KR102196205B1

KR102196205B1 - 무독화 lps 및 lta를 조합으로 포함하는 생물막 형성 방지 또는 저해용 조성물

Info

Publication number: KR102196205B1
Application number: KR1020180145153A
Authority: KR
Inventors: 이규호; 곽효선; 정유철; 이경조; 김정아; 장보람; 강세빈
Original assignee: 서강대학교산학협력단; 대한민국 (식품의약품안전처장)
Priority date: 2018-11-22
Filing date: 2018-11-22
Publication date: 2020-12-29
Also published as: KR20200059871A; US11882837B2; US20200163341A1

Abstract

본원은 신규한 박테로이데스 벌가투스 MGM001 (Bacteroides vulgatus MGM001) 균주 및 그 용도를 개시한다. 본원에 따른 균주는 LPS의 세포독성이 기존의 균주와 비교하여 약하며, LTA와 조합으로 사용시 생물막 억제에 대한 상승효과를 가진다.

Description

무독화 LPS 및 LTA를 조합으로 포함하는 생물막 형성 방지 또는 저해용 조성물{Composition comprising detoxified Lipopolysaccharide and Lipoteichoic acid for preventing or inhibiting formation of biofilm}

본원은 생물막 형성 방지 또는 저해용 조성물에 관한 것이다.

병원성 세균의 80% 이상은 생물막을 형성하여 인체조직, 치아, 의료 인공삽입물 등에 부착하여 집락을 이뤄 존재한다. 이로 인해 생물막은 만성 감염 질환과 연관되어 있다고 알려져 있으며 생물막이 형성되면 심내막염, 축농증, 치주염, 편도선염, 폐렴 등과 같이 다양하고 심각한 질병들이 유발된다. 생물막을 형성한 세균은 생물막을 형성하지 않은 세균에 비해 1,000배 이상의 항생제 내성을 가지는데, 상기 세균 생물막 형성은 항생제 내성균주 증가와도 깊은 관련이 있다.

따라서 병원성 세균의 생물막 형성을 근본적으로 해결할 수 있는 방안이 필요하다. Vibrio vulnificus에서 추출한 LPS (Lipopolysaccharide) 및 Staphylococcus aureus에서 추출한 LTA (Lipoteichoic acid)가 각각 그람음성균 및 그람양성균들의 생물막 형성을 저해함이 알려져 있으나(Lee KJ, et al. (2016) Biofouling. 32:711-723), V. vulnificus에서 추출한 LPS 및 S. aureus에서 추출한 LTA의 경우 각각 인체에 심각한 식중독을 일으키는 원인균주로부터 추출했다는 점에서 실생활에 이용되기 어려운 문제점이 있다. 아울러 다른 균주들로부터 유래한 LPS 및 LTA 또는 그로부터 유래한 dLPS 및 dLTA에 의한 항생물막효과는 아직까지 알려지지 않았다.

따라서 인체에 유익한 장내미생물들로부터 LPS 및 LTA 추출 및 무독화한 dLPS 및 dLTA를 이용하여 항생물막 능력을 검증하고, 이들을 동시 사용하여 단독으로 사용되는 경우보다 더 강력한 생물막 저해제를 개발하는 필요하다. 특히 상품화된 dLPS의 경우 그 가격이 5 mg 당 80만원을 넘는 비싼 물질이며 dLTA의 경우 상품화된 제품이 없고 LTA의 가격이 5 mg당 20만원이 넘는 물질이므로 무한정 제공될 수 없다는 점에서 생물막 저해에 필요한 최소 농도가 필요하다.

대한민국 공개특허 제2014-0082206호

본원은 생물막 형성을 저해할 수 있는 물질을 제공하고자 한다.

한 양태에서 본원은 생물자원센터에 기탁번호 KCTC13624BP로 기탁된 박테로이데스 벌가투스 MGM001 (Bacteroides vulgatus MGM001) 균주를 제공한다.

다른 양태에서 본원은 상기 균주 유래의 dLPS (deacylated Lipopolysaccharide) 및 dLTA (deacylated Lipoteichoic acid)를 조합으로 포함하는 생물막 형성 억제 또는 방지용 조성물을 제공한다.

본원에 따른 조성물에 사용되는 상기 dLTA는 일 구현예에서 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum)을 포함하는 장내 유산균 유래이다.

