KR102584256B1 - 수퍼옥시드 디스뮤타제 및/또는 바실러스 균주 포자를 포함하는 조성물 및 이의 구강 건강 개선용 용도 - Google Patents
수퍼옥시드 디스뮤타제 및/또는 바실러스 균주 포자를 포함하는 조성물 및 이의 구강 건강 개선용 용도 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 수퍼옥시드 디스뮤타제(SOD) 효소 및/또는 바실러스 종 균주 포자를 포함하는 구강용 조성물 및 이의 구강 건강 증진 또는 구강 위생 관리를 위한 용도에 관한 것이다. 이러한 조성물은 구강에서 부작용을 일으킴이 없이 구강 통증, 구취, 치석, 치태, 치은염 및 치주염과 같은 구강 질환을 예방하거나 치료하는 데에 유용하게 사용될 수 있다.
Description
본 발명은 수퍼옥시드 디스뮤타제 효소 및/또는 바실러스 종 균주 포자를 포함하는 조성물, 및 이의 구강 건강 증진, 구강 위생 관리 또는 구강 질환의 예방 또는 치료를 위한 용도에 관한 것이다.
구강 질환은 대부분 구강 위생 불량으로 시작되어, 치석, 충치, 치은염 등으로 이어지게 되며 심한 구취를 동반할 수 있다. 구취라 불리는 입 냄새의 주요 원인은 치은염 및 치주염과 같은 치주 질환, 냄새를 유발하는 혀의 박테리아, 특정 식품과 알코올성 음료, 흡연 등이 있다. 입안의 음식물 제거가 잘 이루어지지 않으면 치태라고 불리는 치아표면의 연성 부착물이 생기고 치태는 시간이 지나게 되면 치석이 된다. 치석은 치태 내에서 타액과 치은열구액(gingival crevicular fluid)의 무기질이 석회화되어 치아표면에 단단하게 달라붙어 있는 것으로, 치석은 칫솔질로는 제거되지 않고, 치석제거술 (scaling)로만 제거할 수 있다. 치석을 제거하지 않으면, 치석으로 인해 잇몸에 치은염이라는 염증이 생기기 쉬워진다. 치은염의 상태가 나빠지게 되면 잇몸은 물론 인대나 치조골에까지 염증이 생기게 된다. 이 염증이 바로 치주염인데, 이로 인해 입 냄새가 유발되기도 한다. 치주염은 극심한 고통을 줄 뿐만 아니라 심장이나 신장에까지 세균이 감염될 수 있어 각별한 주의를 요한다.
치태 내에 서식하면서 각종 구강 질환을 유발하는 구강 병원균의 증식을 억제하는 물질로는 항생제를 포함한 항균제가 있다. 그러나, 항생제는 우리 몸에 대한 전신적인 부작용과 함께 구강 내 내성균의 출현을 유발할 수 있기 때문에 장기적인 사용이 곤란하여 단기간 동안 치료제로 이용해야 하는 단점이 있다. 또한, 구강 청정제에 사용되고 있는 항균제로는 생구이나린(Sangquinarine), 리스테린(Listerine), 클로르헥시딘(Chlorhexidine) 등이 있는데, 이 중에서 생구이나린은 구강 내에서 세균에 대한 효과가 불분명할 뿐만 아니라 가격도 고가라는 단점이 있고, 리스테린은 알코올이 주성분으로 약간의 정균 작용이 있으나 실제 구강 내에서는 일시적인 효과를 나타낼 뿐 장기간 사용 시 조직에 대해 위해 작용을 나타낼 수 있는 단점이 있다.
치석을 제거하는 효과적인 방법은 치석제거술이다. 그러나, 스케일링은 잇몸이 붓거나, 차거나 뜨거운 음식에 민감해질 수 있으며, 부적절한 스케일링은 잇몸 손상을 유발할 수 있다.
따라서, 치아 또는 잇몸에서 불리한 부작용을 일으킴이 없이 구강 위생 관리 및 구강 건강 증진에 사용될 수 있을 뿐만 아니라 구강 질환을 예방하거나 치료할 수 있는 물질 및 방법이 필요하다.
본 발명은 상술한 종래 기술의 문제점을 해결하는 것을 그 목적으로 한다.
본 발명은 수퍼옥시드 디스뮤타제 및/또는 바실러스 종 균주 포자를 이용하여 구강 건강을 증진하거나 구강 위생을 관리하는 것을 다른 목적으로 한다.
본 발명은 수퍼옥시드 디스뮤타제 및/또는 바실러스 종 균주 포자를 이용하여 구강 질환을 예방 또는 치료하는 것을 또 다른 목적으로 한다.
본 발명의 목적은 이상에서 언급한 목적으로 제한되지 않는다. 본 발명의 목적은 이하의 설명으로 보다 분명해질 것이며, 특허청구범위에 기재된 수단 및 그 조합으로 실현될 것이다.
상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 대표적인 구성은 다음과 같다.
