异噻唑啉酮2％、其余为水)。将5mL清洗剂加入1L自来水中，在24孔细胞板中加入玻璃片，以浸泡清洗的方式清洗玻璃片，最后用清水冲净，除去多余水分，留下玻璃片。
(2)在本实施例中，所选用的克罗诺杆菌来自德国微生物保藏中心(DSM 18702)。将其接种于TSB培养基，37℃，200rpm过夜培养。调整菌液OD600为0.1±0.01，此时菌液浓度约为108CFU/mL，称为标准菌悬液。4℃，8000rpm离心10分钟，弃去上清液，加入等量新鲜TSB，震荡混匀。在24孔板中加入200μL标准菌悬液和800μL TSB培养基，37℃培养24小时取出玻璃片，用无菌PBS冲洗3次。加入2.5％戊二醛溶液于4℃固定24小时。将玻璃片取出，无菌水冲洗3次，后依次用25％、50％、70％、80％、90％的乙醇脱水干燥，每次15分钟，最后用100％乙醇处理3次，每次15分钟。玻璃片干燥后，将其放在真空镀膜机内，进行镀金。最后在扫描电镜10000×条件下观察。
参见图1，两种普通市售清洗剂清洗玻璃片后，菌体依然会大量粘附，分泌胞外多聚物形成生物被膜。但经过本发明所述清洗剂清洗后，玻片表面不仅菌体数量减少，其分泌的胞外多聚物含量也明显降低，生物被膜的厚度减小。本发明所述清洗剂能通过抑制细菌的粘附，减少胞外多糖的产生，从而达到抑制生物被膜的形成。
实施例4：不同清洗剂处理对生物被膜的抑制效果
(1)在本实施例中，本发明所述高效清洗剂抑制克罗诺杆菌生物被膜形成的效果进行了研究。具体实施如下：
氨基葡萄糖15重量份，月桂酰肌氨酸钠7重量份，椰油酰胺丙基甜菜碱8重量份，癸基葡糖苷6重量份，甘油4重量份，水60重量份，加热温度为35℃，搅拌混合至清亮，标记为本发明清洗剂a；
壳寡糖组合物15重量份，月桂酰肌氨酸钠7重量份，椰油酰胺丙基甜菜碱8重量份，癸基葡糖苷6重量份，甘油4重量份，水60重量份，加热温度为35℃，搅拌混合至清亮，标记为本发明清洗剂b；
N-乙酰氨基葡萄糖15重量份，月桂酰肌氨酸钠7重量份，椰油酰胺丙基甜菜碱8重量份，癸基葡糖苷6重量份，甘油4重量份，水60重量份，加热温度为35℃，搅拌混合至清亮，标记为本发明清洗剂c；
几丁寡糖混合物15重量份，月桂酰肌氨酸钠7重量份，椰油酰胺丙基甜菜碱8重量份，癸基葡糖苷6重量份，甘油4重量份，水60重量份，加热温度为35℃，搅拌混合至清亮，标记为本发明清洗剂d；
低分子量壳聚糖15重量份，月桂酰肌氨酸钠7重量份，椰油酰胺丙基甜菜碱8重量份，癸基葡糖苷6重量份，甘油4重量份，水60重量份，加热温度为35℃，搅拌混合至清亮，标记为本发明清洗剂e；
褐藻寡糖8重量份，月桂酰肌氨酸钠7重量份，椰油酰胺丙基甜菜碱8重量份，癸基葡糖苷6重量份，甘油4重量份，水67重量份，加热温度为35℃，搅拌混合至清亮，标记为本发明清洗剂f；
同时设置对照组1：普通市售奶瓶餐具清洗剂(国产产品)；
对照组2：普通市售奶瓶餐具清洗剂(进口产品)；
以及空白对照：自来水。
清洗方式为直接清洗：取黄豆大小清洗剂于浸湿的清洁布上，揉起泡沫后使用，后用清水冲漂洗净。分别用不同清洗剂处理玻璃试管。