일 구현예에서 본원에 따른 조성물에 포함되는 dLPS 및 dLTA는 약 13.9:1 농도비(㎍/ml)로 포함된다.

다른 구현예에서 본원에 따른 조성물이 효과가 있는 생물막은 그람음성 또는 그람양성 박테리아에 의해 생성된 것으로, 특히 상기 그람음성 박테리아는 Vibrio vulnificus, 또는 Pseudomonas aeruginosa 이고, 상기 그람양성 박테리아는 Staphylococcus aureus, 또는 Listeria monocytogenes 이다.

다른 양태에서 본원은 본원에 따른 어느 하나의 조성물을 인비크로에서 그람양성 또는 그람음성 박테리아와 접촉하는 단계를 포함하는, 인비트로에서 생물막 형성의 방지 또는 저해 방법을 제공한다.

본원에 따른 방법의 일 구현예에서, 박테리아와의 접촉은 상기 조성물을 표면에 처리하는 것을 포함하며, 상기 표면은 글레이즈세라믹, 포설린, 유리, 금속, 나무, 크롬, 플라스틱, 비닐 및 포미카로 구성되는 군으로부터 선택되며, 아크릴 표면은 제외하는 것이다.

본원에 따른 조성물은 인체에 유익한 장내미생물들로부터 LPS 및 LTA 추출 및 무독화한 dLPS 및 dLTA를 포함하는 것으로, 이들을 조합으로 사용하는 경우, 생물막 형성 방지 또는 저해효과가 상승된다. 무독화된 LPS 및 LTA의 우수한 효과로 인해 항생제의 사용을 줄일 수 있어 항생제의 오남용을 감소시키고, 내성균의 출현을 최소화할 수 있다.

도 1a 내지 도 1d는 본원에서 분리된 Bacteroides vulgatus MGM001 균주의 16s RNA를 분석한 결과로 본원에서 분리된 균주는 신규한 것임을 나타낸다. 도 1에 기재된 균주는 다음과 같다: Bacteroides vulgatus strain mpk (Mouse fecal isolate); Bacteroides vulgatus strain JCM 5826 (Human fecal isolate); Bacteroides vulgatus strain BCRC 12903 (Human fecal isolate); 및 Bacteroides vulgatus strain ATCC 8482 (Human fecal isolate).
도 2는 본원에서 분리된 신규한 균주에서 분리된 LPS 및 dLPS의 세포독성을 Vibrio vulnificus MO6-24/O (Vv)와 비교 테스트한 결과로, 본원에서 분리된 균주의 LPS의 세포독성이 V. vulnificus와 비교하여 1/2정도로 줄어든 것을 나타낸다. 또한 독성을 없애기 위해 무독화하였기 때문에 향후 생물막 저해제로서 이용되는 데 인체 독성이 없다는 점에서 그 이용가치가 높음을 나타낸다.
도 3은 본원에 추출한 LPS와 LTA의 탈아실화 여부를 확인한 실험결과이다.
도 4는 LPS/LTA와 탈아실 LPS/LTA의 세포독성능을 확인한 결과이다.

본원은 본원에서 분리된 신규한 균주 및 이로부터 유래한 LPS 및 LTA 조합의항생물막 능력을 검증하고, 이들을 동시 사용하여 단독으로 사용되는 경우보다 더 강력한 상승된 생물막 형성 저해 효과를 갖는 다는 발견에 근거한 것이다.

이에 한 양태에서 본원은 2018년 8월 16일 생물자원센터(Korean Collection for Culture Type)에 기탁번호 KCTC13624BP로 기탁된 박테로이데스 벌가투스 MGM001 (Bacteroides vulgatus MGM001) 균주에 관한 것이다.

본원에 따른 균주는 그 16s RNA를 분석한 결과 신규한 균주로서 (도 1 등 참조), LPS의 패턴이 기존의 균주와 상당히 다르며, 특히 LPS를 이루고 있는 O-antigen의 형태가 상이한 것으로 나타났다, 나아가 본원에 따른 균주에서 추출된 LPS는 기존 균주 특히 Vibrio vulnificus 유래의 LPS와 비교하여 그 독성이 1/2정도로 감소한 것으로 나타났다. 이러한 특징은 특히 생물막 형성의 저해제로 사용시 매우 유리하다.