본 발명의 일 태양에 따르면, 수퍼옥시드 디스뮤타제(SOD) 및 바실러스 종 균주 포자로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 포함하는 구강용 조성물이 제공된다.
본 발명의 다른 태양에 따르면, 상기 조성물을 포함하는 구강용 제품이 제공된다.
본 발명의 또 다른 태양에 따르면, 상기 조성물을 포함하는 구강 질환의 예방 또는 치료를 위한 약학 조성물이 제공된다.
본 발명의 또 다른 태양에 따르면, 상기 조성물을 포함하는 수의학적 조성물이 제공된다.
본 발명의 또 다른 태양에 따르면, 상기 조성물을 포함하는 식품 조성물이 제공된다.
본 발명의 또 다른 태양에 따르면, 상기 조성물을 포함하는 사료 조성물이 제공된다.
본 발명의 또 다른 태양에 따르면, 수퍼옥시드 디스뮤타제(SOD) 및 바실러스 종 균주 포자로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 개체에 투여하는 단계 또는 상기 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 구강 위생을 증진하거나 구강 질환을 예방 또는 치료하는 방법이 제공된다.
본 발명에 따른 조성물은 부작용을 일으킴이 없이 구취, 치석, 치태, 치아 우식증, 치은염 또는 치주염과 같은 구강 질환을 예방하거나 치료하는 데에 유용하게 사용될 수 있을 뿐만 아니라 그러한 구강 질환으로 인한 통증을 감소시키는 데에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 치석 지수를 점수로 환산하기 위한 기준을 나타낸다.
도 2는 치은염 지수를 점수로 환산하기 위한 기준을 나타낸다.
도 3은 실험예 1.4에 따른 시험 물질의 투여 후에 관찰된 구취 지수에 관한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 4는 실험예 1.4에 따른 시험 물질의 투여 후에 관찰된 치석 지수에 관한 결과를 나타낸 그래프이다. *는 0주차 대비 P < 0.05를 나타낸다.
도 5는 실험예 1.4에 따른 시험 물질의 투여 후에 관찰된 치태 지수에 관한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 6은 실험예 1.4에 따른 시험 물질의 투여 후에 관찰된 치은염 지수에 관한 결과를 나타낸 그래프이다. **는 0주차 대비 P < 0.01을 나타낸다.
도 7은 실험예 2.4에 따른 시험 물질의 투여 후에 관찰된 촉진성 통증 지수에 관한 결과를 나타낸 그래프이다. *는 0주차 대비 P < 0.05를 나타낸다.
도 8은 실험예 2.4에 따른 시험 물질의 투여 후에 관찰된 구취 지수에 관한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 9는 실험예 2.4에 따른 시험 물질의 투여 후에 관찰된 치태 지수에 관한 결과를 나타낸 그래프이다. *는 0주차 대비 P < 0.05를 나타내고, **는 0주차 대비 P < 0.01을 나타낸다.
도 10은 실험예 2.4에 따른 시험 물질의 투여 후에 관찰된 치석 지수에 관한 결과를 나타낸 그래프이다. *는 0주차 대비 P < 0.05를 나타낸다.
도 11은 실험예 2.4에 따른 시험 물질의 투여 후에 관찰된 치은염 지수에 관한 결과를 나타낸 그래프이다. **는 0주차 대비 P < 0.01을 나타낸다.
도 12는 SodA2를 발현하는 재조합 생산 균주(BSBA310)을 제조하기 위한 전체 절차를 나타낸다.
도 13은 sodA2 유전자의 과발현을 위한 발현 벡터를 나타낸다. 여기서, rrnB T1T2는 전사 종결인자를 나타내고; rep(pBR322)는 E. coli에서 작동하는 pBR322로부터의 레플리콘을 나타내고; rep(pUB110)는 B. subtilis에서 작동하는 pUB110로부터의 레플리콘이고; KanR은 카나마이신 내성 유전자(아미노글리코시드 O-뉴클레오티딜트랜스퍼라제)를 나타내고; BJ27 promoter는 B. subtilis에 대한 강력한 프로모터를 나타낸다.
도 2는 치은염 지수를 점수로 환산하기 위한 기준을 나타낸다.
도 3은 실험예 1.4에 따른 시험 물질의 투여 후에 관찰된 구취 지수에 관한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 4는 실험예 1.4에 따른 시험 물질의 투여 후에 관찰된 치석 지수에 관한 결과를 나타낸 그래프이다. *는 0주차 대비 P < 0.05를 나타낸다.
도 5는 실험예 1.4에 따른 시험 물질의 투여 후에 관찰된 치태 지수에 관한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 6은 실험예 1.4에 따른 시험 물질의 투여 후에 관찰된 치은염 지수에 관한 결과를 나타낸 그래프이다. **는 0주차 대비 P < 0.01을 나타낸다.
도 7은 실험예 2.4에 따른 시험 물질의 투여 후에 관찰된 촉진성 통증 지수에 관한 결과를 나타낸 그래프이다. *는 0주차 대비 P < 0.05를 나타낸다.
