WO2024071720A1 - 리포테이코익산을 포함하는 치주염 예방 또는 치료용 약학적 조성물 - Google Patents

리포테이코익산을 포함하는 치주염 예방 또는 치료용 약학적 조성물 Download PDF

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porphyromonas gingivalis
lipoteichoic acid
lactobacillus
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PCT/KR2023/013359
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한승현
이동욱
박동현
임진택
박소민
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서울대학교산학협력단
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Definitions

  • the present invention relates to a pharmaceutical composition for preventing or treating periodontitis and an anti-inflammatory composition containing lipoteichoic acid.
  • Oral harmful bacteria aggregate with various harmful bacteria depending on the environment to form a biofilm, and develop resistance to antibiotics through the formed biofilm. After being separated from the biofilm, it causes infiltrating infection into various tissues in the human body and is closely related to causing various systemic diseases. In this way, biofilms of oral harmful bacteria play an important role in the occurrence and worsening of diseases caused by infection.
  • Periodontal disease is mainly caused by bacteria in the oral cavity.
  • Early gum disease is known as gingivitis, in which gum inflammation occurs only in soft tissue. As gum disease progresses, it develops into periodontitis, in which even the alveolar bone is lost. am.
  • periodontal disease caused by harmful oral bacteria was found to affect one in four people in Korea, and in 2016, the number of periodontal disease patients exceeded 10 million.
  • Porphyromonas gingivalis a representative strain that causes periodontal disease, is a bacterium mainly found in patients suffering from periodontal disease. It lives in the periodontal pockets between teeth and gums and consumes the sugars and proteins of plaque. As it survives by breaking down, it secretes enzymes that break down the collagen that makes up gum tissue, which can weaken the gums. Additionally, it has the ability to invade oral epithelial cells and can cause periodontitis by invading the epithelial cells. In addition, it is known to be a causative bacteria related to Alzheimer's, rheumatism, and cancer, so it has a high correlation with various diseases.
  • lipoteichoic acid is a substance that is one of the main components of the cell wall derived from Gram-positive bacteria. It plays a role in bacterial growth and adhesion, biofilm formation, and host immune system activation.
  • the present inventors isolated and purified lipoteichoic acid with high purity from Lactobacillus , known as a representative lactic acid bacterium, and found that lipoteichoic acid alone can effectively inhibit arginine gingipain, an essential virulence factor in causing periodontitis.
  • the present invention was completed by identifying the mechanism of action that can alleviate infection and periodontitis by interacting with the fimbria protein involved in adhesion and inhibiting adhesion.
  • the purpose of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for preventing or treating periodontitis containing lipoteichoic acid or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • an object of the present invention is to provide an anti-inflammatory composition containing lipoteichoic acid or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • Another object of the present invention is to provide a treatment for oral diseases, a food detergent, a health functional food, and a livestock feed additive containing the composition.
  • the present inventors studied whether lipoteichoic acid could reduce the surface adhesion of periodontitis-causing bacteria. As a result, it was confirmed that lipoteichoic acid directly interacts with the strain that causes periodontitis, and that it interacts with the fimbria protein (FimA) of Porphyromonas gingivalis to inhibit surface adhesion, thereby increasing infectiousness. It was confirmed through a mutant strain with a defect in the FimA gene that it is a very useful substance for reducing .
  • FimA fimbria protein
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating periodontitis containing lipoteichoic acid or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • the term “lipoteichoic acid” has the same meaning as “lipoteichoic acid” and “LTA” and can be used interchangeably.
  • prevention refers to all actions that suppress or delay the onset of periodontitis by administration of the pharmaceutical composition of the present invention
  • treatment refers to periodontitis already caused by administration of the pharmaceutical composition of the present invention. It means any action that improves or benefits symptoms.
  • the pharmaceutical composition for preventing or treating periodontitis containing lipoteichoic acid or a pharmaceutically acceptable salt thereof of the present invention may additionally include an appropriate carrier, excipient, or diluent according to a conventional method.
  • Carriers, excipients and diluents that may be included in pharmaceutical compositions containing the compound include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, gum acacia, alginate, gelatin, calcium phosphate, Examples include, but are not limited to, calcium silicate, cellulose, methyl cellulose, microcrystalline cellulose, polyvinyl pyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate, and mineral oil.
  • the pharmaceutical composition for preventing or treating periodontitis containing lipoteichoic acid or a pharmaceutically acceptable salt thereof of the present invention can be prepared as powder, pill, granule, capsule, suspension, oral solution, emulsion, syrup, etc. according to conventional methods. It may be formulated in any one dosage form selected from the group consisting of sterilized aqueous solution, non-aqueous solution, suspension, freeze-dried agent, and suppository. When formulated, it can be manufactured using diluents or excipients such as commonly used fillers, extenders, binders, wetting agents, disintegrants, and surfactants. Suitable agents known in the art are preferably those disclosed in the literature (Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton PA).
  • the pharmaceutical composition of the present invention is administered in a pharmaceutically effective amount.
  • pharmaceutically effective amount refers to an amount sufficient to exhibit a preventive or therapeutic effect on periodontitis and an amount sufficient to not cause side effects or a serious or excessive immune response, and the effective dose level is the amount sufficient to produce a preventive or therapeutic effect on periodontitis.
  • administration means introducing a predetermined substance into a patient by any appropriate method, and is formulated for human or veterinary use and administered through various routes.
  • the composition of the present invention can be administered by parenteral routes, such as intravascular, intravenous, intraarterial, intramuscular or subcutaneous, and can also be administered by oral, nasal, rectal, transdermal or inhalation routes via aerosol. , it can be administered as a bolus or infused slowly.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be administered as an individual therapeutic agent or in combination with other therapeutic agents, and may be administered sequentially or simultaneously with conventional therapeutic agents. And it can be administered single or multiple times. Considering all of the above factors, it is important to administer an amount that can achieve maximum effect with the minimum amount without side effects, and can be easily determined by a person skilled in the art.
  • the preferred dosage of the pharmaceutical composition according to the present invention varies depending on the patient's condition and weight, degree of disease, drug form, administration route and period, but can be appropriately selected by a person skilled in the art. However, for a desirable effect, it is recommended to administer 0.01 mg/kg to 10 g/kg per day, preferably 1 mg/kg to 1 g/kg. Administration may be administered once a day, or may be administered in several divided doses. Accordingly, the above dosage does not limit the scope of the present invention in any way.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may contain one or more known active ingredients that have effects in preventing and treating periodontitis along with a composition containing lipoteichoic acid or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be used in prescription drugs, hygiene products, food and livestock feed additives, etc. to prevent or treat periodontitis.
  • the present invention provides a method for preventing or treating periodontitis, comprising administering the pharmaceutical composition to an individual other than a human who is expected to develop periodontitis or has developed periodontitis.
  • the term “individual” of the present invention refers to a living organism capable of developing periodontitis, preferably a higher vertebrate capable of showing symptoms of periodontitis, more preferably a cow capable of developing periodontitis, It can be livestock such as pigs, sheep, goats, dogs, etc., as well as people who can become infected from them.
  • the pharmaceutical composition of the present invention When the pharmaceutical composition of the present invention is administered to the subject, it can have the effect of preventing or treating periodontitis by enhancing the subject's immunity against strains that cause periodontitis.
  • the subject of administration of this pharmaceutical composition may primarily be livestock such as cattle, pigs, sheep, goats, and dogs, but is not limited thereto, and can also be used for the prevention or treatment of humans who may be infected with periodontitis by the livestock. You can.
  • the lipoteichoic acid contained in the pharmaceutical composition of the present invention may be derived from various gram-positive bacteria, including lactic acid bacteria, which are safe beneficial bacteria that are not harmful to the human body, and are biocompatible substances, for example , Lactobacillus rhamnosus. ), Lactobacillus plantarum, Lactobacillus casei, Lactobacillus acidophilus , and Lactobacillus reuteri. At least one species selected from the group consisting of It may be isolated, and is preferably selected from the group consisting of Lactobacillus rhamnosus , Lactobacillus plantarum, Lactobacillus casei, and Lactobacillus reuteri. It may be isolated from one or more species, but is not limited thereto.
  • the bacteria that cause the periodontitis are Porphyromonas gingivalis, Campylobacter gracilis, Prevotella nigrescens , and Aggregatibacter actinomycetemcomitans. ) and Parvimonas micra. It may be any one or more species selected from the group consisting of. In a specific embodiment of the present invention, it was confirmed that not only Gram-positive bacteria but also Gram-negative bacteria can be targeted (see FIG. 7).
  • periodontal disease pathogenic bacteria are also known to cause various systemic diseases such as Alzheimer's disease and cancer, so they can be used for the purpose of preventing and treating various infectious diseases through the effects described above.
  • lipoteichoic acid can target the ciliary protein FimA.
  • FimA fimbria protein
  • a new signaling system that reduces inflammatory response was discovered (see Figure 4).
  • lipoteichoic acid alleviates periodontitis worsened by Porphyromonas gingivalis in in vivo and in vitro models, and also has the effect of reducing adhesion to the base surface. Confirmed.
  • the present invention also provides an anti-inflammatory composition containing lipoteichoic acid or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • the lipoteichoic acid included in the anti-inflammatory composition of the present invention may be derived from various gram-positive bacteria including lactic acid bacteria, examples of which include Lactobacillus rhamnosus and Lactobacillus plantarum . , Lactobacillus casei, Lactobacillus acidophilus , and Lactobacillus reuteri , preferably Lactobacillus rhamnosus , Lactobacillus plus. It may be isolated from Lactobacillus plantarum , Lactobacillus casei, and Lactobacillus reuteri , but is not limited thereto.