특히 본원에 따른 균주 유래의 LPS는 특히 LTA와의 조합으로 사용시 우수한 생물막 형성 방지 또는 저해 효과를 나타낸다. 본원에 따른 이러한 방지 또는 저해 효과는 그람 양성 및 그람음성 세균에 의해 형성된 생물막에 작용할 수 있다.

본원의 상기 '생물막' 또는 “바이오필름”은 미생물이 분비한 세포외 다량체 기질(Extracellular Polymeric Matrix)과 증식한 박테리아로 구성된 입체적 구조물을 말한다. 대부분의 박테리아가 표면에 밀착하여 증식할 수 있는데, 이런 경우 단일막을 형성하거나, 응집체를 형성하거나 또는 상기의 생물막을 형성한다. 상기 생물막을 생체조직을 포함하는 거의 모든 종류의 교체 표면에 형성될 수 있다.

이러한 생물막은 주위에서 흔히 접할 수 있는 생체, 의학 및 산업 환경에서 흔히 발견된다. 생체에서 서식할 수 있는 병원성 박테리아의 경우 숙주의 상피세포, 뼈, 치아, 및 혈관내벽 등을 포함하는 각종 조직/기관 및 각종 인공 삽입 보형물(catheter, implant), 각종 의학기구/장비/설비 등에 생물막을 형성할 수 있다. 생물막이 형성되면 박테리아는 가혹한 환경에서도 잘 견디는 것은 물론, 항생제 및 면역세포에 대하여 강한 저항력을 가지기 때문에 제거가 매우 어려우며, 만성 염증 질환의 원인이 되기도 하며, 물체의 경우 부식(microbiologically induced corrosion)을 유발한다. 최근 보고에 의하면, 전체 감염성 질환의 65% 정도가 생물막 형성이 주요인으로 알려져 있다(Ymele-Leki and Ross, 2007, Applied and Environmental Microbiology 73(6):1834-41). 따라서 박테리아에 의한 부식 방지 또는 병원성 박테리아에 의한 감염의 방지/치료 또는 질환의 예방/치료에 있어, 생물막 형성의 제어는 매우 중요하다.

일 구현예에서 상기 생물막은 그람양성균에서 형성된 것으로 상기 그람양성균은 이로 제한하는 것은 아니나, 예를 들면 스타필로코커스 아우레우스, 스트렙토코커스 뮤탄스, 스트렙토코커스 뉴모니아(Streptococcus pneumonia), 스타필로코커스 에피더미디스, 엔테로코커스 파에칼리스, 또는 스트렙토코커스 고도니(Streptococcus gordonii)이다. 본원의 일 구현예에서 상기 생물막은 스타필로코커스 아우레우스, 엔테로코커스 파에칼리스, 또는 스트렙토코커스 고도니이다.

다른 구현예에서 상기 생물막은 그람음성균에서 형성된 것으로, 상기 그람음성균은 이로 제한하는 것은 아니나, 예를 들면 생물막을 형성하는 Vibrio vulnificus, Vibrio cholera, Vibrio parahaemolyticus, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumonia, Salmonella enterica, Shigella flexneri, Bacteroides vulgatus을 포함한다.

이에 다른 양태에서 본원은 본원에 따른 균주 유래의 무독화된 LPS인 dLPS (deacylated Lipopolysaccharide), 및 무독화된 LTA인 dLTA (deacylated Lipoteichoic acid)를 조합으로 포함하는 생물막 형성 억제, 저해 또는 방지용 조성물에 관한 것이다.

본원의 상기 ‘리포테이코산’은 그람양성균의 세포벽의 주요 구성요소로, 세포벽에 리피톨인산으로 구성된 테이코산, 세포막에는 글리세롤인산의 중합체인 세포막테이코산을 갖는 것을 말한다. LTA의 구조는 구체적 그람양성균의 종에 따라 다르다. 일 구현예에서 리포테이코산은 락토바실러스 속, 특히 Lactobacillus plantarum 유래이다. 본원에 사용하는 락토바실러스 플란타륨 리포테이코산의 구조는 핵자기공명(NMR)기법과 MALDI-TOF 질량 분석 기법을 통해 규명될 수 있으며, 락토바실러스 플란타륨 리포테이코산는 3개의 아실체인을 가진 당지질을 함유하고 있으며 포화지방산과 불포화지방산 모두 함유하고 있고, 당지질의 당은 글루코스와 갈락코스로 구성되어 있다.