도 8은 실험예 2.4에 따른 시험 물질의 투여 후에 관찰된 구취 지수에 관한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 9는 실험예 2.4에 따른 시험 물질의 투여 후에 관찰된 치태 지수에 관한 결과를 나타낸 그래프이다. *는 0주차 대비 P < 0.05를 나타내고, **는 0주차 대비 P < 0.01을 나타낸다.
도 10은 실험예 2.4에 따른 시험 물질의 투여 후에 관찰된 치석 지수에 관한 결과를 나타낸 그래프이다. *는 0주차 대비 P < 0.05를 나타낸다.
도 11은 실험예 2.4에 따른 시험 물질의 투여 후에 관찰된 치은염 지수에 관한 결과를 나타낸 그래프이다. **는 0주차 대비 P < 0.01을 나타낸다.
도 12는 SodA2를 발현하는 재조합 생산 균주(BSBA310)을 제조하기 위한 전체 절차를 나타낸다.
도 13은 sodA2 유전자의 과발현을 위한 발현 벡터를 나타낸다. 여기서, rrnB T1T2는 전사 종결인자를 나타내고; rep(pBR322)는 E. coli에서 작동하는 pBR322로부터의 레플리콘을 나타내고; rep(pUB110)는 B. subtilis에서 작동하는 pUB110로부터의 레플리콘이고; KanR은 카나마이신 내성 유전자(아미노글리코시드 O-뉴클레오티딜트랜스퍼라제)를 나타내고; BJ27 promoter는 B. subtilis에 대한 강력한 프로모터를 나타낸다.
후술하는 본 발명에 대한 상세한 설명은, 본 발명이 실시될 수 있는 특정 구현예에 관하여 특정 도면을 참조하여 기술될 것이지만, 본 발명은 이에 한정되지 않고, 적절하게 설명된다면, 그 청구항들이 주장하는 것과 균등한 모든 범위와 더불어 첨부된 청구항에 의해서만 한정된다. 본 발명의 다양한 구현예/실시예는 서로 다르지만 상호 배타적일 필요는 없음이 이해되어야 한다. 예를 들어, 본 명세서에 기재되어 있는 특정 형상, 구조 및 특성은 본 발명의 기술적 사상과 범위를 벗어나지 않으면서 일 구현예/실시예에서 다른 구현예/실시예로 변경되거나 구현예/실시예들이 조합되어 구현될 수 있다. 본 명세서에 사용된 기술 및 학술 용어들은, 달리 정의되지 않는 한, 본 발명이 속하는 분야에서 일반적으로 사용되는 것과 같은 의미를 갖는다. 본 명세서를 해석할 목적으로 하기 정의들이 적용될 것이고, 단수로 사용된 용어는 적절한 경우에는 복수형을 포함할 것이며 그 반대도 마찬가지이다.
정의
본 명세서에서 사용되는 "개체"는 "환자"와 상호교환적으로 사용되고, 구강 위생 또는 구강 질환의 예방 또는 치료를 필요로 하는 포유동물, 예를 들어 영장류(예컨대 인간, 원숭이, 침팬지 등), 반려 동물(예컨대 개, 고양이 등), 가축 동물(예컨대 소, 돼지, 말, 양, 염소 등) 또는 실험실 동물(예컨대 랫트, 마우스, 기니피그 등)일 수 있다.
용어 "치료"는 일반적으로 목적하는 약리학적 효과 및/또는 생리학적 효과를 수득하는 것을 의미한다. 이러한 효과는 질환 및/또는 다른 원하지 않거나 바람직하지 않은 상태(예컨대 구취, 치석, 치태, 치아 우식증, 치은염, 치주염, 통증 등)를 부분적으로 또는 완전히 치유하는 점에서 치료적 효과를 가진다. 바람직한 치료적 효과는 질환의 발생 또는 재발 방지, 증상의 호전, 질환의 임의의 직접 또는 간접적인 병리학적 결과의 축소, 전이의 방지, 질환 진행 속도의 감소, 질환 상태의 호전 또는 완화 및 차도 또는 개선된 예후를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는 "치료"는 이미 나타난 질환 또는 장애의 의료적 개입을 의미할 수 있다.
용어 "예방"은 질병 또는 이의 증상을 부분적으로 또는 완전히 예방한다는 관점에서 목적하는 예방적인 약리학적 효과 및/또는 생리학적 효과를 수득함을 의미한다.
용어 "투여"는 개체에 예방적 또는 치료적 목적을 달성하기 위한 유효성분을 제공하는 것을 의미한다.
