WO2024029756A1 - 리포테이코익산을 포함하는 칸디다 항진균용 조성물 - Google Patents

리포테이코익산을 포함하는 칸디다 항진균용 조성물 Download PDF

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WO2024029756A1
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lactobacillus
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candidiasis
lipoteichoic acid
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한승현
박동현
이동욱
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서울대학교산학협력단
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Definitions

  • the present invention relates to an antifungal composition using lipoteichoic acid derived from various gram-positive bacteria to inhibit the attachment and aggregation of Candida fungi, a pharmaceutical composition for preventing and treating candidiasis infection, and its use.
  • Candida fungus is a higher organism fungus that is different from bacteria known to form existing biofilms, and has the characteristic of being a eukaryotic cell, unlike bacteria, which are prokaryotic cells.
  • Candida fungi grow in the form of yeast, false hyphae, and hyphae depending on the environment. This free cell shape conversion characteristic of Candida fungi causes infiltration into human tissues and facilitates evasion from phagocytic cells and dispersal in the bloodstream. This can result in the formation of a biofilm with strong adhesion to human tissues, bloodstream, or medical devices such as catheters artificially inserted into the human body.
  • Surface attachment of Candida fungi plays an important role in diseases caused by infection.
  • Candida fungi a type of fungus. It is an infectious disease that occurs by infecting various parts of the body and causes symptoms such as thrush, vulvovaginitis, and vaginitis.
  • Candida albicans is a common bacterium that resides in the mucosa and stomach of healthy people, but is an opportunistic infection that causes infection in patients with impaired immune function or severe disease.
  • Candida vaginitis a common vaginitis caused by Candida albicans, is a disease with a high frequency of occurrence, with an average of 7.5 out of 10 women getting it at least once in their lifetime, and it can also cause various complications.
  • the biofilm of Candida fungi is formed through the strong adhesion and cohesion of fungi, and has a resistance to antifungal agents that is approximately 2000 times higher than that of yeast-type cells.
  • a eukaryote it has common characteristics with human cells, making it useful for removing fungi.
  • antifungal drugs with high therapeutic efficacy and low toxicity.
  • Lipoteichoic acid is a substance derived from Gram-positive bacteria and is one of the main components of the cell wall. It plays a role in the growth and adhesion of bacteria and the activation of the host's immune system.
  • Republic of Korea Patent Publication No. 10-2019-0017168 discloses a pharmaceutical composition of lipoteicoic acid for skin regeneration and wound healing, but does not disclose information about suppressing candidiasis.
  • the object of the present invention is i) lipoteichoic acid or a pharmaceutically acceptable salt thereof; or ii) to provide a Candida antifungal composition containing a cell wall extract containing lipoteichoic acid.
  • Another object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for preventing or treating candidiasis infection, comprising the composition.
  • Another object of the present invention is to provide a coating agent, health functional food, livestock feed additive, and food detergent containing the above composition.
  • the present inventors isolated and purified lipoteichoic acid with high purity from Lactobacillus, known as Gram-positive bacteria and a representative lactic acid bacterium, and performed various efficacy evaluations on fungal cells. As a result, even a small dose of lipoteichoic acid alone can be used to treat Candida fungi.
  • the present invention was completed by elucidating the mechanism of action that the inhibitory effect occurs when lipoteichoic acid interacts with Hsp70.
  • the present invention provides: i) lipoteichoic acid or a pharmaceutically acceptable salt thereof; or ii) a Candida antifungal composition comprising a cell wall extract containing lipoteichoic acid.
  • antifungal in the present invention refers to the ability to resist microorganisms and the ability to inhibit the growth or proliferation of microorganisms, and refers to all mechanisms to protect against the action of microorganisms such as bacteria, mold, yeast, etc., and the present invention may refer to the ability to interfere with the action of the Candida fungus.
  • Lipoteichoic acid or cell wall extract containing lipoteichoic acid contained in the antifungal composition of the present invention may be derived from Gram-positive bacteria.
  • the Gram-positive bacteria are Lactobacillus reuteri , Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus rhamnosus GG, Lactobacillus plantarum , Lactobacillus ca. Jay ( Lactobacillus casei ), Lactobacillus paracasei ( Lactobacillus paracasei ), Lactobacillus fermentum ( Lactobacillus fermentum ), Lactobacillus bulgaricus ( Lactobacillus delbrueckii subsp.
  • Lactobacillus helveticus Lactobacillus helveticus
  • Lactobacillus fur Mentum Lactobacillus fermentum
  • Lactobacillus salilvarius Lactococcus lactis, Enterococcus faecalis , Enterococcus faecium , Streptococcus thermophilus , Bifidobacterium bifidum , Bifidobacterium breve, Bifidobacterium longum , Bifidobacterium animalis subsp.
  • Lactis Bacillus It may be any one selected from the group consisting of strains containing Bacillus subtilis and subspecies strains of these strains, and the lipoteichoic acid or cell wall extract containing lipoteichoic acid is derived from the bacteria. However, it is not limited thereto, and any gram-positive bacteria can be used as an available strain.
  • the cell wall extract may be extracted using water, C 1 to C 4 lower alcohol, or a mixture thereof as a solvent. Thereafter, it may be separated and purified by applying sequential hydrophobic interaction chromatography and anion exchange chromatography.
  • the solvent used for the extraction in the present invention can be used without limitation as long as it is a substance that can be commonly used as an extraction solvent, and is preferably methanol, ethanol, propanol, isopropanol, and butanol.
  • One or more solvents selected from the group consisting of (butanol) and combinations thereof may be used, and more preferably, butanol may be used.
  • Candida includes Candida albicans , Candida tropicalis , Candida pseudotropicalis , Candida krusei , and Candida glabrata . and a mixture thereof, but is not limited thereto.
  • the composition can reduce the surface adhesion of Candida fungi.
  • the composition containing lipoteichoic acid when treated with the composition containing lipoteichoic acid compared to the control group that was not treated, it was confirmed that the surface attachment rate of Candida fungi was significantly weakened. did.
  • antifungal drugs are currently being used to treat candidiasis caused by the Candida fungus.
  • Candida fungi which are fungi, are similar in many ways to the cells of higher animals, including humans, so antifungal drugs that affect these fungi are also effective in the host.
  • antifungal drugs There are limits to the widespread use of antifungal drugs because strong antifungal drugs have the potential to be toxic to the host.
  • resistance to antifungal drugs has emerged as an important problem in the treatment of fungal infections (Protein J 2013, 32:15-26). Therefore, there was a need to develop an antifungal agent that was effective in treating fungal infections, had fewer side effects and less resistance, and could be used for a long period of time.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating candidiasis infection comprising the composition.
  • Candida albicans mycosis caused by Candida.
  • candidiasis caused by Candida albicans was first isolated from a thrush patient and causes vaginitis in women and diapers in infants. Causes a rash.
  • prevention refers to any action that suppresses or delays the onset of candidiasis by administering the pharmaceutical composition of the present invention
  • treatment refers to any action that has already been caused by the administration of the pharmaceutical composition of the present invention. It refers to all actions that improve or benefit the symptoms of candidiasis.
  • the term “infection caused by Candida fungi” may be an infection that can be suppressed by the antifungal effect of the antifungal composition of the present invention, which can be an infection that is treated with existing disinfectants and antibiotics and an infection caused when the disease is diagnosed. Includes possible cases.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may additionally contain appropriate carriers, excipients, or diluents according to conventional methods.
  • Carriers, excipients and diluents that may be included in pharmaceutical compositions containing the compound include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, gum acacia, alginate, gelatin, calcium phosphate, Examples include, but are not limited to, calcium silicate, cellulose, methyl cellulose, microcrystalline cellulose, polyvinyl pyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate, and mineral oil.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be prepared by any method selected from the group consisting of powders, pills, granules, capsules, suspensions, oral solutions, emulsions, syrups, sterilized aqueous solutions, non-aqueous solutions, suspensions, freeze-dried preparations and suppositories. It can be formulated in one dosage form. When formulated, it can be manufactured using diluents or excipients such as commonly used fillers, extenders, binders, wetting agents, disintegrants, and surfactants. Suitable agents known in the art are preferably those disclosed in the literature (Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton PA).
  • the pharmaceutical composition of the present invention is administered in a pharmaceutically effective amount.