본원에 따른 조성물에 포함되는 상기 dLPS 및 dLTA는 13.9:1 농도비(㎍/ml)로 포함할 수 있다.

본원의 생물막 형성의 방지 또는 저해제는 박테리아에 의한 생물막 형성의 제어가 필요한 곳이면, 가정, 환경, 의료 및 산업 분야에 걸쳐 폭넓게 사용될 수 있다. 한 구현예에서는 예를 들면, 각종 의학기구, 의학장비, 의학시설/설비와 같은 물건은 물론 각종 생체 조직/기관과 같은 생체조직 및 생체에 적용되는 각종 인공 삽입 보형물에 사용될 수 있다.

본원의 생물막 형성 방지 또는 저해제는 가정, 산업, 의학, 및 환경분야에서의 구체적인 목적에 맞추어 다양한 형태로 제조될 수 있다. 예를 들면 생체는 물론, 각종 장비, 기구의 세척을 위해, 표적으로 하는 박테리아에 의한 생물막 형성의 저해 및/또는 방지에 유효한 양의 상기 저해제를 포함하는 액체형태, 분무형태 또는 고체형태로 제조될 수 있으며, 목적에 따라 추가의 성분 예를 들면 이로 제한하는 것은 아니나, 계면활성제, 세정제, 제균제, 살균제, 항생제, 곰팡이제거제, 산도조절제, 염료, 색소와 같은 것을 포함할 수 있다.

한 구현예에서 본원의 생물막 형성 방지 또는 저해제를 포함하는 조성물은 파우더, 코팅제, 스프레이, 분배형타입, 액체에 투입할 수 있는 캡슐/타블릿형태 등으로 제조될 수 있다. 이들 조성물은 음이온성, 비이온성, 양쪽 이온성 및 생물학적 계면활성제 및 이들의 혼합물과 같은 계면활성제를 추가로 포함할 수 있다.

한 구현예에서는 개인위생용품, 예를 들면, 컨택렌즈 소독약, 비누, 샤워젤, 샴푸, 또는 치아, 인공치아 또는 구강의 세정, 세척을 위한 치실, 치약, 치분 또는 가글링 세정제의 형태로 제조될 수 있다.

다른 구현예에서 의학용 장비/기구/설비의 세정, 세척을 위한 파우더, 코팅제, 스프레이, 물수건(wipe) 형태로 제조될 수 있다.

다른 구현예에서, 본원의 생물막 형성 방지 또는 저해제는 선박, 종이 금속제조, 정유, 식품가공, 수(water)처리 장치와 같은 산업환경에서 사용될 수 있으며, 첨가제, 액체, 페인트, 코팅제의 형태로 제조될 수 있다. 첨가제로 제조될 경우, 수관, 쿨링타워, 윤활제, 열교환기에 사용될 수 있다.

또 다른 양태에서 본원은 상기 생물막 형성의 방지 또는 저해제를 이용한 박테리아에 의한 생물막 형성 방지 또는 저해 방법에 관한 것이다. 본원의 저해제를 박테리아와 접촉시키거나(박테리아를 저해 또는 방지제에 노출시키거나) 또는 박테리아가 증식할 수 있는 또는 증식하고 있는 표면에 처리하여, 박테리아의 응집을 예방함으로써 생물막 형성을 예방하거나, 또는 저해할 수 있다. 상기 박테리아와의 접촉은 물건의 표면을 본원의 방지 또는 저해제로 처리하는 것을 포함한다. 본원의 생물막 형성 방지 또는 저해제는 상기 언급한 바와 같이 목적하는 생물막 형성의 저해에 유효한 양으로 처리될 수 있다. 상기 표면은 내부 및 외부의 표면을 모두 칭하는 것이며, 단단하거나(고상), 유연한 것을 모두 포함하는 것으로, 생체유래의 것은 물론, 가정, 산업, 환경, 의료 분야에서 사용되는 물건을 포함하는 것이다. 단단한 표면은 이로 제한하는 것은 아니나, 예를 들면 배수관, 글레이즈세라믹, 포설린, 유리, 금속, 나무, 크롬, 플라스틱, 비닐 및 포미카를 들 수 있다. 또한 고상 표면은 피부, 치아와 같은 생물체 유래 조직 또는 기관일 수 있다. 또한 상기 고상 표면은 의료용 물건 유래일 수 있다. 의료용 물건은 각종 의료용 설비, 장비, 기구, 임시 또는 영구용 인공삽입 보형물 예를 들면 렌즈, 인공판막, 페이스메이커, 수술용 핀, 삽입도관, 카테터 등을 일컫는 것이나, 이로 한정하는 것은 아니다.