구강 조성물
본 발명은 부분적으로 수퍼옥시드 디스뮤타제(SOD) 또는 바실러스 종 균주 포자를 단독으로 적용하거나 수퍼옥시드 디스뮤타제(SOD) 및 바실러스 종 균주 포자를 조합하여 개체의 구강에 적용하는 경우에 구강 위생의 증진 또는 구강 질환의 예방 또는 치료에 효과적이라는 발견에 기초한다. 따라서, 본 발명의 일 태양에 따르면, 수퍼옥시드 디스뮤타제(SOD), 바실러스 종 균주 포자, 또는 SOD 및 바실러스 종 균주 포자를 포함하는 구강용 조성물이 제공된다. 바람직하게, 상기 조성물은 수퍼옥시드 디스뮤타제 효소 및 바실러스 종 균주 포자를 포함한다.
수퍼옥시드 디스뮤타제(Superoxide dismutase; SOD)는 수퍼옥시드(O2 *-) 라디칼의 일반 분자 산소(O2)와 과산화수소(H2O2)로의 디스뮤테이션(dismutation)을 번갈아 촉매하는 효소로서, SOD는 활성 산소 종을 제거하여 산화 스트레스를 줄이는 데 중요한 역할을 한다. SOD는 원핵 세포와 진핵 세포에 널리 분포하고 있으며, 다양한 유형의 금속 중심(구리/아연, 니켈, 망간 및 철)에 따라 4가지 부류로 분류된다. 망간 함유 SOD[Mn-SOD]가 많은 세균 또는 진핵 세포의 엽록체, 미토콘드리아 및 세포질에 광범위하게 존재한다. 본 발명에서, 용어 "SOD"는 수퍼옥시드 디스뮤타아제 활성을 갖는 (폴리)펩티드와 상호 교환적으로 사용될 수 있다. 또한, SOD는 수퍼옥시드 디스뮤타제 활성을 갖는 폴리펩티드 또는 이의 단편, 또는 이를 포함하는 융합체를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, SOD는 망간에 결합하는 것(Mn-SOD)일 수 있다. 바람직하게는, SOD는 탈아미드화된 Mn-SOD일 수 있다. 또한, SOD는 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 것일 수 있다(SodA). 바람직하게는, SOD는 서열번호 2를 기준으로 74번 및 137번 아미노산 잔기가 Asp로 치환된 것일 수 있다. 보다 바람직하게는, SOD는 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다(SodA2).
본 발명의 SOD 또는 SOD 활성을 갖는 폴리펩티드는 상기 아미노산 서열에 대하여 실질적인 동일성을 나타내는 아미노산 서열도 포함되는 것으로 해석된다. 상기 실질적인 동일성은 당업계에 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 정렬된 서열을 분석하는 경우, 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 보다 바람직하게는 95% 이상, 가장 바람직하게는 98% 이상의 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 의미한다.
일부 구현예에서, SOD는 SOD 효소 활성을 갖는 개질된(modified 또는 engineered) 폴리펩티드로서 다양한 측면(생체내, 시험관내 또는 생체외 안정성, 균일성, 및/또는 형태적 변경)에 영향을 미치거나 미치지 않는 하나 이상의 변이, 예컨대, 하나 이상의 아미노산의 결실, 삽입 또는 치환을 포함할 수 있다. 또한, 상기 폴리펩티드는 정제, 검출, 생체내 전달 또는 안정성 증가를 위한 이종성 물질(예컨대, HIS tag, HA tag, myc tag를 포함한 당업계에 공지된 tag, GFC 및/또는 항체의 Fc 도메인)을 추가로 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 본 발명의 SOD는 천연, 변이체 또는 재조합 미생물을 비롯한 다양한 공급원로부터 유래된 것일 수 있다. 예를 들어, SOD는 박테리아로부터 유래될 수 있다. 바람직하게는, SOD는 약물 또는 식품에 사용하기에 일반적으로 안전한 것으로 간주되는(generally regarded as safe, GRAS) 박테리아, 예를 들어 바실러스 종(Bacillus sp.) 균주 또는 그의 변이체로부터 유래될 수 있다. 보다 바람직하게는, SOD는 바실러스 아밀로리퀴파시엔스(Bacillus amyloliquesfaciens) 균주(예컨대, GF423 균주 또는 GF424 균주) 또는 이들의 배양 상등액으로부터 얻어질 수 있다. 상기 GF423 균주 및 GF424 균주는 한국생명공학연구원에 각각 2017년 3월 6일자 및 2017년 3월 13일자로 기탁된 것이다(각각 수탁번호 KCTC 13222 BP 및 수탁번호 KCTC 13227 BP). 상기 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 GF424 균주는 sod 유전자의 발현을 개선하기 위해 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 GF423 균주를 UV 조사에 의해 돌연변이시킴으로써 얻은 균주이다. 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 GF423 또는 GF424 균주에서 유래된 SOD 효소(SodA)는 Mn-SOD이며, 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는다(그의 뉴클레오티드 서열은 서열번호 1로 표시됨). 또한, SOD는 재조합 폴리펩티드일 수 있다. 예를 들어, 서열번호 2를 기준으로 74번 및 137번 아미노산 잔기가 Asp로 치환된 탈아미드화된 SOD일 수 있고(SodA2), 이는 서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는다(그의 뉴클레오티드 서열은 서열번호 3으로 표시됨). 서열번호 1 내지 4의 서열은 표 1에 나타낸 바와 같다.