(2)在本实施例中，所选用的克罗诺杆菌来自德国微生物保藏中心(DSM 18702)。。将其接种于TSB培养基，37℃，200rpm过夜培养。调整菌液OD600为0.1±0.01，此时菌液浓度约为108CFU/mL，称为标准菌悬液。4℃，8000rpm离心10分钟，弃去上清液，加入等量新鲜TSB，震荡混匀。在经不同清洗方式处理过的试管中加入1mL标准菌悬液和4mL新鲜TSB培养基，并设置空白对照。于37℃静置培养24小时，将试管中的菌液吸出，用无菌PBS冲洗3次，室温下干燥20分钟；加入5mL 0.1％结晶紫溶液染色30分钟；用无菌水冲洗试管3次；加入5mL95％乙醇室温下放置10分钟；测定OD600，计算抑制率[(OD空白对照-OD实验)/OD空白对照×100％]。
参见表1，当使用直接清洗方式处理样品时，两种普通市售清洗剂对克罗诺杆菌生物被膜的抑制率均低于20％，而本发明所述抑制剂对克罗诺杆菌生物被膜的抑制率均高于70％，最高可达85.8％。因此，本发明所述的清洗剂在直接清洗时对抑制克罗诺杆菌生物被膜的形成更加高效。
表1直接清洗对克罗诺杆菌生物被膜的抑制率
实施例5：不同清洗剂处理对生物被膜的抑制效果
(1)在本实施例中，本发明所述高效清洗剂的抑制克罗诺杆菌生物被膜形成的效果进行了研究。具体实施如下：
氨基葡萄糖15重量份，月桂酰肌氨酸钠7重量份，椰油酰胺丙基甜菜碱8重量份，癸基葡糖苷6重量份，甘油4重量份，水60重量份，加热温度为35℃，搅拌混合至清亮，标记为本发明清洗剂a；
壳寡糖混合物15重量份，月桂酰肌氨酸钠7重量份，椰油酰胺丙基甜菜碱8重量份，癸基葡糖苷6重量份，甘油4重量份，水60重量份，加热温度为35℃，搅拌混合至清亮，标记为本发明清洗剂b；
N-乙酰氨基葡萄糖15重量份，月桂酰肌氨酸钠7重量份，椰油酰胺丙基甜菜碱8重量份，癸基葡糖苷6重量份，甘油4重量份，水60重量份，加热温度为35℃，搅拌混合至清亮，标记为本发明清洗剂c；
几丁寡糖混合物15重量份，月桂酰肌氨酸钠7重量份，椰油酰胺丙基甜菜碱8重量份，癸基葡糖苷6重量份，甘油4重量份，水60重量份，加热温度为35℃，搅拌混合至清亮，标记为本发明清洗剂d；
低分子量壳聚糖15重量份，月桂酰肌氨酸钠7重量份，椰油酰胺丙基甜菜碱8重量份，癸基葡糖苷6重量份，甘油4重量份，水60重量份，加热温度为35℃，搅拌混合至清亮，标记为本发明清洗剂e；
褐藻寡糖8重量份，月桂酰肌氨酸钠7重量份，椰油酰胺丙基甜菜碱8重量份，癸基葡糖苷6重量份，甘油4重量份，水67重量份，加热温度为35℃，搅拌混合至清亮，标记为本发明清洗剂f；
同时设置对照组1：普通市售奶瓶餐具清洗剂(国产产品)；对照组2：普通市售奶瓶餐具清洗剂(进口产品)；以及空白对照：自来水。
清洗方式为浸泡清洗：1L水中加入清洗剂约5mL，浸入待洗物品，浸泡10分钟，取出物品用水冲洗2-3次洗净即可。分别用不同清洗剂处理玻璃试管。
(2)在本实施例中，所选用的克罗诺杆菌来自德国微生物保藏中心(DSM 18702)。将其接种于TSB培养基，37℃，200rpm过夜培养。调整菌液OD600为0.1±0.01，此时菌液浓度约为108CFU/mL，称为标准菌悬液。4℃，8000rpm离心10分钟，弃去上清液，加入等量新鲜TSB，震荡混匀。在经不同清洗方式处理过的试管中加入1mL标准菌悬液和4mL新鲜TSB培养基，并设置空白对照。于37℃静置培养24小时，将试管中的菌液吸出，用无菌PBS冲洗3次，室温下干燥20分钟；加入5mL 0.1％结晶紫溶液染色30分钟；用无菌水冲洗试管3次；加入5mL95％乙醇室温下放置10分钟；测定OD600，计算抑制率[(OD空白对照-OD实验)/OD空白对照×100％]。