본원의 조성물은 생물막 형성의 방지 또는 저해에 효과적인 양으로 사용될 수 있다. 효과적인 양은 생물막을 형성하는 박테리아의 종류, 처리하는 표면의 종류 및 그 면적, 및 목적하는 생물막 형성의 감소 정도, 처리 시점 등을 포함하는 조건에 맞추어 결정될 수 있으며, 당업자라면 본원의 기재 및 표적 박테리아의 생물막 형성에 관한 지식을 근거로 적절한 농도를 선택할 수 있을 것이다. 예를 들면 실시예에 기재된 생물막 형성 측정 방법으로 측정 시 처리 전과 비교하여 목적에 따라, 생물막 형성이 약 100%, 약 95% 이상, 약 90% 이상, 약 85% 이상, 약 80% 이상, 약 75% 이상, 약 70% 이상, 약 65% 이상, 약 50% 이상, 약 45% 이상, 약 40% 이상, 약 35% 이상, 약 30% 이상, 약 25% 이상, 약 20% 이상의 감소에 필요한 양을 일컫는 것일 수 있으나, 이로 제한하는 것은 아니다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위해서 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐 본 발명이 하기의 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예

실시예 1: Bacteroides vulgatus MGM001 균주의 분리 및 특징 규명

박테로이데스 벌가투스 MGM001은 실험동물인 ICR mouse의 분변으로부터 분리하였다. 본원에 따른 상기 균주는 생물자원센터(Korean Collection for Type Culture)에 2018년 8월 16일자로 KCTC13624BP로 기탁되었다.

균주 분리방법은 ICR mouse의 분변 sample을 PBS 버퍼에 풀어준 후 Bacteroides 속 균주 분리용 배지인 Bacteroides Bile Esculin (BBE, Becton, Dickinson and Company, Product #221836) 배지에 spreading 평판도말하여 자라난 single colony들을 streaking 평판도말하여 순수배양하였다. 얻어진 순수배양체들은 16S rRNA sequencing 하여 그 중 Bacteroides vulgatus로 확인된 순수배양체를 선별하였다.

B. vulgatus MGM001로부터 LPS를 추출하고 무독화 하는 과정은 실시예 2에 기재된 바와 같다. 이를 이용하여 세포독성은 실시예 3의 방법과 같이 분석하였다.

LPS 패턴분석은 SDS-PAGE gel 상의 band들을 molecular weight marker와 비교하여 band별로 size 분석을 할 수 있으며, 각 균으로부터 얻어진 LPS band의 개수 및 가장 아래에 보이는 첫 번째 band의 크기를 비교하면 균주간의 LPS가 상이함을 알 수 있다. 가장 아래쪽에 보이는 band를 Lipd A + core oligosaccharide + 1개의 O-antigen으로 볼 수 있으며 바로 위의 band 부터는 O-antigen의 개수가 하나씩 늘어나는 것으로 판단한다. MGM001의 가장 아래쪽의 밴드의 크기가 약 10~16 kDa의 범위 안에 있으며 band의 개수는 6개 정도임이 관찰되는 반면, 다른 B. vulgatus 균주들의 경우 가장 아래 밴드의 크기가 MGM001과 다르며(ATCC8482는 23 kDa 보다 약간 아래, CL10 T00C06은 3~6 kDa 사이) 밴드의 개수도 다르다(ATCC8482는 18개 이상, CL10 T00C06은 17개). 따라서 밴드의 패턴으로부터 MGM001의 LPS는 다른 B. vulgatus 균주들과 다른 LPS임을 알 수 있다.