| 구분 | 서열 | 서열번호 |
| SodA 의 뉴클레오티드 서열 | ATGGCTTACAAACTTCCAGAATTGCCTTACGCTTATGATGCTTTAGAACCTCATATCGATAAGGAAACGATGACGATTCACCATACGAAGCACCATAACACATACGTGACAAACCTCAACAAAGCGATCGAAGGATCTGCGCTTGCAGAGAAATCTGTAGATGAGCTTGTTGCTGATTTGAACGCAGTGCCGGAGGACATCCGCACGGCAGTCCGCAACAATGGCGGCGGACATGCAAACCACTCTTTATTCTGGACTCTTTTATCTCCGAACGGCGGAGGCGAACCGACTGGTGAGCTTGCTGAAGAGATCAAAAGCACGTTCGGAAGCTTCGATCAATTTAAAGAAAAATTCGCCGCAGCAGCTGCAGGCCGTTTCGGTTCAGGCTGGGCTTGGCTCGTTGTAAACAACGGCAAACTTGAAATTACAAGCACGCCAAACCAAGATTCACCGCTTTCAGAAGGTAAAACACCTGTTCTCGGTCTTGATGTTTGGGAGCATGCGTACTACCTGAACTACCAAAACCGCCGTCCTGATTACATTTCAGCTTTCTGGAATGTTGTGAACTGGGATGAAGTTGCCCGTCTTTACAGCGAAGCAAAATAA | 서열번호 1 |
| SodA의 아미노산 서열 | MAYKLPELPYAYDALEPHIDKETMTIHHTKHHNTYVTNLNKAIEGSALAEKSVDELVADLNAVPEDIRTAVRNNGGGHANHSLFWTLLSPNGGGEPTGELAEEIKSTFGSFDQFKEKFAAAAAGRFGSGWAWLVVNNGKLEITSTPNQDSPLSEGKTPVLGLDVWEHAYYLNYQNRRPDYISAFWNVVNWDEVARLYSEAK | 서열번호 2 |
| SodA2 의 뉴클레오티드 서열 | ATGGCTTACAAACTTCCAGAATTGCCTTACGCTTATGATGCTTTAGAACCTCATATCGATAAGGAAACGATGACGATTCACCATACGAAGCACCATAACACATACGTGACAAACCTCAACAAAGCGATCGAAGGATCTGCGCTTGCAGAGAAATCTGTAGATGAGCTTGTTGCTGATTTGAACGCAGTGCCGGAGGACATCCGCACGGCAGTCCGCAACGATGGCGGCGGACATGCAAACCACTCTTTATTCTGGACTCTTTTATCTCCGAACGGCGGAGGCGAACCGACTGGTGAGCTTGCTGAAGAGATCAAAAGCACGTTCGGAAGCTTCGATCAATTTAAAGAAAAATTCGCCGCAGCAGCTGCAGGCCGTTTCGGTTCAGGCTGGGCTTGGCTCGTTGTAAACGACGGCAAACTTGAAATTACAAGCACGCCAAACCAAGATTCACCGCTTTCAGAAGGTAAAACACCTGTTCTCGGTCTTGATGTTTGGGAGCATGCGTACTACCTGAACTACCAAAACCGCCGTCCTGATTACATTTCAGCTTTCTGGAATGTTGTGAACTGGGATGAAGTTGCCCGTCTTTACAGCGAAGCAAAATAA | 서열번호 3 |
| SodA2 의 아미노산 서열 | MAYKLPELPYAYDALEPHIDKETMTIHHTKHHNTYVTNLNKAIEGSALAEKSVDELVADLNAVPEDIRTAVRNDGGGHANHSLFWTLLSPNGGGEPTGELAEEIKSTFGSFDQFKEKFAAAAAGRFGSGWAWLVVNDGKLEITSTPNQDSPLSEGKTPVLGLDVWEHAYYLNYQNRRPDYISAFWNVVNWDEVARLYSEAK | 서열번호 4 |
또한, SOD는 상기 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 균주의 SOD 발현 유전자를 이용한 다른 재조합 균주(예컨대, 바실러스 서브틸리스(Bacillus Subtilis) 종 균주)로부터 유래될 수 있다. 상기 재조합 균주는 당업계에 알려진 통상적인 단백질 생산 균주를 이용하여 재조합 기술에 의해 제조될 수 있다. 예컨대, 상기 (재조합 균주의 모균주인) 바실러스 서브틸리스 균주는 KCTC 3135일 수 있으며, 상기 KCTC 3135 균주는 한국생명공학연구원 생물자원센터(KCTC)로부터 분양받을 수 있다. 또한, 상기 재조합 균주는 후공정을 유리하기 위해 하기 표 2에 나타낸 유전자 중 하나 이상이 제거될 수 있다.