  • the inflammation may be caused by Porphyromonas gingivalis .
  • periodontitis caused by Porphyromonas gingivalis is caused by a chronic inflammatory response, and it was confirmed that the activity of gingipain, which controls the response, is inhibited, and Porphyromonas gingivalis
  • pro-inflammatory cytokines when treated with lipoteichoic acid, IL-6, IL-8, and IL corresponding to pro-inflammatory cytokines It was confirmed that the RNA expression level of -1 ⁇ was lowered (see Figure 3).
  • the composition may alleviate the inflammatory response by inhibiting the decomposition of MCPIP-1.
  • composition containing lipoteichoic acid of the present invention can be used in a wide range of industrial fields, such as a substitute for periodontal disease treatment, oral cleaner, ointment, toothpaste, and oral dissolving film.
  • the present invention provides a therapeutic agent for oral diseases comprising the composition.
  • the oral disease treatment agent may include all types and formulations, including those in the form of medical devices that can be used for oral treatment or oral hygiene, and is preferably oral rinse, oral spray, oral ointment, It may be any one selected from the group consisting of oral patches, oral artificial tooth coatings, dental floss, and toothpaste.
  • the binder may be garagenine, various cellulose derivatives for thickening, xanthan gum, gums such as tragacanth gum, polyvinyl alcohol, sodium polyacrylate, polyacrylic acid/ Organic binders such as synthetic polymer derivatives such as maleic acid copolymers and carboxyvinyl polymers and inorganic binders such as silica and laponite can be used alone or in combination.
  • the oral disease treatment may additionally include sorbitol, glycerin, ethylene glycol, propylene glycol, polyether glycol, polypropylene glycol, etc. as moisturizers during its manufacture.
  • the oral disease treatment agent may additionally include flavoring agents or sweeteners.
  • the sweetener may be sucrose, lactose, maltose, sorbitol, xylitol, sodium cyclamate, glycerin, sodium saccharin, stevioside, aspartame, etc.
  • the flavoring agent may be peppermint, menthol, anethole, eugenol, It may be limonene, citronol, alpha-terpineol, salicylmethyl, cineol, linalol, ethyllinalol, vanillin, thymol, spearmint oil, sage oil, rosemary oil, cinnamon oil, etc., and the sweetener or flavoring agent may be used alone. It can be used alone or in combination.
  • the oral disease treatment agent may contain surfactants used as foaming ingredients or additional effective ingredients singly or in combination.
  • the surfactant used as the foaming ingredient may be any one selected from the group consisting of anionic surfactants, nonionic surfactants, and cationic surfactants.
  • the oral disease treatment agent can also be used as an oral hygiene product containing it
  • hygiene products include oral cleaning products such as gargles, Listerine, oral dissolving films, toothpaste, oral hygiene products, soap, hand soap, vaginal cleanser additives, When added as an active ingredient to sanitary products such as skin cleanser compositions such as body cleansers, kitchenware detergent compositions for cleaning dishes, sinks, cutting boards, etc., and cosmetic compositions such as essences and creams, in addition to the original function of each sanitary product, periodontitis It can perform preventive or therapeutic functions.
  • oral cleaning products such as gargles, Listerine, oral dissolving films, toothpaste, oral hygiene products, soap, hand soap, vaginal cleanser additives
  • sanitary products such as skin cleanser compositions such as body cleansers, kitchenware detergent compositions for cleaning dishes, sinks, cutting boards, etc.
  • cosmetic compositions such as essences and creams
  • the present invention also provides a food detergent comprising the composition.
  • the food detergent is a natural ingredient and is not harmful to the human body, it can be used for the purpose of cleaning various foods, including food washing, or providing antibacterial properties.
  • the food detergent may further contain selected additives depending on its purpose and use, and may be mixed with other active ingredients such as commonly used detergents or additives such as pigments, surfactants, and preservatives.
  • the food detergent can be manufactured by powdering, granulating, tableting or liquefying depending on its purpose and purpose, and conventional methods can be used for packaging for commercialization.
  • the food detergent may include an antibacterial composition, and the amount of the antibacterial composition used may be appropriate depending on the purpose of use, application type, application area, application target, etc.
  • Health functional food refers to food manufactured and processed using raw materials or ingredients with functionality useful to the human body in accordance with Act No. 6727 on Functional Food, and “functional” refers to the structure and function of the human body. It means taking it for the purpose of controlling nutrients or obtaining useful health effects such as physiological effects.
  • the health functional food of the present invention can be used for the purpose of preventing or treating periodontitis.
  • the composition containing lipoteichoic acid or a pharmaceutically acceptable salt thereof of the present invention may be added as is or used together with other foods or food ingredients, and may be used as an additive. It can be used appropriately according to the method.
  • foods to which the above substances can be added include meat, processed meat, bread, chocolate, candy, snacks, confectionery, pizza, ramen, other noodles, gum, dairy products including ice cream, various soups, beverages, tea, and drink additives. , alcoholic beverages and vitamin complexes, and includes all health foods in the conventional sense.
  • the mixing amount of the active ingredient can be appropriately determined depending on the purpose of use (prevention, health, or therapeutic treatment).
  • the composition containing lipoteichoic acid of the present invention is added in an amount of 1 to 20% by weight, preferably 5 to 10% by weight, based on the raw materials.
  • the amount may be below the above range, and since there is no problem in terms of safety, the active ingredient may be used in an amount above the above range.
  • the beverage composition of the invention may contain various flavoring agents or natural carbohydrates as additional ingredients like conventional beverages.
  • the above-mentioned natural carbohydrates include monosaccharides such as glucose and fructose, disaccharides such as maltose and sucrose, polysaccharides such as dextrin and cyclodextrin, and sugar alcohols such as xylitol, sorbitol, and erythritol.
  • a sweetener natural sweeteners such as thaumatin and stevia extract or synthetic sweeteners such as saccharin and aspartame can be used.
  • the ratio of the natural carbohydrate is generally about 0.01 to 0.04 g, preferably about 0.02 to 0.03 g, per 100 ml of the composition of the present invention.
  • composition of the present invention contains various nutrients, vitamins, electrolytes, flavors, colorants, pectic acid and its salts, alginic acid and its salts, organic acids, protective colloidal thickeners, pH adjusters, stabilizers, preservatives, glycerin, alcohol, It may contain carbonating agents used in carbonated drinks.
  • composition of the present invention may contain pulp for the production of natural fruit juice, fruit juice drinks, and vegetable drinks. These ingredients can be used independently or in combination. The ratio of these additives is not very important, but is generally selected in the range of 0.01 to 0.1 parts by weight per 100 parts by weight of the composition of the present invention.
  • the present invention also provides a livestock feed additive containing the composition.
  • the composition When used as a feed additive, the composition may be a highly concentrated solution of 20 to 90% or may be prepared in powder or granule form.
  • the feed additives include organic acids such as citric acid, malic acid, adipic acid, lactic acid, and malic acid, phosphates such as sodium phosphate, potassium phosphate, acid pyrophosphate, and polyphosphate (polymerized phosphate), polyphenol, catechin, alpha-tocopherol, and rosemary. It may additionally contain one or more of natural antioxidants such as extract, vitamin C, green tea extract, licorice extract, chitosan, tannic acid, and phytic acid.
  • the composition When used as feed, the composition may be formulated in the form of a normal feed and may include common feed ingredients.
  • the feed additives and feeds include grains such as ground or crushed wheat, oats, barley, corn and rice; Vegetable protein feeds, such as those based on rape, soybean, and sunflower; Animal protein feeds such as blood meal, meat meal, bone meal and fish meal; It may further include dry ingredients such as sugar and dairy products, such as various powdered milk and whey powder, and may further include nutritional supplements, digestion and absorption enhancers, growth promoters, etc.
  • the feed additive may be administered to animals alone or in combination with other feed additives in an edible carrier. Additionally, the feed additives can be easily administered to animals as top dressing, by mixing them directly into animal feed, or in an oral dosage form separate from the feed. When the feed additive is administered separately from animal feed, it can be prepared into an immediate-release or sustained-release formulation by combining it with a pharmaceutically acceptable edible carrier, as is well known in the art.
  • a pharmaceutically acceptable edible carrier may be solid or liquid, such as corn starch, lactose, sucrose, soy flakes, peanut oil, olive oil, sesame oil and propylene glycol.
  • the feed additive may be a tablet, capsule, powder, troche or sugar-containing tablet, or a top dressing in microdisperse form.
  • the feed additive may be in the form of gelatin soft capsules, syrup, suspension, emulsion, or solution.
  • the feed additives and feeds may contain auxiliaries such as preservatives, stabilizers, wetting or emulsifying agents, solution accelerators, etc.
  • the feed additive can be used by adding it to animal feed by injecting, spraying, or mixing it.
  • the feed or feed additive of the present invention can be applied to a number of animal diets, including mammals, poultry, and fish.
  • animals include mammals, and as mammals, pigs, cows, sheep, goats, laboratory rodents, and laboratory rodents can be used, as well as pets (e.g., dogs, cats), and the poultry can be chickens. , turkey, duck, goose, pheasant, and quail, etc., and can be used for trout, etc. as the fish, but is not limited to this.
  • composition of the present invention can be used as pet snacks, oral care products, hygiene products, and health functional foods for animals, and can be used as any pet product without limitation to the above-mentioned examples.