B. vulgatus MGM001의 16s RNA를 분리하여 기존에 보고된 균주들과 서열을 비교한 결과 도 1a 내지 도 1d에 기재된 것과 같이 서열이 상이한 새로운 균주임을 확인하였다. 또한 도 2에 나타난 바와 같이 세포독성이 기존의 V. vulnificus와 비교하여 1/2 정도로 약한 것으로 나타났다. 나아가 본원에서 추출된 LPS의 패턴이 기존의 균주와 상이하며, 특히 LPS를 이루고 있는 O-antigen의 형태가 상이하며 이는 본원에 따른 생물막 형성 저해 본원에 유래된 MGM001 균주에 특이적인 것임을 나타내나, 이로 한정하는 것은 아니다.

실시예 2: LPS와 LTA 추출 및 무독화

LPS와 LTA는 각각 본원에서 분리된 Bacteroides vulgatus (MGM001.)와 Lactobacillus plantarum (KTCC1048)에서 다음과 같이 추출하였다.

실시예 2-1: LPS 추출 및 무독화

Bacteroides vulgatus (MGM001)를 RCM 배지에 48시간 동안 37℃ 온도로 혐기배양 후 원심분리하여 세포를 수득함. 얻어진 세포를 PBS (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na₂HPO₄, and 2 mM KH₂PO₄, pH 7.4) 완충액에 풀어서 30℃ 배양기에서 200 rpm으로 흔들며 배양해 준 후 다시 원심분리하여 세포만 얻었다. 이어 세포를 다시 TAE 완충액 (40 mM Tris-acetate, 2 mM EDTA, pH 8.5)에 풀어주고 알칼리 용액 (3% SDS, 50 mM Trizma base, 0.128 N NaOH)을 1:1로 섞어 세포를 완전히 용해시킴. 용해액에 10 mM MgCl₂를 넣고 8시간 동안 DNase I (50 mg/ml)과 RNase A (50 mg/ml) 처리해 주었다. 이후 18시간 동안 프로티나아제 K (200 mg/ml) 처리한 후 페놀-클로로포름 추출법 및 에탄올 침전법으로 LPS를 추출하였다(Hitchcock PJ, Brown TM. (1983). J Bacteriol. 154:269-277). 상기 추출한 LPS를 0.2 M NaOH에 녹여 100℃ 온도로 한 시간 동안 가열한 후 에탄올 침전법으로 dLPS를 수득하였다(Fomsgaard A, Freudenberg MA and Galanos C. (1990. J Clin Microbiol. 28:2627-2631).

실시예 2-2: LTA 추출 및 무독화

Lactobacillus plantarum (KTCC1048)을 MRS 배지에 48시간 동안 37℃ 온도로 혐기배양 후, 원심분리를 통하여 세포를 수득하였다. 수득한 세포를 0.1 mM 소디움 시트레이트 완충액(pH 4.7)로 풀어준 후, n-부탄올을 풀어준 세포에 1:1 (v/v)으로 넣어주고 30분간 상온에서 교반하였다. 그 후, 4℃ 6000rpm 30분 원심분리하여 아래 층의 수(aqueous) 상을 수득하였다. 여기에 얻은 샘플에 10 mM MgCl₂를 넣고 8시간 동안 DNase I (50 mg/ml)과 RNase A (50 mg/ml) 처리하였다. 이후 18시간 동안 프로티나제 K (200 mg/ml)를 처리한 후 페놀-클로로포름 추출법 및 에탄올 침전법으로 LTA를 추출하였다. 추출한 LTA에 0.2 M의 NaOH를 처리하여 60분간 상온에서 반응시킨 후, 0.2 M의 HCl로 중화시켰다. 이어 중화시킨 샘플에 페놀-클로로포름 추출법 및 에탄올 침전법을 사용하여 dLTA를 추출하였다.

상기 실시예 2-1 및 2-2에서 제조된 LPS 및 LTA의 탈아실화의 결과는 도 3에 기재되어 있다. 도 3의 결과에 의하면 LPS와 LTA의 지질부위 각각이 제거된 탈아실화된 dLPS 및 dLTA가 성공적으로 제조되었다.