  • pharmaceutically effective amount refers to an amount sufficient to exhibit an antifungal effect against Candida fungi and an amount sufficient to not cause side effects or a serious or excessive immune response, and the effective dose level is the amount sufficient to produce a therapeutic effect.
  • the term "administration" refers to introducing a predetermined substance into a patient by any appropriate method, and is formulated for human or veterinary use and administered through various routes.
  • the composition of the present invention can be administered by parenteral routes, such as intravascular, intravenous, intraarterial, intramuscular or subcutaneous, and can also be administered by oral, nasal, rectal, transdermal or inhalation routes via aerosol. , it can be administered as a bolus or infused slowly.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be administered as an individual therapeutic agent or in combination with other therapeutic agents, and may be administered sequentially or simultaneously with conventional therapeutic agents. And it can be administered single or multiple times. Considering all of the above factors, it is important to administer an amount that can achieve maximum effect with the minimum amount without side effects, and can be easily determined by a person skilled in the art.
  • the preferred dosage of the pharmaceutical composition of the present invention varies depending on the patient's condition and weight, degree of disease, drug form, administration route and period, but can be appropriately selected by a person skilled in the art. However, for a desirable effect, it is recommended to administer 0.01 mg/kg to 10 g/kg per day, preferably 1 mg/kg to 1 g/kg. Administration may be administered once a day, or may be administered in several divided doses. Accordingly, the above dosage does not limit the scope of the present invention in any way.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may include one or more known active ingredients that have effects in preventing and treating candidiasis along with a composition containing lipoteichoic acid.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be used in prescription drugs, hygiene products, etc. to perform an antifungal function against Candida fungi.
  • Hygiene products include oral cleaning products such as gargles and Listerine, toothpaste, oral hygiene products, soap, hand soap, vaginal cleanser additives, skin cleanser compositions such as body cleansers, kitchen utensil cleaning compositions for cleaning dishes, sinks, cutting boards, etc., When added as an active ingredient to hygiene products such as cosmetic compositions such as essence and cream, it can perform an antifungal function against Candida fungi in addition to the original function of each hygiene product.
  • the candidiasis for which the pharmaceutical composition is effective includes vulvovaginitis, vaginitis, esophagitis, paronychia, oropharyngitis, digestive candidiasis, mucosal candidiasis, cutaneous candidiasis, Candida fungemia, Candida endophthalmitis, Candida peritonitis, Candida osteoarthritis, It may be any one or more selected from the group consisting of Candida spondylitis and hepatosplenic candidiasis, but is not limited thereto.
  • vaginal candidiasis means Candida albicans , Candida tropicalis , Candida pseudotropicalis , Candida krusei , and Candida glabrata . and mixtures thereof. Vaginal candidiasis is also called candidal vaginitis.
  • the pharmaceutical composition of the present invention interacts with Hsp70, a surface protein of Candida fungi, to reduce adhesion, thereby inhibiting biofilm formation and inhibiting fungal infection (see FIGS. 3 and 4).
  • the present invention provides a method for preventing or treating candidiasis, comprising administering the pharmaceutical composition to an individual who is expected to develop candidiasis or has developed candidiasis.
  • the term "individual” refers to a living organism that can develop candidiasis, preferably a higher vertebrate that can show symptoms of candidiasis, and more preferably a cow that can develop candidiasis. , livestock such as pigs, sheep, goats, dogs, etc., and people who can become infected from them.
  • the pharmaceutical composition of the present invention When the pharmaceutical composition of the present invention is administered to the subject, it can have the effect of preventing or treating candidiasis by improving the subject's immunity against strains that cause candidiasis.
  • the subject of administration of this pharmaceutical composition may primarily be livestock such as cattle, pigs, sheep, goats, and dogs, but is not limited thereto, and can also be used for the prevention or treatment of humans who may be infected with candidiasis by the livestock. You can.
  • the present invention provides a coating agent comprising the composition.
  • the term "antifungal coating agent” is a coating agent to prevent surface adhesion and biofilm formation formed by fungi.
  • a high concentration of disinfectant or antibiotic is used because it has strong resistance to microbial inhibitors. When administered, it can cause serious damage to the surrounding area, so it can be used to prevent surface adhesion and biofilm formation in advance.
  • locations where biofilms can be formed may be moist areas of mucous membranes and skin, including the skin, oral cavity, digestive tract, and vagina.
  • areas that cause stomatitis include the tongue, inside the cheek, the palate including the oral cavity, oral lining, throat, esophagus, and genital area, including the vulva, vagina, and penis, and moist skin, fingernails or toenails, groin, armpits, and fingers. It may also include, but is not limited to, the skin folds between the legs and toes, under the breasts, and the skin folds of the abdomen.
  • sutures, extraction sites, arteriovenous sites, scleral buckle sites, contact lenses, IUDs, tracheal tubes, Hickman catheters, central venous catheters, artificial heart valves, valve grafts, orthopedic devices Examples include penile prosthesis, and other examples are described in the paper by Costerton J et al and Costerton J and Steward (2001 Battling Biofilms, Scientific American pp 75-81), which is hereby incorporated by reference. included in Other locations where biofilms can form include cavities, which can progress to gum disease and cavities, contact lenses, which can progress to eye infections, and ears and pneumonia, which can become chronic infections. Includes the lungs.
  • the coating agent can be used in medical devices, medical materials, medical implants, building interior materials, household goods, industrial products, electronic products, clothing, and artificial organs, but is not limited to this and has the potential to be contaminated or infected by Candida fungi. It can be used wherever it is available.
  • medical devices refer to all devices that assist medical practices for performing surgery, treatment, prevention, etc.
  • examples include vascular stents, artificial blood vessels, artificial valves, blood collection devices, hemodialysis equipment and devices, and the aforementioned catheters. It may include, but is not limited to, devices that may be contaminated or infected by Candida fungi.
  • the present invention provides a health functional food containing the composition.
  • health functional food refers to food manufactured and processed using raw materials or ingredients with functionality useful to the human body in accordance with Act No. 6727 on Functional Food
  • functionality refers to the structure of the human body and It means ingestion for the purpose of controlling nutrients for function or obtaining useful health effects such as physiological effects.
  • the health functional food of the present invention can be used for the purpose of preventing or treating candidiasis infection.
  • the composition containing lipoteichoic acid of the present invention can be added as is or used together with other foods or food ingredients, and can be used appropriately according to conventional methods.
  • foods to which the above substances can be added include meat, sausages, bread, chocolate, candy, snacks, confectionery, pizza, ramen, other noodles, gum, dairy products including ice cream, various soups, beverages, tea, and drink preparations. , alcoholic beverages and vitamin complexes, and includes all health foods in the conventional sense.
  • the mixing amount of the active ingredients can be appropriately determined depending on the purpose of use (prevention, health, or therapeutic treatment).
  • the composition containing lipoteichoic acid of the present invention is added in an amount of 1 to 20% by weight, preferably 5 to 10% by weight, based on the raw materials.
  • the amount may be below the above range, and since there is no problem in terms of safety, the active ingredient may be used in an amount above the above range.
  • the beverage composition of the invention may contain various flavoring agents or natural carbohydrates as additional ingredients like conventional beverages.
  • the above-mentioned natural carbohydrates include monosaccharides such as glucose and fructose, disaccharides such as maltose and sucrose, polysaccharides such as dextrin and cyclodextrin, and sugar alcohols such as xylitol, sorbitol, and erythritol.
  • a sweetener natural sweeteners such as thaumatin and stevia extract or synthetic sweeteners such as saccharin and aspartame can be used.
  • the ratio of the natural carbohydrate is generally about 0.01 to 0.04 g, preferably about 0.02 to 0.03 g, per 100 ml of the composition of the present invention.
  • composition of the present invention contains various nutrients, vitamins, electrolytes, flavors, colorants, pectic acid and its salts, alginic acid and its salts, organic acids, protective colloidal thickeners, pH adjusters, stabilizers, preservatives, glycerin, alcohol, It may contain carbonating agents used in carbonated drinks.
  • composition of the present invention may contain pulp for the production of natural fruit juice, fruit juice drinks, and vegetable drinks. These ingredients can be used independently or in combination. The ratio of these additives is not very important, but is generally selected in the range of 0.01 to 0.1 parts by weight per 100 parts by weight of the composition of the present invention.
  • the present invention provides a livestock feed additive containing the composition.