  • Lipoteicoic acid according to the present invention suppresses periodontitis and inflammation caused by not only gram-positive bacteria but also gram-negative bacteria, and can be effectively used for the prevention or treatment of periodontitis. It reduces the bio-adhesion of bacteria that cause periodontitis, suppresses biofilm formation and inhibits infection. Through the use of biocompatible materials, safety in the human body is high and side effects can be reduced.
  • Figures 1A and 1B are the results of verifying the reduction of Porphyromonas gingivalis adhesion and treatment effect of lipoteichoic acid (hereinafter "LreLTA”) isolated and purified from Lactobacillus reuteri through an in vivo model.
  • LreLTA lipoteichoic acid
  • Figure 2 shows the results of verification of the efficacy of LreLTA in reducing surface adhesion of Porphyromonas gingivalis .
  • (a) is the result of FACS analysis of the level of adhesion of lipoteichoic acid to Porphyromonas gingivalis
  • (b) is the result of concentration gradient confirmation that it weakens the surface adhesion of Porphyromonas gingivalis
  • (c) confirmed the concentration gradient to weaken the surface adhesion of the base-attached Porphyromonas gingivalis
  • (di) confirmed its effectiveness in weakening the adhesion of Porphyromonas gingivalis isolated from an actual periodontitis patient. It is a result.
  • Figures 3A to 3C are verification results showing the efficacy of LreLTA in alleviating inflammatory response by blocking the activity of arginine-specific gingipain, a virulence factor of Porphyromonas gingivalis.
  • Figures 4a to 4d show the results of verifying the association between fimbria proteins and LreLTA on adhesion using fimbria mutant Porphyromonas gingivalis strains.
  • Figure 5 shows the results of a comparative analysis of the effect of reducing surface adhesion of Porphyromonas gingivalis by LTA isolated and purified from various lactic acid bacteria.
  • FIGS 6a and 6b show that when each functional group was deleted from lipoteichoic acid (hereinafter "LpLTA”) isolated and purified from LreLTA and Lactobacillus plantarum, Porphyromonas gingivalis and Staphylococcus aureus spa This is the result of verifying the effect of reducing adhesion in each Staphylococcus aureus .
  • LpLTA lipoteichoic acid
  • Figure 7 shows the results of verifying the effect of LreLTA on reducing adhesion to other periodontitis disease-causing bacteria residing in the oral cavity.
  • Campylobacter gracilis (b) Prevotella nigrescens , (c) Aggregatibacter actinomycetemcomitans , (d) Falvimonas micra This is the result of confirming the adhesion inhibition effect of LreLTA on ( Parvimonas micra ).
  • Figure 8 shows the results of verification of the effect of LreLTA on reducing adhesion to Gram-negative bacteria residing in other organs.
  • Pathogenic Gram-negative bacteria residing in the lungs and intestines (a) Escherichia coli and (b) Pseudomonas aeruginosa were identified.
  • L. acidophilus KACC 12419 L. casei KCTC 3260, L. rhamnosus GG, L. plantarum KCTC10887bp, and L. reuteri ATCC 23272 were used.
  • Each strain was inoculated into de man, rogosa and sharpe broth (MRS broth), cultured at 37°C for 48 hours, and then harvested by centrifugation.
  • the harvested bacteria were homogenized using an ultrasonic pulverizer, and the homogenate was mixed in the same ratio with butanol, an organic solvent, and then centrifuged to separate the lipid layer.
  • the isolated extract was sequentially purified using hydrophobic interaction chromatography and anion exchange chromatography to secure high-purity lipoteichoic acid, and then all organic solvents were removed through dialysis.
  • the obtained purified product was freeze-dried to obtain the final dried product.
  • Porphyromonas gingivalis strain was used, and the C57BL/6 strain was used as an experimental animal for the in vivo model. Wild-type mice were purchased and used from Duyeol Biotech, and animal experiments were performed in strict compliance with the ethical regulations for laboratory animal research.
  • the group was divided into a total of 5 groups, one group receiving no administration or ligation (control group), and one group receiving nothing.
  • One group was administered 50 ⁇ g of LreLTA alone at the ligation site for 7 days (tooth ligation + lipoteichoic acid), and one group was administered Brain-Heart infusion at the ligation site.
  • Periodontitis was aggravated by injecting 1 , positive control group), and the last remaining group was administered Porphyromonas gingivalis to the ligation site every other day for 3 days under the same conditions as above, and at the same time, 50 ⁇ g of LreLTA was administered alone for 7 days (tooth ligation + foreskin) Monas gingivalis + lipoteichoic acid).
  • Tooth ligation (negative control group) Ligation without administering anything. Tooth ligation + lipoteichoic acid 50 ⁇ g of LreLTA was administered alone to the ligation site for 7 days. Tooth ligation + Porphyromonas gingivalis, (positive control) Periodontitis is aggravated by injecting 1 Tooth ligation + Porphyromonas gingivalis + lipoteichoic acid Porphyromonas gingivalis was administered to the ligation site every other day for 3 days under the same conditions as above, and 50 ⁇ g of LreLTA was administered alone for 7 days.
  • the maxilla was separated to secure the molars, and the degree of bone destruction was compared through Micro-CT analysis.
  • the cementum and enamel of the teeth were examined after Micro-CT analysis. This was confirmed by measuring the distance between the alveolar bones at the boundary (CEJ-ABC) and checking the degree of gap between the teeth and gums.
  • Porphyromonas gingivalis After culturing Porphyromonas gingivalis in BHI medium supplemented with hemin and menadione, Porphyromonas gingivalis was prepared at 1 x 109 CFU/ml and LreLTA was added at 3, 10, and 30 ⁇ g/ml, respectively. Processed according to concentration. After culturing at 37°C in anaerobic conditions for 72 hours, the degree of surface adhesion maintained was compared through 0.1% crystal violet staining.
  • Porphyromonas gingivalis KCOM 2796, KCOM 2797, KCOM 2799, KCOM 3001, KCOM 3190, and KCOM 3153 strains were cultured in BHI medium supplied with hemin and menadione, and Porphyromonas gingivalis was prepared at 1 x 10 9 CFU/ml. LreLTA was treated at a single concentration of 30 ⁇ g/ml. After culturing at 37°C in anaerobic conditions for 72 hours, the degree of surface adhesion maintenance was compared through 0.1% crystal violet staining.
  • the cause of periodontitis disease caused by Porphyromonas gingivalis is a chronic inflammatory response. This is caused by arginine-specific gingipain, a virulence factor that induces cell surface adhesion and maturation of cell surface adhesion factors and decomposes MCPIP-1, an immune regulatory factor that suppresses excessive immune responses.
  • Porphyromonas gingivalis was added to YD-38 cells (5 x 10 5 cells/ml), which are oral epidermal cells.
  • YD-38 cells 5 x 10 5 cells/ml
  • FimA a fimbria protein
  • LTA isolated and purified from various other lactic acid bacteria was used.
  • Porphyromonas gingivalis strain was cultured in BHI medium supplemented with hemin and menadione, the number of cells was prepared at 1 x 109 CFU/ml, and five types of LTA were added at 30 ⁇ g/ml. Treated at a single concentration of ml. After culturing for 72 hours at 37°C under anaerobic conditions, the degree of surface adhesion maintained was compared through 0.1% crystal violet staining.
  • LaLTA Lactobacillus acidophilus lipoteichoic acid
  • LrLTA Lactobacillus rhamnosus lipoteichoic acid
  • LpLTA Lactobacillus plantarum
  • LcLTA Lactobacillus casei lipoteichoic acid
  • LreLTA Lactobacillus reuteri lipoteichoic acid
  • the lack of functional groups in LTA to be used in the experiment was confirmed using a 1% ninhydrin solution to detect amino acids and a 5% phosphomolybdic acid solution to detect lipids.
  • the Porphyromonas gingivalis strain was cultured in BHI medium supplied with hemin and menadione, and the number of cells was prepared at 1 x 109 CFU/ml to determine whether the functional group was missing or not.
  • LTA was treated at a single concentration of 30 ⁇ g/ml. After culturing for 72 hours at 37°C under anaerobic conditions, the degree of surface adhesion was confirmed through 0.1% crystal violet staining.
  • LTA lacking functional groups for Staphylococcus aureus RN4220 a Staphylococcus aureus used in existing reports
  • the number of cells in Luria-Bertani (LB) medium was 1.
  • x 10 9 CFU/ml was prepared and LTA lacking or not lacking functional groups was treated at a single concentration of 30 ⁇ g/ml.
  • the degree of surface adhesion maintained was compared through 0.1% crystal violet staining.
  • the mechanism that causes periodontitis in the oral cavity is generally caused by gram-negative bacteria, and not only Porphyromonas gingivalis but also various gram-negative bacteria are closely related to periodontitis. Therefore, the effect of Lactobacillus LTA on other Gram-negative bacteria that cause periodontitis was further confirmed.
  • LTA was performed on the Gram-negative bacteria associated with periodontitis: Campylobacter gracilis, Prevotella nigrescens , and Aggregatibacter actinomycetemcomitans. After treatment with a single concentration of 30 ⁇ g/ml and culturing at 37°C under anaerobic conditions, the degree of surface adhesion maintenance was compared through 0.1% crystal violet staining. Palvimonas, one of the Gram-positive bacteria closely related to periodontitis, Micra ( Parvimonas micra ) was also compared for its attachment ability to LTA.
  • Lactobacillus LTA can reduce the adhesion of structurally different Gram-negative bacteria, in addition to previous studies showing that it can reduce the adhesion of Gram-positive bacteria.