| 유전자 명칭 | 단백질 명칭 | 기능 |
| AprE | 세린 알칼리 프로테아제(서브틸리신 E) | 세포외 프로테아제 |
| NprE | 세포외 중성 메탈로프로테아제 | 세포외 프로테아제 |
| Bpr | 바실로펩티다제(bacillopeptidase) F | 세포외 프로테아제 |
| Epr | 세포외 세린 프로테아제 | 세포외 프로테아제 |
| NprB | 세포외 중성 프로테아제 B | 세포외 프로테아제 |
| Vpr | 세포외 세린 프로테아제 | 세포외 프로테아제 |
| Mpr | 세포외 메탈로프로테아제 | 세포외 프로테아제 |
| IspA | 세포내 세린 프로테아제 | 세포내 프로테아제 |
| SrfAC | 서팩틴 신타제 | 서팩틴(surfactin) 합성 |
| spoIIAC | RNA 폴리머라제 포자형성-특이적 시그마 인자(시그마-F) | 포자형성 |
| EpsE | 추정 글리코실트랜스퍼라제 | 세포외 다당류 |
| Xpf | RNA 폴리머라제 시그마 인자 | PBSX 프로파지 유전자의 전사 |
예컨대, 상기 재조합 균주는 도 12에 도시된 과정을 거쳐 제조될 수 있다. 또한, 상기 재조합 균주는 도 13에 도시된 발현 벡터를 포함할 수 있다. 상기 도면에서 sodA 및 sodA2는 SOD를 코딩하는 유전자를 나타낸다.
상기 균주 유래의 SOD는 세포 외부로 분비되는 효소이므로, 상기 균주를 이용하여 SOD를 제조하는 경우, 고가의 정제 과정(예를 들어 컬럼 정제)을 거치지 않고 개체에 안전성이 확보된 SOD를 대량으로 생산할 수 있기 때문에 효율적인 생산이 가능하다.
일부 구현예에서, 본 발명의 SOD는 상기 천연, 변이체 또는 재조합 미생물을 다양한 배양 배지에서 배양하여 수득될 수 있다. 예를 들어 구강 조성물에 포함되는 SOD는 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 GF423 균주 또는 GF424 균주의 배양 상층액으로부터 분리될 수 있다. 구체적으로, 먼저 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 균주를 다양한 유형의 배지에서 배양하여 배양액을 얻을 수 있다. 예를 들어, 복합 배지(pH 6.0 내지 7.0)를 사용하여 상기 균주를 약 25℃ 내지 약 42℃에서 약 1 일 내지 약 4 일 동안 성장시킨다. 상기 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 균주를 배양하기 위한 다른 적합한 배지로는 LB(Luria-Bertani) 배지, ISP(International Streptomyces Project) 배지, NA(nutrient agar) 배지, BHI(brain heart infusion agar) 배지, SDA(sabouraud dextrose agar) 배지, PDA(potato dextrose agar) 배지, NB(nutrient broth) 배지 등이 포함된다. 바람직한 구현예에서, LB 배지, ISP 배지, BHI 배지, SDA 배지, 또는 NB 배지가 사용될 수 있다. 또한, SOD는 PubMed 또는 BRENDA(월드 와이드 웹의 brenda-enzymes.org)와 같은 데이터베이스에 제공된 정보를 사용하여 다른 천연, 변이체 또는 재조합 숙주로부터 공급될 수 있다.
일부 구현예에서, 본 발명의 SOD는 천연, 변이체 또는 재조합 균주의 배양물로부터 단리되거나 정제된 것일 수 있다. 이때 단리되거나 정제된 SOD 또는 그의 생물학적 활성 부분에는 그것이 유래된 세포 또는 조직 공급원으로부터의 세포 물질 또는 기타 오염 단백질을 실질적으로 포함하지 않는다. 예를 들어, 정제물은 균주 배양물로부터 한외 여과(Ultrafiltration), 황산암모늄 처리, 컬럼 정제, 농축 등을 통해 순수 분리된 것이거나, 한외 여과, 농축 등을 통해 얻어진 배양 농축액일 수 있다. "세포 물질이 실질적으로 없는"이라는 문구는, 단백질이 단리되거나 재조합적으로 생산되는 세포의 세포 성분으로부터 그러한 단백질이 분리된 단백질의 제조물을 포함한다. 일부 구현예에서, "세포 물질이 실질적으로 없는"이라는 문구는 원하지 않는 단백질이 건조 중량을 기준으로 약 30% 미만, 바람직하게는 약 20% 미만, 더욱 바람직하게는 약 10% 미만, 그리고 가장 바람직하게는 약 5% 미만인 단백질의 제조물을 포함한다.
상기 SOD는 다음과 같은 정제 방법으로 정제하는 것이 바람직할 수 있지만, 이로 한정되지는 않는다. 예컨대, 앞서 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 균주를 배양하여 얻은 배양액을 원심분리하여 배양 상등액을 수집한다. 상등액 분획을 고체상 추출로 전처리하고, 이어서 크로마토그래피로 단리하고 정제한다. 다양한 방식의 크로마토그래피를 사용하여 SOD를 정제할 수 있다. 바람직하게는, 소수성 상호작용 크로마토그래피가 사용된다.