실시예 3: dLPS 및 dLTA의 세포독성 검증

세포독성 측정에 사용할 96웰 마이크로플레이트를 미리 37℃에서 10분간 배양하였다. 준비된 농도의 dLPS와 dLTA, LPS와 LTA를 각각 50μl씩 웰에 분주하였다. 여기에 50μl의 LAL 시약(Pierce LAL Chromogenic Endotoxin Quantitation Kit, Thermo scientific)을 넣고, 마이크로플레이트를 가볍게 흔들어 준 후 37℃ 10분간 배양하였다. 이어 각 웰에 미리 37℃로 맞춘 100μl의 발색 기질 용액을 분주하고 가볍게 흔들어 준 후, 37℃ 6분간 배양하였다. 100μl의 반응종료 용액 을 각 웰에 분주 후, 가볍게 흔들어 주었다. 이어 흡광도분석기를 이용하여 405nm 파장에서 각 웰의 흡광도를 측정하였다.

결과는 도 4에 기재되어 있다. 지질부위가 제거되지 않은 LPS와 LTA는 세포독성능을 가지고 있으며(LPS: 1.66 EU/μg KDO eq., LTA: 0.56 EU/μg phosphate eq.), 각 물질의 지질부위가 제거되었을 때에는 세포독성능이 현저히 낮아진 것으로 나타났다(dLPS: 0.0072 EU/μg KDO eq., dLPS: 0.003 EU/μg phosphate eq.).

실시예 4: dLPS+dLTA 칵테일의 다양한 매질에 대한 항생물막 효과 검증

실시예 3에서와 같이 지질부위가 제거된 무독화된 LPS와 LTA의 항생물막 효과 검증 및 dLPS와 dLTA를 혼합하여 사용하였을 때 단독 사용시 보다 상승된 효과의 항생물막 능력을 가지는 지 여부를 병원성 세균[그람음성(Vibrio vulnificus, Pseudomonas aeruginosa)과 그람양성(Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes)]의 생물막형성(실 생활에 이용되는 다양한 매질에 대한 생물막 형성)에 대하여 확인 하였다.

구체적으로 본 실험에 사용된 박테리아는 Vibrio vulnificus MO6-24/O, Pseudomonas aeruginosa pRO1957, Staphylococcus aureus ATCC6538, Listeria monocytogenes ATCC19117 이다. 상기 해당 균들을 LB 배지 tryptone 1%, yeast extract 0.5%, NaCl 1%)를 이용하여 30℃에서 배양하였다. LB 배지에서 배양한 V. vulnificus, P. aeruginosa, S. aureus 및 L. monocytogenes를 사기그릇, 알루미늄, 황동, 유리, 스테인리스, 아크릴 매질이 들어있는 생물막 챔버에 접종한 후, 실시예 1에서 제조한 dLPS와 dLTA의 항생물막 효과를 확인하였다.

이를 위해 dLPS는 104~5200 μg/ml, dLTA는 7.5~375 μg/ml의 농도범위로 첨가하여 48시간 30℃로 호기조건에서 배양하였다. 48시간 후, 각 매질에 생긴 생물막을 1%의 크리스탈 바이올렛으로 염색하고 증류수로 한번 세척하였다. 100% EtOH를 이용하여 생물막에 염색된 크리스탈 바이올렛을 용출할 수 흡광도 측정기를 이용하여 분석하였다. 균의 성장은 595nm의 파장에서 흡광도를 측정하였다.

결과는 표 1에 기재되어 있다.

[표 1]

그람음성 병원성세균인 V. vulnificus에 의해 다양한 매질에 생성된 생물막에 dLPS를 여러 농도로 첨가해준 결과 항생물막 효과가 있음을 확인하였으며, 그람양성 병원성세균인 S. aureus에 의해 다양한 매질에 생성된 생물막에 dLTA를 여러 농도로 첨가해준 결과 항생물막 효과가 있음을 확인하였다.

또한 그람음성 병원성세균 두 종(V. vulnificus, P. aeruginosa)을 혼합하여 이 들 균주가 다양한 매질에 생성한 생물막에 dLPS를 여러 농도로 첨가해준 결과 항생물막 효과가 있음을 확인하였으며, 그람양성 병원성세균 두 종(S. aureus, L. monocytogenes)을 혼합하여 이들 균주가 다양한 매질에 생성한 생물막에 dLTA를 여러 농도로 첨가해준 결과 항생물막 효과가 있음을 확인하였다.