  • Escherichia coli and Pseudomonas aeruginosa which are pathogenic Gram-negative bacteria residing in the lungs and intestines, were treated with LreLTA at a single concentration of 30 ⁇ g/ml using LB medium, and then incubated under aerobic conditions. After culturing at 37°C, the degree of surface adhesion maintenance was compared through 0.1% crystal violet staining.

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Abstract

본 발명은 리포테이코익산 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 치주염 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 항염증용 조성물에 관한 것으로, 적은 용량으로도 치주질환 원인균의 부착력을 억제시키고, 염증을 억제시키는 바, 생체친화적 물질로 안전성이 높고 부작용이 낮다.

Description

리포테이코익산을 포함하는 치주염 예방 또는 치료용 약학적 조성물
본 발명은 리포테이코익산을 포함하는 치주염 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 항염증용 조성물에 관한 것이다.
구강 유해균은 환경에 따라 다양한 유해균들과 서로 응집하여 생물막을 형성하며, 형성된 생물막을 통해 항생제에 대한 저항성을 지닌다. 생물막에서 떨어져 나간 후에는 인체내 다양한 조직들로의 침투 감염을 일으켜 다양한 전신 질환 유발에도 밀접한 연관성을 지닌다. 이처럼 구강 유해균의 생물막은 감염에 의한 질환 발생 및 악화에 중요한 역할을 한다.
치주 질환(periodontal disease)의 원인은 주로 구강 내 세균에 의해 발생하며, 초기 잇몸질환은 연조직에서만 잇몸의 염증이 발생하는 치은염으로 알려져 있으며, 잇몸질환이 진행될수록 치조골까지 소실되는 치주염으로 발전하는 것이 특징이다.
또한 구강 유해균에 의해 일어나는 치주 질환은 한국 기준으로 4명 중 1명이 겪는 것으로 나타났으며, 2016년에는 치주질환 내원 환자가 천만명을 돌파하였다.
예시적으로, 치주 질환을 일으키는 대표 균주인 포피로모나스 진지발리스(Porphyromonas gingivalis)는 치주 질환을 앓고 있는 환자에서 주로 발견되는 세균으로, 치아와 잇몸사이의 치주낭에 서식하고 치태의 당과 단백질을 분해하여 생존하면서, 잇몸조직을 구성하는 콜라겐을 분해하는 효소를 분비하여, 잇몸을 약화시킬 수 있는 특성이 있다. 또한 구강의 상피세포에 대한 침습능을 갖고 있어, 상기 상피세포내로 침습하여 치주염을 유발시킬 수 있다. 뿐만 아니라 알츠하이머, 류마티스, 암과도 관련이 있는 원인균으로 알려져 있어 다양한 질환과 연관성이 높다.
이로 인해 치주질환에 대한 치료 및 개선에 대한 필요성이 강조되고 있는 실정이다. 치주 질환을 치료하기 위해 현재 임상에서는 항생제 또는 비스테로이드 항염증제와 같은 구강소독제들이 사용되고 있으나, 항생제와 같은 경우 장기간 치료시 내성균의 발현과 미생물 균총의 변화를 통해 새로운 기회 감염이 발생할 수 있는 요인을 제공하거나 치아 변색 등과 같은 부작용이 있으며, 비스테로이드 항염증제에 장기간 노출시에는 위장장애, 간독성 등과 같은 소화기관의 부작용이 나타날 수 있다.
따라서 임상에 적용되는 약물 남용의 위험성을 예방하기 위해 인체에 유해하지 않은 생체 친화적 물질에 대한 연구가 필요하며, 실제 임상에서 기존 치료제들에 비해 상대적으로 적은 부작용과 안전성이 담보될 뿐 아니라 치주 질환을 효과적으로 개선할 수 있는 물질의 개발이 요구된다.
한편, 리포테이코익산은 그람양성균에서 유래한 세포벽 주요 구성성분 중 하나인 물질로 세포벽의 주요 구성 성분 중 하나이며 세균의 성장과 부착, 생물막 형성, 그리고 숙주의 면역체계 활성 등의 역할을 한다.
이에 본 발명자들은 대표적인 유산균으로 알려진 락토바실러스(Lactobacillus)로부터 리포테이코익산을 높은 순도로 분리 정제하였으며, 리포테이코익산 단독으로 치주염 유발에 있어서 필수 독성인자인 아르지닌성 진지페인을 효과적으로 억제할 수 있을 뿐만 아니라, 부착에 관여하는 선모 단백질과 상호작용하여 부착을 억제하는 것을 통해 감염 및 치주염을 완화시킬 수 있다는 작용기전을 규명함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 리포테이코익산 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 치주염 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 리포테이코익산 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 항염증용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 상기 조성물을 포함하는 구강질환 치료제, 식품 세정제, 건강기능식품 및 가축 사료 첨가제를 제공하는 것이다.
그러나, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본 발명자들은 리포테이코익산이 치주염 유발 균의 표면 부착력을 감소시킬 수 있는지에 대해 연구하였다. 그 결과, 리포테이코익산이 치주염을 유발하는 균주와 직접적으로 상호작용하는 것을 확인하였으며, 포피로모나스 진지발리스(Porphyromonas gingivalis)의 선모 단백질(FimA)과 상호작용하여 표면 부착력을 저해하여, 감염력을 감소시키는데 매우 유용한 물질임을 FimA 유전자가 결손된 돌연변이 균주를 통해 확인하였다.
따라서, 본 발명은 리포테이코익산 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 치주염 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 용어 “리포테이코익산”은 "lipoteichoic acid", "LTA"와 동일한 의미로, 상호 교환적으로 사용될 수 있다.
본 발명에서 용어 "예방"이란, 본 발명의 약학적 조성물의 투여로 치주염 발병을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미하며, "치료"란, 본 발명의 약학적 조성물의 투여로 인해 이미 유발된 치주염의 증세가 호전되거나 이롭게 되는 모든 행위를 의미한다.
본 발명의 리포테이코익산 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 치주염 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 통상의 방법에 따라 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 추가적으로 포함할 수 있다. 화합물을 함유하는 약학적 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 리포테이코익산 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 치주염 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 통상의 방법에 따라 산제, 환제, 과립제, 캡슐제, 현탁액, 내용액제, 유제, 시럽제, 멸균된 수용액, 비수용액제, 현탁액, 동결 건조제 및 좌제로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 제형으로 제제화될 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 제조될 수 있다. 당해 기술 분야에 알려진 적합한 제제는 문헌(Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton PA)에 개시되어 있는 것을 사용하는 것이 바람직하다.
본 발명의 약학적 조성물은 약제학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명의 용어 "약제학적으로 유효한 양"이란, 치주염에 대한 예방 또는 치료 효과를 나타낼 수 있을 정도의 충분한 양과 부작용이나 심각한 또는 과도한 면역반응을 일으키지 않을 정도의 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 치료될 장애, 장애의 중증도, 특정 화합물의 활성, 투여 경로, 치료 지속 기간, 리포테이코익산을 포함하는 조성물과 조합되거나 또는 동시에 사용되는 약물, 대상체의 연령, 체중, 성별, 식습관, 일반적인 건강 상태, 및 의약 업계 및 의학 분야에 공지된 인자를 비롯한 다양한 인자들에 따라 달라질 것이다. "치료상 유효량" 결정시 고려되는 다양한 일반적인 사항들은 당업자에게 공지되어 있으며, 예를 들어 문헌 [Gilman et al., eds., Goodman And Gilman's: The Pharmacological Bases of Therapeutics, 8th ed., Pergamon Press, 1990] 및 [Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th ed., Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1990]에 기재되어 있다.
본 발명의 용어 "투여"란, 어떠한 적절한 방법으로 환자에게 소정의 물질을 도입하는 것을 의미하며, 인체 또는 수의용으로 제형화되어 다양한 경로로 투여된다. 본 발명의 조성물은 비경구 경로, 예컨대 혈관내, 정맥내, 동맥내, 근육내 또는 피하 등의 경로로 투여될 수 있고, 경구, 비강, 직장, 경피 또는 에어로졸을 통한 흡입 경로로 투여될 수도 있으며, 볼루스(bolus)로 투여하거나 또는 서서히 주입할 수도 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 그리고 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나 바람직한 효과를 위해서, 1일 0.01 mg/kg 내지 10 g/kg으로, 바람직하게는 1 mg/kg 내지 1 g/kg으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수 있다. 따라서, 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 약학적 조성물은 리포테이코익산 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 조성물과 함께 치주염의 예방 및 치료 효과를 갖는 공지의 유효성분을 1종 이상 포함할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 전문의약품, 위생용품, 식품 및 가축 사료 첨가제 등에 이용되어 치주염의 예방 또는 치료용 기능을 수행할 수 있다.
다른 하나의 양태로서, 본 발명은 치주염의 발병이 예상되거나 또는 치주염이 발병된 인간을 제외한 개체에게 상기 약학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 치주염을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.