参见表2，当使用浸泡清洗方式处理样品时，两种普通市售清洗剂对克罗诺杆菌生物被膜的抑制率均低于30％，而本发明所述抑制剂对克罗诺杆菌生物被膜的抑制率均高于90％，最高可达97.3％。因此，本发明所述的清洗剂在浸泡清洗时对抑制克罗诺杆菌生物被膜的形成更加高效。
表2浸泡清洗对克罗诺杆菌生物被膜的抑制率
上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种抑制克罗诺杆菌生物被膜的清洗剂，其特征在于，包括以下重量百分含量的组分：
2.根据权利要求1所述的一种抑制克罗诺杆菌生物被膜的清洗剂，其特征在于，包括以下重量百分含量的组分：
3.一种抑制克罗诺杆菌生物被膜的清洗剂，其特征在于，包括以下重量百分含量的组分：
4.根据权利要求3所述的一种抑制克罗诺杆菌生物被膜的清洗剂，其特征在于，包括以下重量百分含量的组分：
5.根据权利要求1或2或3或4所述的一种抑制克罗诺杆菌生物被膜的清洗剂，其特征在于，所述阴离子表面活性剂为月桂酰肌氨酸钠，所述两性离子表面活性剂为椰油酰胺丙基甜菜碱，所述非离子表面活性剂为癸基葡糖苷。
6.根据权利要求1或1或2所述的一种抑制克罗诺杆菌生物被膜的清洗剂，其特征在于，所述氨基寡糖或其衍生物选自以下物质中的一种或多种混合：
氨基葡萄糖、N-乙酰氨基葡萄糖、几丁类寡糖或分子量低于5kDa的低分子量壳聚糖；
所述几丁类寡糖选自以下物质中的一种或多种混合：
壳二糖、壳三糖、壳四糖、壳五糖、壳六糖、壳七糖、壳八糖、壳九糖、壳十糖、壳十一糖、壳十二糖、壳十三糖、壳十四糖、壳十五糖、壳十六糖、壳十七糖、壳十八糖、壳十九糖、壳二十糖、几丁二糖、几丁三糖、几丁四糖、几丁五糖、几丁六糖、几丁七糖、几丁八糖、几丁九糖、几丁十糖、几丁十一糖、几丁十二糖、几丁十三糖、几丁十四糖、几丁十五糖、几丁十六糖、几丁十七糖、几丁十八糖、几丁十九糖、几丁二十糖。
7.权利要求1或3所述抑制克罗诺杆菌生物被膜的清洗剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
按重量百分含量配料：氨基寡糖或其衍生物0.1％-30％或褐藻寡糖2％-20％，阴离子表面活性剂钠2％-15％，两性离子表面活性剂2％-20％，非离子表面活性剂2％-15％，甘油2％-10％，水余量；
除水以外的组分在水中混合并加热搅拌至清亮。
8.权利要求1或3所述抑制克罗诺杆菌生物被膜的清洗剂的应用，其特征在于，所述清洗剂直接使用或稀释使用。
9.权利要求1或3所述抑制克罗诺杆菌生物被膜的清洗剂的应用，其特征在于，所述清洗剂使用方法分为直接清洗和浸泡清洗。
10.权利要求1或3所述抑制克罗诺杆菌生物被膜的清洗剂的应用，其特征在于，所述清洗剂用于儿童用品或食品的清洗；
所述儿童用品包括但不限于奶瓶、奶嘴、儿童用餐具或玩具；
所述食品包括水果或蔬菜。
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