  • the composition When used as a feed additive in the present invention, the composition may be a highly concentrated solution of 20 to 90% or may be prepared in powder or granule form.
  • the feed additives include organic acids such as citric acid, malic acid, adipic acid, lactic acid, and malic acid, phosphates such as sodium phosphate, potassium phosphate, acid pyrophosphate, and polyphosphate (polymerized phosphate), polyphenol, catechin, alpha-tocopherol, and rosemary. It may additionally contain one or more of natural antioxidants such as extract, vitamin C, green tea extract, licorice extract, chitosan, tannic acid, and phytic acid.
  • the composition When used as feed, the composition may be formulated in the form of a normal feed and may include common feed ingredients.
  • the feed additives and feeds include grains, such as crushed or crushed wheat, oats, barley, corn, and rice; Vegetable protein feeds, such as those based on rape, soybean, and sunflower; Animal protein feeds such as blood meal, meat meal, bone meal and fish meal; It may further include dry ingredients such as sugar and dairy products, such as various powdered milk and whey powder, and may further include nutritional supplements, digestion and absorption enhancers, growth promoters, etc.
  • the feed additive may be administered to animals alone or in combination with other feed additives in an edible carrier.
  • the feed additives can be easily administered to animals as top dressing, by mixing them directly into animal feed, or in an oral dosage form separate from the feed.
  • the feed additive When the feed additive is administered separately from animal feed, it can be prepared into an immediate-release or sustained-release formulation by combining it with a pharmaceutically acceptable edible carrier, as is well known in the art.
  • a pharmaceutically acceptable edible carrier as is well known in the art.
  • These edible carriers may be solid or liquid, such as corn starch, lactose, sucrose, soy flakes, peanut oil, olive oil, sesame oil and propylene glycol.
  • the feed additive may be a tablet, capsule, powder, troche or sugar-containing tablet, or a top dressing in microdisperse form.
  • the feed additive may be in the form of gelatin soft capsules, syrup, suspension, emulsion, or solution.
  • the feed additives and feeds may contain auxiliaries such as preservatives, stabilizers, wetting or emulsifying agents, solution accelerators, etc.
  • the feed additive can be used by adding it to animal feed by injecting, spraying, or mixing it.
  • the feed or feed additive in the present invention can be applied to a number of animal diets, including mammals, poultry, and fish.
  • animals include mammals, and as mammals, they can be used for pigs, cows, sheep, goats, laboratory rodents, and laboratory rodents, as well as pets (e.g., dogs, cats), and poultry include chicken, It can also be used for turkey, duck, goose, pheasant, and quail, and can be used for trout as the fish, but is not limited to this.
  • composition of the present invention can be used as pet snacks, oral care products, hygiene products, and health functional foods for animals, and can be used as any pet product without limitation to the above-mentioned examples.
  • the present invention provides a food detergent comprising the composition.
  • the antifungal composition containing lipoteichoic acid according to the present invention has the effect of inhibiting biofilm formation and inhibiting fungal infection by reducing the adhesion of Candida fungi, and is highly safe in the human body through the use of biocompatible materials.
  • an antifungal agent that can reduce side effects, it can not only effectively treat candidiasis, an infectious disease caused by the Candida fungus, but also control Candida infections through medical devices inserted into the human body.
  • Figure 1 shows the results confirming the effect of LreLTA in reducing surface adhesion of Candida albicans.
  • Figure 2 shows the results confirming the effect of LreLTA on reducing surface adhesion of Candida albicans that has already attached and formed colonies.
  • Figure 3 shows the results confirming the effect of reducing surface adhesion of Candida albicans by LTA isolated and purified from various bacteria.
  • Figure 4 shows the results confirming the effect of reducing surface adhesion of Candida albicans by treatment with heat shock protein 70 inhibitor and LreLTA.
  • Figure 5 shows the results confirming the effect of reducing surface adhesion of Candida albicans when treated with LreLTA using an ex vivo model.
  • Figure 6 shows the results confirming the effect of reducing surface adhesion of Candida albicans when treated with LreLTA using an in vivo model.
  • Example 1 Lactobacillus reuteri ( Lactobacillus reuteri ) Separation and purification of lipoteichoic acid from
  • L. reuteri ATCC 23272 strain was used to purify lipoteichoic acid from L. reuteri .
  • L. reuteri was inoculated into de man, rogosa and sharpe broth (MRS broth), cultured at 37°C for 24 hours, and then the bacteria were harvested by centrifugation.
  • the harvested bacteria were homogenized using an ultrasonicator, the homogenate was dissolved in butanol, an organic solvent, and the lipid layer was separated by centrifugation. Afterwards, the separated extract was purified using hydrophobic interaction chromatography and anion exchange chromatography sequentially, and the purified product was freeze-dried to obtain the final dried product.
  • Example 2 L. reuteri Candida albicans caused by LTA (LreLTA) Candida albicans ) effect of reducing surface adhesion
  • Example 3 LreLTA has already attached and formed a colony C. albicans effect on
  • C. albicans SC5314 strain was cultured in YPD medium and prepared at 1 x 10 4 CFU/ml. Biofilm was formed at 37°C for 24 hours. Afterwards, the formed biofilm was treated with LreLTA at different concentrations of 3, 10, and 30 ⁇ g/ml, cultured at 37°C for 24 hours, and the degree of adhesion to the biofilm surface was compared through 0.1% crystal violet staining. As a result of the experiment, it was confirmed that LreLTA showed a reduction in surface adhesion even in deformed biofilms of C. albicans (Figure 2A).
  • Example 4 Candida albicans (Candida albicans) isolated and purified from various lactic acid bacteria and Gram-positive bacteria by LTA C. albicans ) effect of reducing surface adhesion
  • LTA isolated and purified from various other lactic acid bacteria and Gram-positive bacteria on the surface adhesion of C. albicans LTA isolated and purified from the wild-type strain SC5314, 5 types of lactic acid bacteria, and 3 types of Gram-positive bacteria were used.
  • C. albicans SC5314 strain was cultured in YPD medium, the number of cells was 1 x 10 4 CFU/ml, and 8 types of LTA were treated at a single concentration of 30 ⁇ g/ml. After culturing at 37°C for 24 hours, the degree of attachment to the biofilm surface was compared through 0.1% crystal violet staining.
  • LTA Lactobacillus acidophilus lipoteichoic acid
  • LrLTA Lactobacillus rhamnosus GG lipoteichoic acid
  • LpLTA Lactobacillus plantarum
  • LcLTA Lactobacillus casei lipoteichoic acid
  • LreLTA Lactobacillus reuteri lipoteichoic acid
  • EfLTA Enterococcus fecalis lipoteichoic acid
  • SmLTA Streptococcus mutans lipoteichoic acid
  • BsLTA Bacillus subtilis lipoteichoic acid).
  • Example 5 Verification of the efficacy of LreLTA through heat shock protein 70 inhibitor VER-155008
  • Hsp70 is known to play a role in controlling overall virulence factors and drug resistance in C. albicans , so the present inventors conducted an experiment using VER-155008, an Hsp70 inhibitor.
  • C. albicans SC5314 strain was cultured in YPD medium, prepared at 1 In terms of concentration, VER-155008 was simultaneously treated at concentrations of 1, 10, 50, and 100 ⁇ M. After culturing for 24 hours, the degree of attachment to the biofilm surface was compared through 0.1% crystal violet staining.
  • Example 6 ex vivo of LreLTA via model albicans Verification of the effect of reducing adhesion
  • the C. albicans SC5314 strain was used to determine whether the effect of LreLTA on weakening the adhesion to the surface of C. albicans was the same in biological tissues and to determine colony forming units (CFU).
  • Wild mice of the C57BL/6 strain were purchased from Duyeol Biotech and used as experimental animals for the ex vivo model, and animal experiments were conducted in strict compliance with the ethical regulations for laboratory animal research. After the mouse was euthanized, the tongue was removed. The extracted tongue was co-treated with 1 Afterwards, it was cultured at 37°C for 24 hours. Afterwards, the tongue tissue cultured with the bacteria was homogenized using a homogenizer and then inoculated onto agar medium to compare the degree of colony forming units.
  • Example 7 in vivo of LreLTA via model C. albicans Verification of the effect of reducing adhesion
  • a mouse oral candidiasis model was used to confirm whether the effect of LreLTA on weakening the surface adhesion of C. albicans shows the same phenomenon in animal disease models.