일부 구현예에서, 상기 SOD는 균주 용해물(lysate), 균주 배양물, 균주 배양 농축액, 균주 배양 추출물, 또는 그의 건조 형태로 포함될 수 있다. 이때, "균주 용해물"은 균주를 배양하여 기계적 또는 화학적으로 파쇄하여 얻은 것을 의미하며 이로부터 추출, 희석, 농축, 정제 등의 추가 공정을 거친 것을 모두 포함할 수 있다. "균주 배양물"은 균주를 배양하여 얻은 배양액 그 자체 또는 그의 상층액을 의미할 수 있다. "균주 배양 농축액"은 균주 배양물로부터 한외 여과, 황산암모늄 처리, 컬럼 정제, 농축 등을 통해 순수 분리된 것이거나, 한외 여과, 농축 등을 통해 얻어진 배양 농축액을 지칭한다. "균주 배양 추출물"은 상기 배양액 또는 그의 농축액으로부터 추출한 것을 의미하며, 추출액, 추출액의 희석액 또는 농축액, 추출액을 건조하여 얻어지는 건조물, 또는 이의 조정제물 또는 정제물, 이를 분획한 분획물을 포함할 수 있다. 상기 건조 형태는 동결 건조 형태를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 상기 SOD는 그것이 유래된 세포 또는 조직 공급원으로부터의 세포 물질, 예컨대 세포외 소포체(Extracellular vesicle)을 포함할 수 있다. 이 경우에 SOD를 포함하는 세포 물질은 상기 기술한 바와 같이 당업계에 알려진 통상의 기술을 사용하여 천연, 변이체 또는 재조합 숙주를 비롯한 다양한 공급원을 배양하여 그 배양액으로부터 여과, 농축 등의 방법으로 분리될 수 있다.
한편, 상기 바실러스 종 균주 포자는 바실러스 종 균주를 적합한 배지에서 배양하고 포자 형성을 유도한 후에 생성된 포자를 분리하여 얻어질 수 있다. 일 구현예에서, 바실러스 종 균주 포자는 약물 또는 식품에 사용하기에 일반적으로 안전한 것으로 간주되는 GRAS 세균으로부터 공급될 수 있다. 바실러스 종 균주 포자는 프로테아제 및 낮은 pH에 내성이 있는 것으로 알려져 있다(Cutting SM. Bacillus probiotics. Food Microbiol. 2011;28:214-220. doi: 10.1016/j.fm.2010.03.007; 및 Wang Y, et al., In vitro assessment of probiotic properties of Bacillus isolated from naturally fermented congee from inner Mongolia of China. World J. Microb. Biot. 2010;26:1369-1377. doi: 10.1007/s11274-010-0309-7). 또한, 바실러스 종 균주 포자는 여러 국가에서 승인된 GRAS 프로바이오틱스(probiotics)이다. 구체적으로, 상기 바실러스 종 균주 포자는 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 균주(예컨대, GF423 또는 GF424 균주)로부터 유래될 수 있다. 포자 형성은 당업계에 알려진 통상의 기술을 사용하여 유도될 수 있다. 예컨대, 균주를 전배양후 본배양시에 DSM, NB, SYP, LB2 등의 배지에서 포자 형성을 유도하여 얻어지는 균주의 포자로서, 천연, 변이체, 또는 재조합 숙주를 비롯한 다양한 공급원을 배양하여, 영양세포 제거 후, 여과, 농축, 혹은 원심분리를 통하여 분리할 수 있다.
일부 구현예에서, 상기 구강용 조성물은 SOD 및 바실러스 종 균주 포자를 포함할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에 따르면, SOD 및 바실러스 종 균주 포자가 조합된 혼합물을 구강에 적용하는 경우에 구취, 치석, 치태, 치아 우식증 또는 치주 질환(예컨대, 치은염 또는 치주염) 등의 예방, 개선 또는 치료에 우수한 효과를 나타내어 구강 건강 증진, 구강 위생 관리, 또는 구강 질환의 예방 또는 치료에 유효함을 확인하였다. 또한, 상기 혼합물은 구강 질환으로 인한 통증을 감소시키는 데에도 유효함을 확인하였다.
일부 구현예에서, 상기 SOD와 바실러스 종 균주 포자는 상기 효과를 발휘하기에 적당한 비율로 혼합될 수 있다. 예컨대, SOD와 바실러스 종 균주 포자는, SOD 역가가 건조중량 g당 5,000 내지 20,000 U가 되고 포자가 건조중량 g당 0.1 x 10^10 내지 1 x 10^11 cfu가 되도록 하는 비율로 혼합될 수 있다.