본 발명의 용어 "개체"란, 치주염이 발병할 수 있는 살아있는 유기체를 의미하는데, 바람직하게는 치주염 증상이 나타날 수 있는 고등 척추동물이 될 수 있고, 보다 바람직하게는 치주염이 발병될 수 있는 소, 돼지, 양, 염소, 개 등의 가축 및 이로부터 감염될 수 있는 사람이 될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물을 상기 개체에 투여하면, 치주염을 유발시키는 균주에 대하여 개체의 면역성을 증진시켜서, 치주염을 예방 또는 치료하는 효과를 나타낼 수 있다. 이러한 약학적 조성물의 투여 대상은 일차적으로는 소, 돼지, 양, 염소, 개 등의 가축이 될 수 있으나, 이에 제한되지 않고, 상기 가축에 의하여 치주염이 전염될 수 있는 인간의 예방 또는 치료에도 사용될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물에 포함되는 상기 리포테이코익산은 인체 유해성이 없는 안전한 유익균인 유산균을 포함한 다양한 그람 양성균으로부터 유래한 것일 수 있으며, 생체친화적 물질로, 예시적으로 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus), 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum), 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei), 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus) 및 락토바실러스 루테리(Lactobacillus reuteri)로 이루어진 군에서 선택되는 어느 1종 이상에서 분리된 것일 수 있고, 바람직하게는 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus), 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum), 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei) 및 락토바실러스 루테리(Lactobacillus reuteri)로 이루어진 군에서 선택되는 어느 1종 이상에서 분리된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 치주염을 유발하는 균은 포피로모나스 진지발리스(Porphyromonas gingivalis), 캠필로박터 그라실리스(Campylobacter gracilis), 프로보텔라 니그리신스(Prevotella nigrescens), 아그레가티박터 액티노마이세템코미탄스(Aggregatibacter actinomycetemcomitans) 및 팔비모나스 미크라(Parvimonas micra)로 이루어진 군에서 선택되는 어느 1종 이상일 수 있다. 본 발명의 구체적인 일실시예에서는 그람 양성균뿐만 아니라 그람 음성균 또한 타겟 가능함을 확인하였다(도 7 참조).
또한 치주 질환 병원성균들은 알츠하이머, 암 등과 같은 다양한 전신 질환을 유발하는 균으로도 알려져 있으므로 상기 기술한 효과를 통해 다양한 감염 질환의 예방과 치료 목적으로 사용할 수 있다.
이 중에서도, 상기 치주염을 유발하는 균이 포피로모나스 진지발리스(Porphyromonas gingivalis)인 경우, 상기 리포테이코익산은 섬모 단백질인 FimA를 타겟할 수 있다. 본 발명의 구체적인 일실시예에서 리포테이코익산이 포피로모나스 진지발리스(Porphyromonas gingivalis)의 표면 단백질 중 하나인 선모 단백질(FimA)과 상호작용하여 포피로모나스 진지발리스의 표면 부착력과 응집력, 또는 염증 반응을 감소시키는 새로운 신호체계를 발견하였다(도 4 참조).
도 1 및 도 2에 나타난 바와 같이, in vivo 및 in vitro 모델에서 리포테이코익산은 포피로모나스 진지발리스(Porphyromonas gingivalis)에 의해 악화된 치주염 완화시키며, 기부착된 표면 부착력 감소 효과 또한 있음을 확인하였다.
본 발명은 또한, 리포테이코익산 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 항염증용 조성물을 제공한다.
본 발명의 항염증용 조성물에 포함되는 상기 리포테이코익산은 유산균을 포함한 다양한 그람 양성균으로부터 유래한 것일 수 있으며, 예시적으로 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus), 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum), 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei), 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus) 및 락토바실러스 루테리(Lactobacillus reuteri)에서 분리된 것일 수 있고, 바람직하게는 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus), 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum), 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei) 및 락토바실러스 루테리(Lactobacillus reuteri)에서 분리된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 염증은 포피로모나스 진지발리스(Porphyromonas gingivalis)에 의한 것일 수 있다. 구체적인 일실시예에서, 포피로모나스 진지발리스(Porphyromonas gingivalis)에 의해 발생하는 치주염은 만성적인 염증반응에서 기인하므로, 이에 대한 반응을 주관하는 진지페인의 활성을 저해시키는 것을 확인하였으며, 포피로모나스 진지발리스(Porphyromonas gingivalis)를 구강 표피 세포에 감염시키고 이후 염증 촉진 사이토카인의 발현을 확인한 결과, 리포테이코익산을 처리하는 경우, 염증 촉진 사이토카인에 해당하는 IL-6, IL-8, IL-1β의 RNA 발현 수준이 낮아졌음을 확인하였다(도 3 참조).
또한, 이는 염증 촉진 사이토카인의 억제를 관장하는 MCPIP-1의 분해를 억제하여 염증반응을 완화시키는 것을 확인하였다. 따라서, 상기 조성물은 MCPIP-1의 분해를 억제하여 염증 반응을 완화시키는 것일 수 있다.
이외에도, 본 발명의 리포테이코산을 포함하는 조성물은 치주 질환 치료제 대체물질, 구강 세정제, 연고, 치약, 구강용해필름 등 다양한 범위의 산업 분야에서 활용될 수 있다.
따라서, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 구강질환 치료제를 제공한다.
상기 구강질환 치료제는 구강의 치료 또는 구강의 위생을 위하여 사용할 수 있는 의료기구의 형태가 되는 경우를 포함한 모든 종류 및 제형을 포함할 수 있고, 바람직하게는 구강 세정제, 구강용 스프레이, 구강용 연고제, 구강용 패치, 구강용 인공치아 코팅제, 치실 및 치약으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 어느 하나일 수 있다.
상기 구강질환 치료제가 페이스트상 조성물일 경우에는 상기 점결제는 가라기닌, 각종 점증용 셀룰로오스 유도체, 잔탄검, 트라가칸트 검(tragacanth gum) 등의 검류, 폴리비닐 알콜, 폴리아크릴산 나트륨, 폴리아크릴산/말레인산 공중합체, 카르복시비닐 폴리머 등의 합성 고분자 유도체 등의 유기계 점결제와 실리카, 라포나이트 등의 무기계 점결제 등을 단독 또는 복합적으로 사용할 수 있다.
상기 구강질환 치료제에는 그 제조시 보습제로 솔비톨, 글리세린, 에틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 폴리에테르 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜 등을 추가로 포함할 수 있다.
상기 구강질환 치료제는 향료 또는 감미제 등을 추가로 포함할 수 있다. 상기 감미제는 수크로즈, 락토오즈, 말토오즈, 솔비톨, 크실리톨, 나트륨시클라메이트, 글리세린, 사카린나트륨, 스테비오사이드, 아스파탐 등일 수 있고, 상기 향료는 페퍼민트, 멘톨, 아네톨, 오이게놀, 리모넨, 시트로네놀, 알파터피네올,살리실메틸, 시네올, 리나롤, 에틸리나롤, 바닐린, 티몰, 스피아민트유, 세지유, 로즈마리유, 계피유 등일 수 있으며, 상기 감미제 또는 향료는 단독으로 또는 복합적으로 사용될 수 있다.
상기 구강질환 치료제에는 발포성분으로 사용되는 계면활성제나 추가 효능성분이 단독으로 또는 복합적으로 포함될 수 있다. 상기 발포성분으로 사용되는 계면활성제는 음이온 계면활성제, 비이온 계면활성제 및 양이온 계면활성제로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나일 수 있다.
한편, 상기 구강질환 치료제는 이를 포함하는 구강 위생용품으로도 사용될 수 있으며, 위생용품으로는 가글, 리스테린, 구강용해필름 등 구강 세정 용품, 치약, 구강 위생용품, 비누, 핸드솝, 질 세정제 첨가제, 전신세정제 등의 피부 세정제 조성물, 식기나 싱크대, 도마 등을 세정하기 위한 주방용품 세정제 조성물, 에센스, 크림 등의 화장료 조성물과 같은 위생용품에 유효성분으로 첨가하면, 각각의 위생용품 본래의 기능 외에 치주염의 예방 또는 치료용 기능을 수행할 수 있다.
본 발명은 또한, 상기 조성물을 포함하는 식품 세정제를 제공한다.
상기 식품 세정제는 천연성분으로 인체에 유해하지 아니하므로, 식품세척 등을 포함하는 각종 식품에 대한 세척이나 항균성 부여를 목적으로 사용할 수 있다.
상기 식품 세정제는 그 사용 목적 및 용도에 따라 적의 선택된 첨가물을 추가로 포함할 수 있으며, 통상적으로 사용되는 세정제 등 다른 유효성분이나 색소, 계면활성제, 방부제 등의 첨가제와 혼합하여 사용할 수 있다. 상기 식품 세정제는 그 사용 목적 및 용도에 따라 분말화, 과립화, 정제화 또는 액상화하여 제조될 수 있으며, 제품화를 위하여 포장을 위해 통상의 방법을 사용할 수 있다.
상기 식품 세정제는 항균 조성물을 포함할 수 있으며, 항균 조성물의 사용량은 사용목적과 적용형태, 적용부위, 적용대상물품 등에 따라 적절히 사용될 수 있다.
나아가, 본 발명은 또한, 상기 조성물을 포함하는 건강기능식품을 제공한다. "건강기능식품"은 기능성 식품에 관한 법률 제6727호에 따른 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 및 가공한 식품을 의미하며, "기능성"이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건 용도에 유용한 효과를 얻을 목적으로 섭취하는 것을 의미한다.
본 발명의 건강기능식품은 치주염 예방 또는 치료를 목적으로 이용될 수 있다. 본 발명의 리포테이코익산 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 조성물을 첨가물로 사용할 경우, 상기 리포테이코익산을 포함하는 조성물을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 상기물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 가공 육류, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함한다.
유효 성분의 혼합양은 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시에는 본 발명의 리포테이코익산을 포함하는 조성물은 원료에 대하여 1~20 중량%, 바람직하게는 5~10 중량%의 양으로 첨가된다. 그러나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다. 상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 발명의 음료 조성물은 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토스, 슈크로스와 같은 디사카라이드, 및 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 ㎖당 일반적으로 약 0.01~0.04 g, 바람직하게는 약 0.02~0.03 g이다. 그 외, 본 발명의 조성물은 여러가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 조성물은 천연 과일쥬스, 과일쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0.01~0.1 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
본 발명은 또한, 상기 조성물을 포함하는 가축사료 첨가제를 제공한다.