  • Wild-type mice of the C57BL/6 strain were purchased from Duyeol Biotech and used as experimental animals for the in vivo model, and animal experiments were performed in strict compliance with the ethical regulations for laboratory animal research. Infection was carried out by inserting a cotton swab containing 1 Afterwards, water for injection (control group) or LreLTA (experimental group) was administered into the oral cavity of mice every day. After developing candidiasis for 5 days, the mouse was euthanized, the tongue tissue was removed, homogenized using a homogenizer, and then inoculated into agar medium to compare the degree of colony forming units.
  • LreLTA shows the same effect in the mouse Candida vaginitis model
  • C. albicans SC5314 strain was cultured in YPD medium, the number of cells was prepared at 1 x 107 CFU/ml, and then injected into the vagina of the mouse.
  • LreLTA was co-treated at a single concentration of 50 ⁇ g/ml.
  • water for injection (control group) or LreLTA (experimental group) was injected into the vagina of mice every day.
  • the mice were euthanized, vaginal tissue was extracted, homogenized using a homogenizer, and then inoculated into agar medium to compare the degree of colony forming units.

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Abstract

본 발명은 다양한 그람양성균으로부터 유래한 리포테이코익산이 칸디다 진균의 부착과 응집을 억제하는 것을 이용한 항진균용 조성물, 칸디다증 감염 예방 및 치료용 약학적 조성물 및 이의 용도에 관한 발명으로, 이를 이용한 경우, 칸디다 진균의 감염과 칸디다증의 대표적 독성 인자인 부착력과 응집력을 저해하는 효과를 확인하였는 바, 칸디다 진균 항진균용 및 칸디다증 감염과 관련된 예방 또는 치료용으로 이용할 수 있다.

Description

리포테이코익산을 포함하는 칸디다 항진균용 조성물
본 발명은 다양한 그람양성균으로부터 유래한 리포테이코익산이 칸디다 진균의 부착과 응집을 억제하는 것을 이용한 항진균용 조성물, 칸디다증 감염 예방 및 치료용 약학적 조성물 및 이의 용도에 관한 것이다.
칸디다 진균은 기존 생물막을 형성하는 것으로 알려진 세균과는 다른 고등생물의 진균으로, 원핵세포인 세균과는 달리 진핵세포라는 특징을 갖는다. 칸디다 진균은 환경에 따라 효모형, 가균사, 그리고 균사의 형태로 성장하며, 칸디다 진균의 이러한 자유로운 세포 형태 변환 특성을 통해 인간 조직으로의 침투 감염을 일으키고 포식세포로부터의 회피와 혈류내의 분산을 쉽게 할 수 있으며 결과적으로 사람의 조직이나 혈류 내부, 또는 인공적으로 인체 내에 삽입된 카테터와 같은 의료기구에 부착력이 강력한 생물막을 형성하게 된다. 칸디다 진균의 표면 부착은 감염으로 인한 질병에서 중요한 역할을 한다.
칸디다증(Candidiasis)은 진균의 일종인 칸디다 진균에 의해 발생한다. 신체의 다양한 부위에 감염되어 발생하는 감염 질환으로 아구창, 외음부염, 그리고 질염 등의 증상이 나타난다. 칸디다 진균 중, 칸디다 알비칸스는 건강한 사람의 점막과 위장에 상주하는 상재균이지만 면역기능에 손상이 생기거나 중증의 질병을 앓는 환자들에게서 감염을 유발시키는 기회감염균이다. 또한 칸디다 알비칸스에 의해 일어나는 흔한 질염인 칸디다성 질염은 여성 10명 중 평균 7.5명은 일생동안 한 번 이상 걸릴 정도로 발생 빈도가 높은 질병이며, 다양한 합병증을 유발하기도 한다.
칸디다 진균의 생물막은 진균의 강력한 부착력과 응집력을 통해 형성되며, 효모형 세포와 비교하였을 때 약 2000배 높은 항진균제에 대한 저항성을 가지며, 진핵생물로서 사람의 세포와 공통된 특징을 보유하기 때문에 진균 제거에 특이적인 의약품의 개발이 어렵고 몇몇 환자에게선 심한 부작용이 나타나는 만큼, 높은 치료 효과와 낮은 독성을 갖는 항진균제의 개발이 시급한 상황이다.
리포테이코익산은 그람양성균에서 유래한 물질로 세포벽의 주요 구성 성분 중 하나이며 세균의 성장과 부착, 숙주의 면역체계 활성 등의 역할을 한다.
대한민국 공개특허공보 10-2019-0017168은 리포테이코익산의 피부 재생 및 창상 치유용 약학적 조성물에 대해서 밝히고 있으나, 칸디다증을 억제한다는 정보는 개시되어 있지 않다.
이러한 배경하에서, 본 발명자들은 칸디다증을 보다 효과적으로 억제할 수 있는 조성물을 개발하고자 예의 연구 노력한 결과, 그람양성균으로부터 분리한 리포테이코익산이 칸디다 진균의 표면 부착력을 감소시키는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 i) 리포테이코익산 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염; 또는 ii) 리포테이코익산을 포함하는 세포벽 추출물을 포함하는 칸디다(Candida) 항진균용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 조성물을 포함하는 칸디다증 감염 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 조성물을 포함하는 코팅제, 건강기능식품, 가축사료 첨가제 및 식품 세정제를 제공하는 것이다.
그러나, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
이에 본 발명자들은 그람양성균 및 대표적인 유산균으로 알려진 락토바실러스로부터 리포테이코익산을 높은 순도로 분리 정제하였으며, 진균 세포에서의 다양한 효능 평가를 수행한 결과, 리포테이코익산 단독의 적은 용량으로도 칸디다 진균의 감염과 칸디다증의 대표적 독성 인자인 부착력과 응집력을 저해하는 효과를 in vitro와 ex vivo 실험모델을 통해 검증하였다. 또한, 억제 효과는 리포테이코익산이 Hsp70과 상호작용함으로써 일어난다는 작용기전을 밝힘으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명은 i) 리포테이코익산 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염; 또는 ii) 리포테이코익산을 포함하는 세포벽 추출물을 포함하는 칸디다(Candida) 항진균용 조성물을 제공한다.
본 발명의 용어 "항진균"은 미생물에 저항하는 능력 및 미생물의 생장 또는 증식을 억제하는 능력을 의미하며, 세균이나 곰팡이, 효모 등과 같은 미생물의 작용으로부터 방어하기 위해 이루어지는 모든 기작을 의미하며, 본 발명에서는 칸디다 진균의 작용을 방해하는 능력을 의미할 수 있다.
본 발명의 항진균용 조성물에 포함되는 리포테이코익산 또는 리포테이코익산을 포함하는 세포벽 추출물은 그람양성균으로부터 유래한 것일 수 있다.
바람직하게는 상기 그람양성균은 락토바실러스 루테리(Lactobacillus reuteri), 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus), 락토바실러스 람노서스GG(Lactobacillus rhamnosus GG), 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum), 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei), 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei), 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum), 락토바실러스 불가리쿠스(Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus), 락토바실러스 헬베티쿠스 (Lactobacillus helveticus), 락토바실러스 퍼멘툼 (Lactobacillus fermentum), 락토바실러스 살리바리우스(Lactobacillus salilvarius), 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis), 엔테로코커스 페칼리스(Enterococcus faecalis), 엔테로코커스 패시움(Enterococcus faecium), 스트렙토코커스 써모필러스(Streptococcus thermophilus), 비피도박테리움 비피덤(Bifidobacterium bifidum), 비피도박테리움 브리브(Bifidobacterium breve), 비피도박테리움 롱굼(Bifidobacterium longum), 비피도박테리움 아니말리스 락티스(Bifidobacterium animalis subsp. Lactis), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)를 포함하는 균주 및 이 균주들의 아종 균주로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 1종일 수 있으며, 상기 리포테이코익산 또는 리포테이코익산을 포함하는 세포벽 추출물은 상기 균으로부터 유래한 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않고 그람양성균이라면 이용 가능한 균주로 사용될 수 있다.
본 발명에서 상기 세포벽 추출물은 물, C1 내지 C4의 저급 알코올 또는 이들의 혼합물을 용매로 하여 추출될 수 있다. 이후, 순차적인 소수성 상호작용 크로마토그래피와 음이온 교환 크로마토그래피의 적용으로 분리 정제된 것일 수 있다.