또한 그람음성과 그람양성 병원성 세균을 혼합하여 다양한 매질에 생성한 생물막에 ‘dLPS+dLTA cocktail’을 여러 농도로 첨가해준 결과 상승된 항생물막 효과가 있음을 확인하였다. 특히 dLPS와 dLTA 각각의 half maximal effective concentration (EC₅₀)을 계산한 결과, dLPS와 dLTA 각각을 첨가하였을 때보다 dLPS와 dLTA를 혼합하여 첨가하였을 때 항생물막 효과가 dLPS의 경우 매질에 따라 약 2~11배, dLTA의 경우 약 3~6배 그 효과가 증진되는 것으로 나타났다 (표 1).

위 결과를 바탕으로 13.9:1 혼합비의 ‘dLPS+dLTA cocktail’이 dLPS 혹은 dLTA 각각 따로 사용하는 것에 비해 항생물막 효과가 증진됨을 확인하였고, 아크릴을 제외한 실생활에서 다양하게 사용하는 매질에 대해 항생물막 효과가 나타남을 확인하였다.

<110> SOGANG UNIVERSITY RESEARCH & BUSINESS DEVELOPMENT FOUNDATION KOREA FOOD & DRUG ADMINISTRATION <120> COMPOSITION COMPRISING DETOXIFIED LIPOPOLYSACCHARIDE AND LIPOTEICHOIC ACID FOR PREVENTING OR INHIBITING FORMATION OF BIOFILM <130> DP201807009 <160> 5 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1466 <212> DNA <213> Bacteroides vulgatus <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1466) <223> strain MGM001 <400> 1 ccttacttca ggtacccccg gctcccatgg cttgacgggc ggtgtgtaca aggcccggga 60 acgttgacga cttagcccca gtcaccagtt ttaccctagg gcgctcctcg cggttacgca 120 ttcaccgcgc cgtggctgat gcgcgattac tagcgaatcc agcttcgtgg agtcgggttg 180 cagactccag tccgaactga gagaggtttt tgggattggc atccactcgc gtggtagcgg 240 ccctctgtac cccccattgt aacacgtgtg tagccccgga cgtaagggcc gtgctgattt 300 gacgtcatcc ccaccttcct cacatcttac gatggcagtc ttgtcagagt cctcagcaga 360 acctgttagt aactgacaac aagggttgcg ctcgttatgg cacttaagcc gacacctcac 420 ggcacgagct gacgacaacc atgcagcacc ttcacagatg ccttgcggct tacggctttc 480 accgtaattc atctgcaatt taagcccggg 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Claims

생물자원센터에 기탁번호 KCTC13624BP로 기탁된 박테로이데스 벌가투스 MGM001 (Bacteroides vulgatus MGM001) 균주 유래의 dLPS (deacylated Lipopolysaccharide), 및 dLTA (deacylated Lipoteichoic acid)를 조합으로 포함하는 생물막 형성 억제 또는 방지용 조성물.
삭제
제 1 항에 있어서,
상기 dLTA는 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) 유래인, 생물막 형성 억제 또는 방지용 조성물.
제 3 항에 있어서,
상기 dLPS 및 dLTA는 13.9:1 농도비(㎍/ml)로 포함하는 생물막 형성 억제 또는 방지용 조성물.
제 1 항, 제 3 항 또는 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 생물막은 그람음성 또는 그람양성 박테리아에 의해 생성된 것으로, 상기 그람음성 박테리아는 비브리오 벌니피쿠스 (Vibrio vulnificus), 또는 슈도모나스 에루기노사 (Pseudomohnas aeruginosa) 이고,
상기 그람양성 박테리아는 스테필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 또는 리스테리아 모노사이토게네스 (Listeria monocytogenes)인, 생물막 형성 억제 또는 방지용 조성물.
제 1 항, 제 3 항 또는 제 4 항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 인비트로에서 그람양성 또는 그람음성 박테리아와 접촉하는 단계를 포함하는, 인비트로에서 생물막 형성의 방지 또는 저해 방법.
제 6 항에 있어서,
상기 박테리아와의 접촉은 상기 조성물을 표면에 처리하는 것을 포함하는,
상기 표면은 글레이즈세라믹, 포설린, 유리, 금속, 나무, 크롬, 플라스틱, 비닐 및 포미카로 구성되는 군으로부터 선택되며, 상기 조성물은 아크릴 표면에는 생물막 형성의 방지 또는 저해 효과를 나타내지 않는 것인, 인비트로에서 생물막 형성의 방지 또는 저해 방법.