사료 첨가제로서 이용될 경우, 상기 조성물은 20 내지 90% 고농축액이거나 분말 또는 과립 형태로 제조될 수 있다. 상기 사료첨가제는 구연산, 후말산, 아디픽산, 젖산, 사과산등의 유기산이나 인산 나트륨, 인산 칼륨, 산성 피로인산염, 폴리인산염(중합인산염) 등의 인산염이나, 폴리페놀, 카테킨, 알파-토코페롤, 로즈마리 추출물, 비타민 C, 녹차 추출물, 감초 추출물, 키토산, 탄닌산, 피틴산 등의 천연 항산화제 중 어느 하나 또는 하나 이상을 추가로 포함할 수 있다. 사료로서 이용될 경우, 상기 조성물은 통상의 사료 형태로 제제화 될 수 있으며, 통상의 사료성분을 함께 포함할 수 있다.
상기 사료첨가제 및 사료는 곡물, 예를 들면 분쇄 또는 파쇄된 밀, 귀리, 보리, 옥수수 및 쌀; 식물성 단백질 사료, 예를 들면 평지, 콩, 및 해바라기를 주성분으로 하는 사료; 동물성 단백질 사료, 예를 들면 혈분, 육분, 골분 및 생선분; 당분 및 유제품, 예를 들면 각종 분유 및 유장 분말로 이루어지는 건조성분 등을 더 포함할 수 있으며, 이외에도 영양보충제, 소화 및 흡수향상제, 성장촉진제 등을 더 포함할 수 있다.
상기 사료첨가제는 동물에게 단독으로 투여하거나 식용 담체 중에서 다른 사료첨가제와 조합하여 투여할 수도 있다. 또한, 상기 사료첨가제는 탑드레싱으로서 또는 이들을 동물사료에 직접 혼합하거나 또는 사료와 별도의 경구제형으로 용이하게 동물에게 투여할 수 있다. 상기 사료첨가제를 동물사료와 별도로 투여할 경우, 당해 기술분야에 잘 알려진 바와 같이 약제학적으로 허용가능한 식용 담체와 조합하여, 즉시 방출 또는 서방성 제형으로 제조할 수 있다. 이러한 식용 담체는 고체 또는 액체, 예를 들어 옥수수전분, 락토오스, 수크로오스, 콩플레이크, 땅콩유, 올리브유, 참깨유 및 프로필렌글리콜일 수 있다. 고체 담체가 사용될 경우, 사료첨가제는 정제, 캡슐제, 산제, 트로키제 또는 함당정제 또는 미분산성 형태의 탑드레싱일 수 있다. 액체 담체가 사용될 경우, 사료첨가제는 젤라틴 연질 캡슐제, 또는 시럽제나 현탁액, 에멀젼제, 또는 용액제의 제형일 수 있다.
또한, 상기 사료첨가제 및 사료는 보조제, 예를 들어 보존제, 안정화제, 습윤제 또는 유화제, 용액촉진제 등을 함유할 수 있다. 상기 사료첨가제는 침주, 분무 또는 혼합하여 동물의 사료에 첨가하여 이용될 수 있다.
본 발명의 사료 또는 사료첨가제는 포유류, 가금 및 어류를 포함하는 다수의 동물식이에 적용할 수 있다.
본 발명에 있어서 동물은 포유류를 포함하고 포유류로서 돼지, 소, 양, 염소, 실험용 설치동물, 및 실험용 설치 동물뿐만 아니라, 애완동물(예: 개, 고양이) 등에게 사용할 수 있으며, 상기 가금류로서 닭, 칠면조, 오리, 거위, 꿩, 및 메추라기 등에도 사용할 수 있고, 상기 어류로서 송어 등에 이용될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 조성물을 포함하여 반려동물 간식, 구강용품, 위생용품 및 동물용 건강기능 식품으로 사용할 수 있으며, 전술한 예에 제한없이 반려동물 용품이라면 사용할 수 있다.
본 발명에 따른 리포테이코익산은 그람 양성균뿐만 아니라 그람 음성균에 의해 유발된 치주염 및 염증을 억제하는 바, 치주염의 예방 또는 치료용으로 효과적으로 이용될 수 있다. 치주염을 유발하는 균의 생체 부착력을 감소시켜 생체막 형성을 억제하고 감염을 억제시킨다. 생체친화적인 물질의 사용을 통해 인체 내에서 안전성이 높고 부작용을 줄일 수 있다.
도 1a 및 도 1b는 in vivo 모델을 통한 락토바실러스 루테리(Lactobacillus reuteri)에서 분리 정제한 리포테이코익산(이하 "LreLTA")의 포피로모나스 진지발리스 부착력 감소 및 치료 효과 검증 결과이다.
도 2는 LreLTA에 의한 포피로모나스 진지발리스(Porphyromonas gingivalis)의 표면 부착력 감소 효과 효능 검증결과이다. (a)는 리포테이코익산의 포피로모나스 진지발리스에 대한 부착 수준을 FACS로 분석한 결과, (b)는 포피로모나스 진지발리스의 표면 부착력을 약화시키는 것을 농도구배적으로 확인한 결과, (c)는 기부착된 포피로모나스 진지발리스의 표면 부착력을 약화시키는 것을 농도구배적으로 확인한 결과, (d-i)는 실제 치주염 환자에서 분리한 포피로모나스 진지발리스의 부착력을 약화시키는 효능 확인 결과이다.
도 3a 내지 도 3c는 LreLTA에 의한 포피로모나스 진지발리스의 독성인자인 아르지닌 특이성 진지페인의 활성을 막아 염증 반응 완화 효능을 보인 검증결과이다.
도 4a 내지 도 4d는 선모 돌연변이 포피로모나스 진지발리스 균주를 이용하여 부착력에 미치는 선모 단백질과 LreLTA의 연관성 검증결과이다.
도 5는 여러 유산균으로부터 분리 정제한 LTA에 의한 포피로모나스 진지발리스의 표면 부착력 감소 효과를 비교분석한 결과이다.
도 6a 및 도 6b는 LreLTA 및 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum)에서 분리 정제한 리포테이코익산(이하 "LpLTA")에서 각 기능기를 결실시켰을 때 포피로모나스 진지발리스 및 황색포도상구균인 스파필로코쿠스 아우레스(Staphylococcus aureus) 각각에서의 부착력 감소 효과를 검증한 결과이다.
도 7은 구강에 상주하는 다른 치주염 질환 유발 세균에 대한 LreLTA의 부착력 감소 효과 검증 결과이다. (a) 캠필로박터 그라실리스(Campylobacter gracilis), (b) 프로보텔라 니그리신스(Prevotella nigrescens), (c) 아그레가티박터 액티노마이세템코미탄스(Aggregatibacter actinomycetemcomitans), (d) 팔비모나스 미크라(Parvimonas micra)에 대한 LreLTA의 부착력 저해 효과 확인 결과이다.
도 8은 다른 기관에 상주하는 그람 음성 세균에 대한 LreLTA의 부착력 감소 효과 검증결과이다. 폐와 장에 상주하는 병원성 그람 음성 세균인 (a) 에스리키아 콜라이(Escherichia coli) 및 (b) 슈도모나스 에이루지노사(Pseudomonas aeruginosa)에 대하여 확인하였다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명의 구성 및 효과를 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
[준비예]
리포테이코익산의 정제
락토바실러스로부터 리포테이코익산을 정제하기 위해 L. acidophilus KACC 12419, L. casei KCTC 3260, L. rhamnosus GG, L. plantarum KCTC10887bp, L. reuteri ATCC 23272 균주를 사용했다. 각 균주를 de man, rogosa and sharpe broth (MRS broth)에 접종하여 37℃에서 48시간 동안 정체배양한 뒤, 원심분리를 통해 균을 수확하였다. 수확한 균을 초음파 분쇄기로 균을 균질화시킨 뒤, 균질액을 유기용매인 부탄올에 동일 비율로 혼합한 다음 원심분리를 통해 지질층을 분리하였다. 이후 분리한 추출물을 소수성 상호작용 크로마토그래피와 음이온 교환 크로마토그래피를 순차적으로 사용 및 정제하여 고순도의 리포테이코익산을 확보한 뒤, 투석 과정을 거쳐 유기용매를 전부 제거하였다. 확보된 정제물을 동결건조하여 최종 건조물을 얻었다.
[실시예 1]
in vivo 모델을 통한 LreLTA의 포피로모나스 진지발리스 부착력 감소 및 치료 효과 검증
LreLTA가 포피로모나스 진지발리스(ATCC 33277)로 인한 치주염 유도 모델에서 치료 효과를 보이는지를 먼저 확인하기 위해 포피로모나스 진지발리스 균주를 사용하였으며, in vivo 모델을 위한 실험동물로 C57BL/6 계통의 야생형 마우스를 두열바이오텍으로부터 구입하여 사용하였고, 동물실험은 실험동물 연구 윤리규정을 철저히 준수하여 수행하였다.