본 발명에서 상기 추출에 이용되는 용매는 통상적으로 추출 용매로 사용될 수 있는 물질이라면 제한 없이 사용할 수 있으며, 바람직하게는 메탄올(methanol), 에탄올(ethanol), 프로판올(propanol), 이소프로판올(isopropanol), 부탄올(butanol) 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나이상의 용매를 사용할 수 있고, 보다 바람직하게는 부탄올을 사용할 수 있다.
상기 칸디다 항진균용 조성물에서, 칸디다는 칸디다 알비칸스(Candida albicans), 칸디다 트로피칼리스(Candida tropicalis), 칸디다 수도트로피칼리스(Candida pseudotropicalis), 칸디다 크루세이(Candida krusei), 칸디다 글라브라타(Candida glabrata) 및 이들의 혼합을 포함하는 군에서 선택된 균류(fungi)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 상기 조성물은 칸디다 진균의 표면 부착력을 감소시킬 수 있다. 구체적인 일실시예에서, 도 1 내지 도 3에 나타난 바와 같이, 리포테이코익산을 포함하는 조성물을 처리하지 않은 대조군에 비하여 상기 조성물을 처리한 경우, 칸디다 진균의 표면 부착률이 유의미하게 약화되었음을 확인하였다.
또한, 칸디다 진균에 의해 발생하는 칸디다증의 치료에 현재 많은 항진균제가 사용되고 있으나, 진균에 해당하는 칸디다 곰팡이균은 사람을 포함한 고등동물의 세포와 많은 부분이 유사하여 이러한 진균에 영향을 주는 항진균제가 숙주에도 영향을 줄 수 있고, 이로 인해 강한 항진균제는 숙주에게 독성을 나타낼 가능성이 있기 때문에 항진균 약제들의 광범위한 사용에는 한계가 있었다. 또한 최근 항진균제에 대한 내성을 획득하거나 내재성 내성을 지닌 진균(특히 칸디다 아우리스)의 증가로 항진균제의 내성이 진균 감염의 치료에 중요한 문제로 대두되었다(Protein J 2013, 32:15-26). 따라서 진균 감염의 치료에 효과적이면서 부작용과 내성이 적어 장기간 사용이 가능한 항진균제의 개발이 요구되었다.
또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 칸디다증 감염 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명에서 용어 "칸디다증(candidiasis)"이란, 칸디다로 인한 진균증을 의미하며, 일례로 칸디다 알비칸스(Candida albicans)로 인한 칸디다증의 경우, 최초로 아구창 환자에게서 분리되었고 여성의 경우 질염을 일으키고 유아의 기저귀 발진을 유발한다.
본 발명에서 용어 "예방"이란, 본 발명의 약학적 조성물의 투여로 칸디다증의 발병을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미하며, "치료"란, 본 발명의 약학적 조성물의 투여로 인해 이미 유발된 칸디다증의 증세가 호전되거나 이롭게 되는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서 용어 “칸디다 진균에 의해 유발되는 감염증”은 본 발명의 항진균용 조성물의 항진균효과로 억제될 수 있는 감염증일 수 있으며, 이는 기존의 소독제, 항생제로 치료하던 감염증과 질병 진단시 감염증이 유발될 수 있는 경우를 포함한다.
본 발명의 약학적 조성물은 통상의 방법에 따라 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 추가적으로 포함할 수 있다. 화합물을 함유하는 약학적 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 약학적 조성물은 통상의 방법에 따라 산제, 환제, 과립제, 캡슐제, 현탁액, 내용액제, 유제, 시럽제, 멸균된 수용액, 비수용액제, 현탁액, 동결 건조제 및 좌제로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 제형으로 제제화될 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 제조될 수 있다. 당해 기술 분야에 알려진 적합한 제제는 문헌(Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton PA)에 개시되어 있는 것을 사용하는 것이 바람직하다.
본 발명의 약학적 조성물은 약제학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명의 용어 "약제학적으로 유효한 양"이란, 칸디다 진균에 대한 항진균 효과를 나타낼 수 있을 정도의 충분한 양과 부작용이나 심각한 또는 과도한 면역반응을 일으키지 않을 정도의 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 치료될 장애, 장애의 중증도, 특정 화합물의 활성, 투여 경로, 치료 지속 기간, 리포테이코익산을 포함하는 조성물과 조합되거나 또는 동시에 사용되는 약물, 대상체의 연령, 체중, 성별, 식습관, 일반적인 건강 상태, 및 의약 업계 및 의학 분야에 공지된 인자를 비롯한 다양한 인자들에 따라 달라질 것이다. "치료상 유효량" 결정시 고려되는 다양한 일반적인 사항들은 당업자에게 공지되어 있으며, 예를 들어 문헌 [Gilman et al., eds., Goodman And Gilman's: The Pharmacological Bases of Therapeutics, 8th ed., Pergamon Press, 1990] 및 [Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th ed., Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1990]에 기재되어 있다.
본 발명에서 용어 "투여"란, 어떠한 적절한 방법으로 환자에게 소정의 물질을 도입하는 것을 의미하며, 인체 또는 수의용으로 제형화되어 다양한 경로로 투여된다. 본 발명의 조성물은 비경구 경로, 예컨대 혈관내, 정맥내, 동맥내, 근육내 또는 피하 등의 경로로 투여될 수 있고, 경구, 비강, 직장, 경피 또는 에어로졸을 통한 흡입 경로로 투여될 수도 있으며, 볼루스(bolus)로 투여하거나 또는 서서히 주입할 수도 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 그리고 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물에서의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나 바람직한 효과를 위해서, 1일 0.01 mg/kg 내지 10 g/kg으로, 바람직하게는 1 mg/kg 내지 1 g/kg으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수 있다. 따라서, 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 약학적 조성물은 리포테이코익산을 포함하는 조성물과 함께 칸디다증의 예방 및 치료 효과를 갖는 공지의 유효성분을 1종 이상 포함할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 전문의약품, 위생 용품 등에 이용되어 칸디다 진균에 대한 항진균 기능을 수행할 수 있다.
위생용품으로는 가글, 리스테린 등 구강 세정 용품, 치약, 구강 위생용품, 비누, 핸드솝, 질 세정제 첨가제, 전신세정제 등의 피부 세정제 조성물, 식기나 싱크대, 도마 등을 세정하기 위한 주방용품 세정제 조성물, 에센스, 크림 등의 화장료 조성물과 같은 위생용품에 유효성분으로 첨가하면, 각각의 위생용품 본래의 기능 외에 칸디다 진균에 대한 항진균의 기능을 수행할 수 있다.
본 발명에서 상기 약학적 조성물의 효과가 있는 상기 칸디다증은 외음부염, 질염, 식도염, 손발톱 주위 염, 구인두염, 소화관 칸디다증, 점막 칸디다증, 피부 칸디다증, 칸디다 진균혈증, 칸디다 내안구염, 칸디다 복막염, 칸디다 골관절염, 칸디다 척추염 및 간비장 칸디다증으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 1종 이상일 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.
예를 들어, "질 칸디다증"은 칸디다 알비칸스(Candida albicans), 칸디다 트로피칼리스(Candida tropicalis), 칸디다 수도트로피칼리스(Candida pseudotropicalis), 칸디다 크루세이(Candida krusei), 칸디다 글라브라타(Candida glabrata) 및 이들의 혼합을 포함하는 군에서 선택된 칸디다 속의 균류에 의해 발생한 구체적 종류의 질 진균증을 의미한다. 질 칸디다증은 또한 칸디다성 질염(candidal vaginitis)으로 불린다.
본 발명의 약학적 조성물은 칸디다 진균의 표면 단백질인 Hsp70과 상호작용함으로써, 부착력을 감소시켜 생체막 형성을 저해하고 진균 감염을 억제한다(도 3 및 도 4 참조).
또한, 본 발명은 칸디다증의 발병이 예상되거나 또는 칸디다증이 발병된 개체에게 상기 약학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 칸디다증을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.