마우스 상악 제 2 대구치를 5-0 봉합사를 묶어 치주염을 유도한 치아 결찰 동물 모델에서, 총 5개 군으로 나누어 1개 군에는 아무것도 투여 또는 결찰하지 않고 (대조군), 1개 군에는 아무것도 투여하지 않은 상태로 결찰하였고 (치아 결찰, 음성대조군), 1개 군에는 결찰 부위에 LreLTA 50 μg를 단독으로 7일간 투여하였고 (치아 결찰 + 리포테이코익산), 1개 군에는 결찰 부위에 Brain-Heart infusion (BHI)에 헤민과 메나디온이 공급된 배지에서 배양한 포피로모나스 진지발리스 균주 1 x 109 CFU로 격일, 총 3회로 주입하여 치주염을 악화시켰으며 (치아 결찰 + 포피로모나스 진지발리스, 양성대조군), 마지막으로 남은 1개 군에는 결찰 부위에 상기 동일한 조건으로 포피로모나스 진지발리스를 3일간 격일로 투여함과 동시에 LreLTA 50 μg를 단독으로 7일간 투여하였다 (치아 결찰 + 포피로모나스 진지발리스 + 리포테이코익산).
그룹 처리 방법
대조군 아무것도 투여 또는 결찰하지 않음.
치아 결찰, (음성대조군) 아무것도 투여하지 않은 상태로 결찰.
치아 결찰 + 리포테이코익산 결찰 부위에 LreLTA 50 μg를 단독으로 7일간 투여.
치아 결찰 + 포피로모나스 진지발리스, (양성대조군) 결찰 부위에 Brain-Heart infusion (BHI)에 헤민과 메나디온이 공급된 배지에서 배양한 포피로모나스 진지발리스 균주 1 x 109 CFU로 3일간 격일로 주입하여 치주염을 악화시킴.
치아 결찰 + 포피로모나스 진지발리스 + 리포테이코익산 결찰 부위에 상기 동일한 조건으로 포피로모나스 진지발리스를 3일간 격일로 투여함과 동시에 LreLTA 50 μg를 단독으로 7일간 투여함.
투여 후 8일차 시점에 마우스를 희생시킨 뒤, 상악을 분리하여 어금니를 확보하였고 골 파괴 정도를 Micro-CT 분석을 통해 비교하였으며, 치주염 개선을 확인하기 위해 Micro-CT 분석 이후 치아의 시멘트질과 에나멜질의 경계 (CEJ-ABC)에서 치조골 간의 거리를 측정하여 치아와 잇몸 간의 벌어짐 정도를 확인하는 방법을 이용해 확인하였다.
실험 결과, 포피로모나스 진지발리스만 처리된 양성 대조군에 비해 포피로모나스 진지발리스 및 LreLTA를 처리한 그룹에서 포피로모나스 진지발리스에 의해 악화된 치주염 완화 수준이 높음을 확인하였다. 이를 통해 LreLTA가 생체조직에서도 포피로모나스 진지발리스의 부착력 약화에 의해 유발된 치주염을 완화 시킬 수 있음을 확인하였다(도 1a, b).
[실시예 2]
LreLTA에 의한 포피로모나스 진지발리스의 표면 부착력 감소 효과 효능 검증
LreLTA가 포피로모나스 진지발리스 부착력이 가능한지를 추가적으로 검증하기 위해 먼저 LreLTA가 포피로모나스 진지발리스에 직접 결합하는 지를 확인하였다.
LreLTA에 FITC를 첨가하여 접합시킨 후 PD-10 컬럼을 이용하여 접합되지 않은 FITC를 제거한 다음 순수하게 FITC가 접합된 LreLTA를 정량화하여 야생형 균주인 포피로모나스 진지발리스 균주와 한시간 동안 교반하여 FACS 분석을 실시하였다.
실험 결과, LreLTA가 포피로모나스 진지발리스 표면에 농도구배적으로 부착하여 형광을 나타내는 것을 확인할 수 있었다(도 2a).
LreLTA가 포피로모나스 진지발리스 표면 부착력에 미치는 영향을 확인하기 위해 야생형 균주인 포피로모나스 진지발리스 균주를 사용했다.
포피로모나스 진지발리스를 BHI에 헤민과 메나디온이 공급된 배지에서 배양한 뒤, 포피로모나스 진지발리스를 1 x 109 CFU/ml로 준비하여 LreLTA를 3, 10, 30 μg/ml씩 농도별로 처리하였다. 이후 혐기 조건의 37℃에서 72시간 동안 배양한 뒤 표면 부착 유지 정도를 0.1% 크리스탈바이올렛 염색을 통해 비교하였다.
실험 결과, LreLTA가 포피로모나스 진지발리스의 표면 부착력을 약화시키는 것을 농도구배적으로 확인하였다(도 2b).
LreLTA가 포피로모나스 진지발리스의 부착력을 약화시키는 효능이 기부착된 포피로모나스 진지발리스 상황에서도 동일하게 나타나는지 확인하기 위해, 포피로모나스 진지발리스 균주를 BHI에 헤민과 메나디온이 공급된 배지에서 배양한 뒤, 1 x 109 CFU/ml로 준비하여 혐기 조건의 37℃에서 72시간 동안 부착시켰다. 이후 기부착된 표면에 LreLTA를 3, 10, 30 μg/ml씩 농도별로 처리하고 혐기 조건의 24시간 동안 37℃에서 배양한 뒤 표면 부착 유지 정도를 0.1% 크리스탈바이올렛 염색을 통해 비교하였다.
실험 결과, LreLTA가 포피로모나스 진지발리스의 표면 부착력의 감소 효과를 보이는 것을 농도구배적으로 확인하였다(도 2c).
추가적으로 야생형 균주 이외에 실제 치주염 환자에서 분리한 포피로모나스 진지발리스 균주에서도 LreLTA가 같은 효과를 보이는지 확인하기 위해 포피로모나스 진지발리스 KCOM 2796, KCOM 2797, KCOM 2799, KCOM 3001, KCOM 3190, KCOM 3153 균주를 BHI에 헤민과 메나디온이 공급된 배지에서 배양한 뒤, 포피로모나스 진지발리스를 1 x 109 CFU/ml로 준비하여 LreLTA를 30 μg/ml 단일 농도로 처리하였다. 이후 혐기 조건의 37℃에서 72시간 동안 배양한 뒤 표면부착 유지 정도를 0.1% 크리스탈바이올렛 염색을 통해 비교하였다.
실험 결과, LreLTA가 포피로모나스 진지발리스의 임상 분리 균주들의 표면 부착력도 약화시키는 것을 확인하였다(도 2d~i).
[실시예 3]
LreLTA에 의한 포피로모나스 진지발리스의 염증 반응 완화 효능 검증
포피로모나스 진지발리스에 의해 발생하는 치주염 질환의 원인은 만성적인 염증 반응에 기인한다. 이는, 세포 표면 부착 및 세포 표면 부착 인자의 성숙화를 유도하며, 과도한 면역 반응을 억제하는 면역 조절 인자인 MCPIP-1을 분해하는 독성인자인 아르지닌 특이성 진지페인에 의해 발생된다.
먼저 기질특이적 반응을 통한 실험을 통해 LreLTA가 아르지닌 특이성 진지페인의 활성을 효과적으로 저해시킬 수 있음을 확인하였다 (도 3a).
이에 LreLTA가 효과적으로 포피로모나스 진지발리스에 의해 발생하는 면역 반응을 완화시킬 수 있는지를 확인하기 위해 구강 표피 세포인 YD-38 세포 (5 x 105 cells/ml)에 포피로모나스 진지발리스를 100배 높은 수준으로 (MOI 100) 감염시킨 조건에서 LreLTA를 30 μg/ml씩 처리 또는 처리하지 않은 조건에서 염증 촉진 사이토카인인 IL-6, IL-8, IL-1β의 RNA 발현을 Real-time PCR 기법을 통해 분석하였다.
실험 결과, LreLTA가 포피로모나스 진지발리스에 의한 염증 촉진 사이토카인의 발현을 억제시킬 수 있다는 것을 확인하였다 (도 3b).
추가적으로 상기 염증 촉진 사이토카인의 억제를 관장하는 MCPIP-1의 단백질 발현을 위와 같은 방법 조건에서 웨스턴 블롯을 통해 확인한 결과, LreLTA가 포피로모나스 진지발리스의 아르지닌 특이성 진지페인의 활성을 효과적으로 저해하는 것을 통해 최종적으로 MCPIP-1의 분해를 억제하여 염증 반응을 완화시킬 수 있음을 확인하였다 (도 3c).
[실시예 4]
LreLTA와 포피로모나스 진지발리스의 선모 돌연변이 균주의 연관성 검증
기존 연구에 따르면, 선모 단백질인 FimA는 포피로모나스 진지발리스의 독성인자 역할을 수행하며, 세포 부착 및 침투의 역할을 담당하고 있다고 알려져 있어 본 발명자들은 해당 균주에 대한 선모 단백질 돌연변이 균주를 제작하여 연구를 진행하였으며, 방법은 실시예 2과 동일한 조건으로 실험 수행하였다.
실험 결과, 선모 돌연변이 균주에서는 포피로모나스 진지발리스의 표면 부착력이 LreLTA에 의해 약화되지 않음을 단일 농도 처리 조건에서 부착 과정 및 기부착 상황에서 확인하였으며, 또한 이에 대한 추가 검증을 동일한 실험 조건에서의 공초점 현미경 결과를 통해 확인한 것을 통해, LreLTA가 선모 단백질을 직접적으로 타겟하여 부착을 저해한다는 것을 규명하였다 (도 4a~d).
[실시예 5]
여러 유산균으로부터 분리 정제한 LTA에 의한 포피로모나스 진지발리스의 표면 부착력 감소 효과
다른 여러 유산균으로부터 분리 정제한 LTA가 포피로모나스 진지발리스 표면 부착력에 미치는 영향을 확인하기 위해 5 종류의 유산균으로부터 분리 정제한 LTA를 사용하였다.