본 발명에서 용어 "개체"란, 칸디다증이 발병할 수 있는 살아있는 유기체를 의미하는데, 바람직하게는 칸디다증의 증상이 나타날 수 있는 고등 척추동물이 될 수 있고, 보다 바람직하게는 칸디다증이 발병될 수 있는 소, 돼지, 양, 염소, 개 등의 가축 및 이로부터 감염될 수 있는 사람이 될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물을 상기 개체에 투여하면, 칸디다증을 유발시키는 균주에 대하여 개체의 면역성을 증진시켜서, 칸디다증을 예방 또는 치료하는 효과를 나타낼 수 있다. 이러한 약학적 조성물의 투여 대상은 일차적으로는 소, 돼지, 양, 염소, 개 등의 가축이 될 수 있으나, 이에 제한되지 않고, 상기 가축에 의하여 칸디다증이 전염될 수 있는 인간의 예방 또는 치료에도 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 코팅제를 제공한다.
본 발명에서 용어 "항진균 코팅제"는 진균에 의해 형성된 표면 부착력 및 생물막 형성을 방지하기 위한 코팅 제제이며, 미생물의 부착 이후 형성된 막을 제거하기 위해서는 미생물 저해제에 대한 저항성이 강한 상태이므로 고농도의 살균제나 항생제를 투여하게 되어, 주변에 심각한 손상을 줄 수 있기 때문에 표면 부착력 및 생물막 형성을 사전에 예방하는 데에 이용될 수 있다.
본 발명에서 생물막이 형성될 수 있는 위치로는, 피부, 구강, 소화관 및 질을 포함하여 점막과 피부의 습한 부위일 수 있다. 예시로서, 구내염을 일으키는 부위인 혀, 볼 안쪽, 입천장을 비롯한 구강, 구강내막, 목구멍과 식도 및 성기부위로 외음부 및 질, 음경이 포함될 수 있으며, 습한 피부나 손톱 또는 발톱, 서혜부, 겨드랑이, 손가락 사이와 발가락 사이, 유방 아래 피부 주름 부위, 복부의 피부 주름부위 또한 포함될 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.
또한, 봉합, 적출부, 동정맥부, 공막돌융술 (scleral buckle) 부위, 콘택트 렌즈, IUD, 기관 튜브, 히크만 카테터 (Hickman catheter), 중심 정맥 카테터, 인공 심장 판막, 판막 그래프트, 정형외과 기기, 음경 보형물 등을 예로 들 수 있으며, 기타 다른 예들이 Costerton J et al 및 Costerton J and Steward (2001 Battling Biofilms, Scientific American pp 75-81)에 의한 논문에 기재되어 있고, 상기 논문은 원용에 의해 본 명세서에 포함된다. 기타, 생물막이 형성될 수 있는 위치로는, 치주농주 (gum disease) 및 강 (cavity)으로 진행될 수 있는 충치, 눈 감염으로 진행될 수 있는 콘택트 렌즈, 만성 감염이 될 수 있는 귀 및 폐렴이 될 수 있는 폐를 포함한다.
따라서, 상기 코팅제는 의료기기, 의료용 재료, 의료용 이식물, 건축 내장재, 생활용품, 산업용품, 전자제품, 의류, 인공장기에 이용될 수 있으나, 이에 제한되지 않고 칸디다 진균에 의한 오염 또는 감염될 가능성이 있는 곳이라면 사용가능하다.
이 중, 의료기기는 수술, 치료, 예방 등을 수행하기 위한 의료적 행위를 돕는 모든 기기를 의미하며, 예시적으로 혈관 스텐트, 인공 혈관, 인공 판막, 채혈기, 혈액 투석 장비 및 기기 및 전술한 카테터나 기기 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않고, 칸디다 진균에 의한 오염 또는 감염이 될 가능성이 있는 기기를 의미한다.
또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 건강기능식품을 제공한다.
본 발명에서 "건강기능식품"은 기능성 식품에 관한 법률 제6727호에 따른 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 및 가공한 식품을 의미하며, "기능성"이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건 용도에 유용한 효과를 얻을 목적으로 섭취하는 것을 의미한다.
본 발명의 건강기능식품은 칸디다증 감염 예방 또는 치료를 목적으로 이용될 수 있다. 본 발명의 리포테이코익산을 포함하는 조성물을 첨가물로 사용할 경우, 상기 리포테이코익산을 포함하는 조성물을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 상기물질을 첨가할 수 있는 식품의예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함한다.
본 발명에서 유효 성분의 혼합양은 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시에는 본 발명의 리포테이코익산을 포함하는 조성물은 원료에 대하여 1~20 중량%, 바람직하게는 5~10 중량%의 양으로 첨가된다. 그러나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다. 상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 발명의 음료 조성물은 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토스, 슈크로스와 같은 디사카라이드, 및 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 ㎖당 일반적으로 약 0.01~0.04 g, 바람직하게는 약 0.02~0.03 g이다. 그 외, 본 발명의 조성물은 여러가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 조성물은 천연 과일쥬스, 과일쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0.01~0.1 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
또한, 본 발명은, 상기 조성물을 포함하는 가축사료 첨가제를 제공한다.
본 발명에서 사료 첨가제로서 이용될 경우, 상기 조성물은 20 내지 90% 고농축액이거나 분말 또는 과립 형태로 제조될 수 있다. 상기 사료첨가제는 구연산, 후말산, 아디픽산, 젖산, 사과산등의 유기산이나 인산 나트륨, 인산 칼륨, 산성 피로인산염, 폴리인산염(중합인산염) 등의 인산염이나, 폴리페놀, 카테킨, 알파-토코페롤, 로즈마리 추출물, 비타민 C, 녹차 추출물, 감초 추출물, 키토산, 탄닌산, 피틴산 등의 천연 항산화제 중 어느 하나 또는 하나 이상을 추가로 포함할 수 있다. 사료로서 이용될 경우, 상기 조성물은 통상의 사료 형태로 제제화 될 수 있으며, 통상의 사료성분을 함께 포함할 수 있다.
본 발명에서 상기 사료첨가제 및 사료는 곡물, 예를 들면 분쇄 또는 파쇄된 밀, 귀리, 보리, 옥수수 및 쌀; 식물성 단백질 사료, 예를 들면 평지, 콩, 및 해바라기를 주성분으로 하는 사료; 동물성 단백질 사료, 예를 들면 혈분, 육분, 골분 및 생선분; 당분 및 유제품, 예를 들면 각종 분유 및 유장 분말로 이루어지는 건조성분 등을 더 포함할 수 있으며, 이외에도 영양보충제, 소화 및 흡수향상제, 성장촉진제 등을 더 포함할 수 있다.
본 발명에서 상기 사료첨가제는 동물에게 단독으로 투여하거나 식용 담체 중에서 다른 사료첨가제와 조합하여 투여할 수도 있다. 또한, 상기 사료첨가제는 탑드레싱으로서 또는 이들을 동물사료에 직접 혼합하거나 또는 사료와 별도의 경구제형으로 용이하게 동물에게 투여할 수 있다. 상기 사료첨가제를 동물사료와 별도로 투여할 경우, 당해 기술분야에 잘 알려진 바와 같이 약제학적으로 허용가능한 식용 담체와 조합하여, 즉시 방출 또는 서방성 제형으로 제조할 수 있다. 이러한 식용 담체는 고체 또는 액체, 예를 들어 옥수수전분, 락토오스, 수크로오스, 콩플레이크, 땅콩유, 올리브유, 참깨유 및 프로필렌글리콜일 수 있다. 고체 담체가 사용될 경우, 사료첨가제는 정제, 캡슐제, 산제, 트로키제 또는 함당정제 또는 미분산성 형태의 탑드레싱일 수 있다. 액체 담체가 사용될 경우, 사료첨가제는 젤라틴 연질 캡슐제, 또는 시럽제나 현탁액, 에멀젼제, 또는 용액제의 제형일 수 있다.
또한, 상기 사료첨가제 및 사료는 보조제, 예를 들어 보존제, 안정화제, 습윤제 또는 유화제, 용액촉진제 등을 함유할 수 있다. 상기 사료첨가제는 침주, 분무 또는 혼합하여 동물의 사료에 첨가하여 이용될 수 있다.
본 발명에서 사료 또는 사료첨가제는 포유류, 가금 및 어류를 포함하는 다수의 동물식이에 적용할 수 있다.
본 발명에서 동물은 포유류를 포함하고 포유류로서 돼지, 소, 양, 염소, 실험용 설치동물, 및 실험용 설치 동물뿐만 아니라, 애완동물(예: 개, 고양이) 등에게 사용할 수 있으며, 상기 가금류로서 닭, 칠면조, 오리, 거위, 꿩, 및 메추라기 등에도 사용할 수 있고, 상기 어류로서 송어 등에 이용될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 조성물을 포함하여 반려동물 간식, 구강용품, 위생용품 및 동물용 건강기능 식품으로 사용할 수 있으며, 전술한 예에 제한없이 반려동물 용품이라면 사용할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 식품 세정제를 제공한다.
본 발명에 따른 리포테이코익산을 포함하는 항진균용 조성물은 칸디다 진균의 부착력을 감소시켜 생체막 형성을 저해하고 진균 감염을 억제하는 효과를 나타내며, 생체친화적인 물질의 사용을 통해 인체 내에서 안전성이 높고 부작용을 줄일 수 있는 항진균제로서 칸디다 진균에 의한 감염 질병인 칸디다증의 효과적인 치료뿐만 아니라, 인체 내에 삽입된 의료기구를 통한 칸디다 감염 또한 제어할 수 있다.
도 1은 LreLTA에 의한 칸디다 알비칸스의 표면 부착력 감소 효과를 확인한 결과이다.
도 2는 LreLTA의 이미 부착되어 군집을 형성한 칸디다 알비칸스의 표면 부착력 감소 효과를 확인한 결과이다.
도 3은 여러 균으로부터 분리 정재한 LTA에 의한 칸디다 알비칸스의 표면 부착력 감소 효과를 확인한 결과이다.
도 4는 열충격단백질70 억제제와 LreLTA를 처리하여 칸디다 알비칸스의 표면 부착력 감소 효과를 확인한 결과이다.
도 5는 ex vivo 모델을 이용한 LreLTA를 처리하였을 때의 칸디다 알비칸스의 표면 부착력 감소 효과를 확인한 결과이다.
도 6은 in vivo 모델을 이용한 LreLTA를 처리하였을 때의 칸디다 알비칸스의 표면 부착력 감소 효과를 확인한 결과이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명의 구성 및 효과를 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 락토바실러스 루테리( Lactobacillus reuteri ) 로부터 리포테이코익산(lipoteichoic acid)을 분리 및 정제
L. reuteri로부터 리포테이코익산을 정제하기 위해 L. reuteri ATCC 23272 균주를 사용했다. L. reuteri를 de man, rogosa and sharpe broth (MRS broth) 에 접종하여 37℃에서 24시간 동안 배양한 뒤, 원심분리를 통해 균을 수확하였다. 수확한 균을 초음파 분쇄기로 균을 균질화시킨 뒤, 균질액을 유기용매인 부탄올에 녹이고 원심분리를 통해 지질층을 분리하였다. 이후 분리한 추출물을 소수성 상호작용 크로마토그래피와 음이온 교환 크로마토그래피를 순차적으로 사용하여 정제를 진행한 뒤, 정제물을 동결건조하여 최종 건조물을 얻었다.
실시예 2: L. reuteri LTA (LreLTA)에 의한 칸디다 알비칸스( Candida albicans )의 표면 부착력 감소 효과
LreLTA가 C. albicans 표면 부착력에 미치는 영향을 확인하기 위해 야생형 균주인 SC5314 균주를 사용했다. C. albicans를 Yeast Extract-Peptone-Dextrose (YPD) 배지에서 배양한 뒤, C. albicans를 1 x 104 CFU/ml로 준비하여 LreLTA를 3, 10, 30 μg/ml 씩 농도별로 처리하였다. 이후 37℃에서 24시간 동안 배양한 뒤 생물막 표면 부착 유지 정도를 0.1% 크리스탈바이올렛 염색을 통해 비교하였다. 실험 결과, 도 1A에 나타난 바와 같이, LreLTA가 C. albicans의 표면 부착력을 약화시키는 것을 확인하였다(도 1A).
추가적으로 야생형 균주 이외에 임상분리균주에서도 LreLTA가 같은 효과를 보이는지 확인하기 위해 C. albicans KCOM 3253, KCOM 3258과 NCCP 32701, NCCP 32702, NCCP 32703 균주를 YPD 배지에서 배양한 뒤, C. albicans를 1 x 107 CFU/ml로 준비하여 LreLTA를 30 μg/ml 단일 농도로 처리하였다. 이후 37℃에서 24시간 동안 배양한 뒤 생물막 표면부착 유지 정도를 0.1% 크리스탈바이올렛 염색을 통해 비교하였다. 실험 결과, LreLTA가 C. albicans의 임상 분리 균주들의 표면 부착력도 약화시키는 것을 확인하였다(도 1B~F).
실시예 3: LreLTA가 이미 부착되어 군집을 형성한 C. albicans 에 미치는 효과
LreLTA가 C. albicans의 부착력을 약화시키는 효능이 기형성된 C. albicans의 생물막에서도 동일하게 나타나는지 확인하기 위해, C. albicans SC5314 균주를 YPD 배지에서 배양한 뒤, 1 x 104 CFU/ml로 준비하여 37℃에서 24시간 동안 생물막을 형성시켰다. 이후 기형성된 생물막에 LreLTA를 3, 10, 30 μg/ml씩 농도별로 처리하고 24시간 동안 37℃에서 배양한 뒤 생물막 표면 부착 유지 정도를 0.1% 크리스탈바이올렛 염색을 통해 비교하였다. 실험 결과, LreLTA가 C. albicans의 기형성된 생물막에서도 표면 부착력의 감소 효과를 보이는 것을 확인하였다(도 2A).
추가적으로 임상분리균주에서도 LreLTA가 같은 효과를 보이는지 확인하기 위해 C. albicans KCOM 3253, KCOM 3258과 NCCP 32701, NCCP 32702, NCCP 32703 균주를 YPD 배지에서 배양한 뒤, 1 x 107 CFU/ml로 준비하여 37℃에서 24시간 동안 생물막을 형성시켰다. 이후 기형성된 생물막에 LreLTA를 30 μg/ml 단일 농도로 처리하고 24시간 동안 37℃에서 배양한 뒤 생물막 표면 부착 유지 정도를 0.1% 크리스탈바이올렛 염색을 통해 비교하였다. 실험 결과, LreLTA가 임상분리균주에서도 같은 효과를 보이는 것을 확인하였다(도 2B~F).
실시예 4: 여러 유산균과 그람양성균으로부터 분리 정제한 LTA에 의한 칸디다 알비칸스( C. albicans )의 표면 부착력 감소 효과
다른 여러 유산균과 그람양성균으로부터 분리 정제한 LTA가 C. albicans 표면 부착력에 미치는 영향을 확인하기 위해 야생형 균주인 SC5314 균주, 5 종류의 유산균과 3 종류의 그람양성균으로부터 분리 정제한 LTA를 사용하였다. C. albicans SC5314 균주를 YPD 배지에서 배양한 뒤, 세포 수를 1 x 104 CFU/ml로 준비하여 8 종류의 LTA를 30 μg/ml 의 단일 농도로 처리하였다. 이후 37℃에서 24시간 동안 배양한 뒤 생물막 표면 부착 유지 정도를 0.1% 크리스탈바이올렛 염색을 통해 비교하였다.
실험 결과, 도 3에 나타난 바와 같이, LaLTA를 제외한 7 종류의 LTA 모두 C. albicans의 표면 부착력을 약화시키는 것을 확인하였으며, 인체 유익균인 유산균으로부터 분리한 LTA 중 특히 LreLTA가 C. albicans의 표면 부착력을 효과적으로 약화시켰다(LaLTA : 락토바실러스 애시도필러스 리포테이코익산; LrLTA : 락토바실러스 람노서스GG 리포테이코익산;LpLTA : 락토바실러스 플란타럼; LcLTA : 락토바실러스 카제이 리포테이코익산; LreLTA : 락토바실러스 루테리 리포테이코익산; EfLTA : 엔테로코커스 페칼리스 리포테이코익산; SmLTA : 스트렙토코커스 뮤탄스 리포테이코익산; BsLTA : 바실러스 서브틸리스 리포테이코익산).
실시예 5: 열충격단백질70 억제제 VER-155008을 통한 LreLTA의 효능 검증
기존 연구에 따르면, Hsp70은 C. albicans의 전반적인 독성인자 조절과 약물 저항성 조절의 역할을 담당하고 있다고 알려져 있어 본 발명자들은 Hsp70 억제제인 VER-155008을 활용해 실험을 진행하였다.