포피로모나스 진지발리스 포피로모나스 진지발리스 균주를 BHI에 헤민과 메나디온이 공급된 배지에서 배양한 뒤, 세포 수를 1 x 109 CFU/ml로 준비하여 5 종류의 LTA를 30 μg/ml의 단일 농도로 처리하였다. 이후 혐기 조건의 37℃에서 72시간 동안 배양한 뒤 표면 부착 유지 정도를 0.1% 크리스탈바이올렛 염색을 통해 비교하였다.
실험 결과, LaLTA를 제외한 5 종류의 LTA 모두 포피로모나스 진지발리스의 표면 부착력을 약화시키는 것을 확인하였으며, 인체 유익균인 유산균으로부터 분리한 LTA 중 특히 LreLTA가 포피로모나스 진지발리스의 표면 부착력을 가장 효과적으로 약화시켰다(도 5a, LaLTA : 락토바실러스 애시도필러스 리포테이코익산; LrLTA : 락토바실러스 람노서스 리포테이코익산; LpLTA : 락토바실러스 플란타럼; LcLTA : 락토바실러스 카제이 리포테이코익산; LreLTA : 락토바실러스 루테리 리포테이코익산).
[실시예 6]
유산균 LTA 기능기 결여 실험을 통한 표면 부착력 감소 효과 검증
LreLTA에서 기능기를 결여시켰을 때 포피로모나스 진지발리스의 부착력에 미치는 영향을 확인하고, 기존 보고자료들과의 차별성을 확인하였다.
유산균의 LTA에 양성 전하를 부여하는 D-알라닌을 결여시키기 위해 D-알라닌 결합을 끊어줄 수 있는 Tris-HCl pH 8.5 수용액을 이용하여 24시간동안 LTA와 교반한 뒤, 48시간동안 투석한 다음 D-알라닌이 결여된 LTA를 정량화하여 실험에 사용하였다. 유산균의 LTA에 소수성 상호작용에 관여되는 지질과 양성 전하를 부여하는 D-알라닌 모두를 결여시키기 위해 pH 12 수준의 알칼리성 용액인 0.5N NaOH를 활용하여 2시간동안 LTA와 교반한 뒤, 상위 과정과 동일하게 투석 및 정량화하여 실험에 사용하였다. 실험에 사용될 LTA의 기능기 결여 확인 여부는 아미노산을 검출하는 1% 닌히드린용액, 그리고 지질을 검출하는 5% 인몰리브덴산 용액을 활용하여 기능기 결여를 확인하였다. 기능기 결여 확인 이후, 포피로모나스 진지발리스 균주를 BHI에 헤민과 메나디온이 공급된 배지에서 배양한 뒤, 세포 수를 1 x 109 CFU/ml로 준비하여 기능기가 결여된 혹은 결여되지 않은 LTA를 30 μg/ml의 단일 농도로 처리하였다. 이후 혐기 조건의 37℃에서 72시간 동안 배양한 뒤 표면 부착 유지 정도를 0.1% 크리스탈바이올렛 염색을 통해 확인하였다. 또한, 기존 보고자료들에서 활용되었던 황색포도상구균인 스파필로코쿠스 아우레스(Staphylococcus aureus) RN4220에 대한 기능기 결여 LTA에 대한 결과를 비교 분석하기 위해 Luria-Bertani (LB) 배지에서 세포 수를 1 x 109 CFU/ml로 준비하여 기능기가 결여된 혹은 결여되지 않은 LTA를 30 μg/ml의 단일 농도로 처리하였다. 이후 호기 조건의 37℃에서 24시간 동안 배양한 뒤 표면 부착 유지 정도를 0.1% 크리스탈바이올렛 염색을 통해 비교하였다.
실험 결과, LreLTA와 같은 경우, 그람 음성 세균인 포피로모나스 진지발리스의 부착력에 대해선 오히려 D-알라닌이 제거되었을 때, 포피로모나스의 부착력 억제가 비결여 LTA보다 효과적으로 진행됨을 확인할 수 있었으나(도 6a), 기존 보고자료에서 활용되었던 LpLTA는 그람 양성 세균인 황색포도상구균에서는 기능기가 결여되었을 때 황색포도상구균의 부착력에 아무런 효과를 보이지 않았다(도 6b). 해당 결과를 통해 기능기가 결여된 락토바실러스 LTA가 그람 양성 또는 음성세균 여부에 따라 부착력 조절에서 차이가 있음을 확인할 수 있다.
[실시예 7]
구강에 상주하는 다른 치주염 질환 유발 세균에 대한 부착력 감소 효과 검증
실제 구강에서 치주염이 유발되는 기전은 일반적으로 그람 음성 세균에 의해 주로 일어나며, 포피로모나스 진지발리스 뿐만 아니라 다양한 그람 음성 세균들 또한 치주염과 밀접한 연관성을 가진다. 따라서 락토바실러스 LTA가 다른 치주염 유발균인 그람 음성 세균에 미치는 영향을 추가로 확인하였다.
다양한 배지를 활용하여 치주염과 연관이 있는 그람 음성 세균인 캠필로박터 그라실리스(Campylobacter gracilis), 프로보텔라 니그리신스(Prevotella nigrescens), 아그레가티박터 액티노마이세템코미탄스(Aggregatibacter actinomycetemcomitans)에 LTA를 30 μg/ml의 단일 농도로 처리한 다음, 혐기 조건의 37℃에서 배양한 뒤 표면 부착 유지 정도를 0.1% 크리스탈바이올렛 염색을 통해 비교하였으며, 치주염과 밀접한 연관성을 가지는 그람 양성 세균 중 하나인 팔비모나스 미크라(Parvimonas micra) 또한 함께 LTA에 대한 부착능력을 비교하였다.
실험 결과, LreLTA가 효과적으로 치주염과 밀접한 연관성을 지니는 그람 음성 세균의 부착력을 저해할 뿐만 아니라, 그람 양성 세균의 부착력 또한 감소시킬 수 있음을 확인하였다(도 7a-d).
해당 결과를 통해 락토바실러스 LTA가 그람 양성 세균의 부착력을 감소시킬 수 있는 기존 선행 연구에 더불어, 구조적으로 차이가 있는 그람 음성 세균의 부착력을 감소시킬 수 있음을 확인하였다.
[실시예 8]
다른 기관에 상주하는 그람 음성 세균에 대한 부착력 감소 효과 검증
상기 결과들을 통해 LreLTA가 구강에 상주하는 세균의 부착을 효과적으로 억제시킬 수 있다는 것을 토대로, 다른 기관에 상주하는 그람 음성 세균 부착에 미치는 영향을 추가로 확인하였다.
LB 배지를 활용하여 폐와 장에 상주하는 병원성 그람 음성 세균인 에스리키아 콜라이(Escherichia coli) 및 슈도모나스 에이루지노사(Pseudomonas aeruginosa)에 LreLTA를 30 μg/ml의 단일 농도로 처리한 다음, 호기 조건의 37℃에서 배양한 뒤 표면 부착 유지 정도를 0.1% 크리스탈바이올렛 염색을 통해 비교하였다.
실험 결과, LreLTA가 다른 기관에 상주하는 그람 음성 세균에 대한 부착에는 영향을 미치지 않음을 확인하였다(도 8a, b). 해당 결과를 통해 락토바실러스 LTA가 그람 양성 세균의 부착력을 감소시킬 수 있는 기존 선행 연구에 더불어, 이와 구조적으로 차이가 있는 그람 음성 세균의 부착력을 감소시킬 수 있었으나, 이는 구강에 상주하는 그람 음성 세균에 대하여 감소 효과를 보임을 확인할 수 있다.

Claims (12)

  1. 리포테이코익산 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 치주염 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 리포테이코익산은 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus), 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum), 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei) 및 락토바실러스 루테리(Lactobacillus reuteri)로 이루어진 군에서 선택되는 어느 1종 이상으로부터 분리된 것인, 치주염 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 치주염을 유발하는 균은 포피로모나스 진지발리스(Porphyromonas gingivalis), 캠필로박터 그라실리스(Campylobacter gracilis), 프로보텔라 니그리신스(Prevotella nigrescens), 아그레가티박터 액티노마이세템코미탄스(Aggregatibacter actinomycetemcomitans) 및 팔비모나스 미크라(Parvimonas micra)로 이루어진 군에서 선택되는 어느 1종 이상인, 치주염 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 치주염을 유발하는 균이 포피로모나스 진지발리스(Porphyromonas gingivalis)인 경우, 상기 리포테이코익산은 섬모 단백질인 FimA를 타겟하는 것인, 치주염 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  5. 리포테이코익산 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 항염증용 조성물.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 리포테이코익산은 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus), 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum), 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei) 및 락토바실러스 루테리(Lactobacillus reuteri)로 이루어진 군에서 선택되는 어느 1종 이상으로부터 분리된 것인, 항염증용 조성물.
  7. 제5항에 있어서,
    상기 염증은 포피로모나스 진지발리스(Porphyromonas gingivalis)에 의한 것인, 항염증용 조성물.
  8. 제5항에 있어서,
    상기 조성물은 MCPIP-1의 분해를 억제하여 염증 반응을 완화시키는 것인, 항염증용 조성물.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는 구강질환 치료제.
  10. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는 식품 세정제.
  11. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는 건강기능식품.
  12. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는 가축 사료 첨가제.
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