VER-155008이 LreLTA의 C. albicans 표면 부착력 감소 효과에 미치는 영향을 확인하기 위해 C. albicans SC5314 균주를 YPD 배지에서 배양한 뒤, 1 x 104 CFU/ml로 준비하여 LreLTA를 30 μg/ml 단일 농도로, VER-155008을 1, 10, 50, 100 μM 농도별로 동시처리하였다. 이후 24시간 동안 배양한 뒤 생물막 표면 부착 유지 정도를 0.1% 크리스탈바이올렛 염색을 통해 비교하였다.
실험 결과, 도 4에 나타난 바와 같이, VER-155008을 고농도로 처리할수록 LreLTA의 표면 부착력 감소 효능이 줄어드는 것을 확인할 수 있었으며 결과적으로 리포테이코익산이 칸디다 알비칸스의 Hsp70과 상호작용하여 부착력과 응집력 약화 효과를 보이는 것을 확인하였다.
실시예 6: ex vivo 모델을 통한 LreLTA의 C.albicans 부착력 감소 효과 검증
LreLTA의 C. albicans 표면 부착력 약화 효과가 생체조직에서도 동일한 현상을 보이는지, 콜로니형성단위(CFU)를 확인하기 위해 C. albicans SC5314 균주를 사용하였다. ex vivo 모델을 위한 실험동물로 C57BL/6 계통의 야생성 마우스를 두열바이오텍으로부터 구입하여 사용하였고 동물실험은 실험동물 연구 윤리규정을 철저히 준수하여 수행하였다. 마우스를 안락사 시킨 후, 혀를 적출하였다. 적출한 혀는 YPD 배지에서 배양한 C. albicans SC5314 균주 1 x 107 CFU/ml 와 함께 LreLTA를 30 μg/ml 단일 농도로 동시처리하여 1시간 동안 37℃에서 배양한 뒤, 새로운 배지에 옮겨 담은 후 24시간 동안 37℃에서 배양하였다. 이후 균과 함께 배양한 혀 조직을 균질기(homogenizer)를 이용하여 균질화한 뒤, Agar 배지에 접종하여 콜로니형성단위(Colony Forming Unit) 정도를 비교하였다.
실험 결과, 도 5에 나타난 바와 같이, LreLTA를 처리한 혀 조직은 대조군인 주사용수를 처리한 혀 조직에 비해 C. albicans의 CFU 값이 통계학적으로 유의성 있게 감소하였다. 이를 통해 LreLTA가 생체조직에서도 C. albicans의 부착력을 약화시킬 수 있음을 확인하였다.
실시예 7: in vivo 모델을 통한 LreLTA의 C. albicans 부착력 감소 효과 검증
LreLTA의 C. albicans 표면 부착력 약화 효과가 동물 질환 모델에서도 동일한 현상을 보이는지 확인하기 위해 마우스 구강 칸디다증 모델을 사용하였다. in vivo 모델을 위한 실험동물로 C57BL/6 계통의 야생형 마우스를 두열바이오텍으로부터 구입하여 사용하였고 동물실험은 실험동물 연구 윤리규정을 철저히 준수하여 수행하였다. 마우스 구강의 설하에 YPD 배지에서 배양한 C. albicans SC5314 균주 1 x 107 CFU/ml 가 포함된 면봉을 삽입하여 감염을 진행시키고 LreLTA를 50 μg/ml 단일 농도로 동시처리하였다. 이후 매일 주사용수(대조군) 또는 LreLTA(실험군)을 마우스의 구강에 투여하였다. 5일 동안 칸디다증을 발달시킨 후, 마우스를 안락사 시키고 혀 조직을 적출하여 균질기(homogenizer)를 이용해 균질화한 뒤, Agar 배지에 접종하여 콜로니형성단위(Colony Forming Unit) 정도를 비교하였다.
실험 결과, LreLTA를 처리한 마우스의 혀 조직은 대조군인 주사용수를 처리한 혀 조직에 비해 C. albicans의 CFU 값이 통계학적으로 유의성 있게 감소하였으며, 이를 통해 LreLTA가 마우스 구강 칸디다증 질환 모델에서 효과적으로 C. albicans의 감염을 저해시킬 수 있음을 확인하였다(도 6A).
추가적으로 마우스 칸디다 질염 모델에서도 LreLTA가 같은 효과를 보이는지 확인하기 위해 C. albicans SC5314 균주를 YPD 배지에서 배양한 뒤, 세포 수를 1 x 107 CFU/ml로 준비하여 마우스의 질 내부에 주입한 뒤, LreLTA를 50 μg/ml 단일 농도로 동시처리하였다. 이후 매일 주사용수(대조군) 또는 LreLTA(실험군)을 마우스의 질 내에 주입하였다. 7일 동안 칸디다 질염을 발달시킨 후, 마우스를 안락사 시키고 질 조직을 적출하여 균질기(homogenizer)를 이용해 균질화한 뒤, Agar 배지에 접종하여 콜로니형성단위(Colony Forming Unit) 정도를 비교하였다.
실험 결과, LreLTA를 처리한 마우스의 질 조직은 대조군인 주사용수를 처리한 질 조직에 비해 C. albicans의 CFU 값이 통계학적으로 유의성 있게 감소하였으며, 이를 통해 LreLTA가 마우스 칸디다 질염 질환 모델에서 C. albicans의 부착력을 약화시키고 효과적으로 감염을 저해시킬 수 있음을 확인하였다(도 6B).

Claims (13)

  1. i) 리포테이코익산 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염; 또는
    ii) 리포테이코익산을 포함하는 세포벽 추출물을 포함하는 칸디다(Candida) 항진균용 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 리포테이코익산 또는 리포테이코익산을 포함하는 세포벽 추출물은 그람양성균으로부터 유래한, 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 리포테이코익산 또는 리포테이코익산을 포함하는 세포벽 추출물은 락토바실러스 루테리(Lactobacillus reuteri), 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus), 락토바실러스 람노서스GG(Lactobacillus rhamnosus GG), 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum), 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei), 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei), 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum), 락토바실러스 불가리쿠스(Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus), 락토바실러스 헬베티쿠스 (Lactobacillus helveticus), 락토바실러스 퍼멘툼 (Lactobacillus fermentum), 락토바실러스 살리바리우스(Lactobacillus salilvarius), 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis), 엔테로코커스 페칼리스(Enterococcus faecalis), 엔테로코커스 패시움(Enterococcus faecium), 스트렙토코커스 써모필러스(Streptococcus thermophilus), 비피도박테리움 비피덤(Bifidobacterium bifidum), 비피도박테리움 브리브(Bifidobacterium breve), 비피도박테리움 롱굼(Bifidobacterium longum), 비피도박테리움 아니말리스 락티스(Bifidobacterium animalis subsp. Lactis) 및 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 1종으로부터 유래한, 조성물.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 세포벽 추출물은 물, C1 내지 C4의 저급 알코올 또는 이들의 혼합물을 용매로 하여 추출되는 것을 특징으로 하는, 조성물.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 칸디다는 칸디다 알비칸스(Candida albicans), 칸디다 트로피칼리스(Candida tropicalis), 칸디다 수도트로피칼리스(Candida pseudotropicalis), 칸디다 크루세이(Candida krusei), 칸디다 글라브라타(Candida glabrata) 및 이들의 혼합을 포함하는 군에서 선택된 균류(fungi)인, 조성물.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 칸디다 진균의 표면 부착력을 감소시키는, 조성물.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는 칸디다증 감염 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 칸디다증은 외음부염, 질염, 식도염, 손발톱 주위 염, 구인두염, 소화관 칸디다증, 점막 칸디다증, 피부 칸디다증, 칸디다 진균혈증, 칸디다 내안구염, 칸디다 복막염, 칸디다 골관절염, 칸디다 척추염 및 간비장 칸디다증으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 1종 이상인, 칸디다증 감염 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  9. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는 코팅제.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 코팅제는 의료기기, 의료용 재료, 의료용 이식물, 건축 내장재, 생활용품, 산업용품, 전자제품, 의류, 인공장기에 이용되는, 코팅제.
  11. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는 건강기능식품.
  12. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는 가축사료 첨가제.
  13. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는 식품 세정제.
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