일부 구현예에서, 상기 조성물은 구강 건강 증진 또는 구강 위생 관리를 위해 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 상기 조성물은 구강 질환의 예방 또는 치료를 위해 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 상기 조성물은 구취, 치석, 치태, 치아 우식증 및 치주 질환으로부터 선택된 하나 이상의 질환을 예방, 개선, 또는 치료하기 위해 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 상기 조성물은 구강 통증을 감소시키기 위해 사용될 수 있다.
다른 구현예에서, 상기 조성물은 액체 형태, 고체 형태, 겔 형태, 분말 형태, 페이스트 형태, 또는 담체에 함침 또는 도포된 형태 등을 포함하여 당업계에 알려진 구강에 적용되는 다양한 형태를 가질 수 있다.
구강용 제품
본 발명의 다른 태양에 따르면, 상기 구강용 조성물을 포함하는 구강용 제품이 제공된다. 달리 말하면, 상기 구강용 제품은 상기 기술한 바와 같은 SOD 및 바실러스 종 균주 포자로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 포함한다.
상기 제품은 치약, 구강 세정제, 구강 청정제, 껌, 캔디류, 구강 스프레이, 구강 겔, 구강 연고제, 구강 패치 및 구강 양치액로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 구강용 제품은, 유효성분으로 SOD 및/또는 바실러스 종 균주 포자를 포함하는 것 외에, 그 제형화에 필요한 당업계에 공지된 추가 성분을 포함할 수 있다. 예컨대, 구강용 제품이 치약인 경우에, 연마제, 보습제, 발포제, 감미료, 미백제 또는 향미제 등을 추가로 포함할 수 있다. 또한, 구강용 제품이 구강 겔인 경우에, 겔의 점성 또는 점착을 위한 중쇄 지방산 등의 증점제 등을 추가로 포함할 수 있다. 또한, 구강용 제품이 구강 세정제인 경우에, 비독성 알코올과 같은 담체를 추가로 포함할 수 있다.
약학 또는 수의학적 조성물
본 발명의 다른 태양에 따르면, 상기 기술한 바와 같은 수퍼옥시드 디스뮤타제(SOD) 효소 및 바실러스 종 균주 포자로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 조성물을 포함하는 약학 조성물 또는 수의학적 조성물이 제공된다. 본 발명의 약학 조성물은 인간을 제외한 동물에 적용되는 경우에 수의학적 조성물이라는 용어와 상호 교환적으로 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 상기 조성물은 구강 질환의 예방 또는 치료를 위해 사용될 수 있다. 구체적으로, 상기 구강 질환은 구취, 치석, 치태, 치아우식증, 치주 질환 및 만성 구내염으로부터 선택된 하나 이상의 질환일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
일부 구현예에서, 상기 조성물은 구강 통증의 예방 또는 치료를 위한 것일 수 있다. 상기 구강 통증은 다양한 구강내 질환 또는 바람직하지 않은 상태로 인한 것일 수 있다. 예컨대, 구강 통증은 치석, 치태, 치아 우식증, 치주 질환 또는 만성 구내염으로 인한 것일 수 있다.
본 발명의 약학 또는 수의학적 조성물은 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 및 희석제로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 추가로 포함할 수 있다. 상기 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 및/또는 희석제는 당업계에 통상적으로 사용되는 것일 수 있다. 담체, 부형제 또는 희석제로는, 예를 들어, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 하이드록시 프로필 메틸 셀룰로오즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 이산화규소 등의 광물유 등을 들 수 있지만, 이에 제한되지 않는다.
제제화할 경우에는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 첨가제를 사용하여 조제될 수 있다. 상기 제제화를 위한 첨가제는 약제 분야에서 통상 사용하는 것 중에서 적합한 것을 선택할 수 있다.
또한, 본 발명의 약학 또는 수의학적 조성물은 사용 방법에 따라 바람직한 형태로 제형화될 수 있으며, 특히 포유 동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 채택하여 제형화될 수 있다. 그러한 제형의 구체적인 예로는 정제, 환제, 산제, 과립제, 시럽제, 액제, 캡슐제, 현탁제, 유제, 주사용액, 경고제(Plasters), 로션제, 리니멘트제, 리모나데제, 에어로졸제, 엑스제(Extracts), 엘릭실제, 연고제, 유동엑스제, 침제, 크림제, 연질 또는 경질 젤라틴 캡슐, 패치제 등이 있다.
더 나아가 본 발명의 약학 또는 수의학적 조성물은 당해 기술 분야의 공지된 적절한 방법을 사용하여 또는 레밍턴의 문헌(Remington's Pharmaceutical Science(최신판), Mack Publishing Company, Easton PA)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 바람직하게 제형화될 수 있다.
본 발명의 약학 또는 수의학적 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여 또는 비경구 투여될 수 있으며, 비경구 투여시 비강분무, 피부 외용 또는 복강내주사, 직장내주사, 피하주사, 정맥주사, 근육 내 주사 또는 흉부 내 주사 주입방식을 선택하는 것이 바람직하다. 또한, 본 발명의 약학 또는 수의학적 조성물은 구강 분무, 구강 도포, 구강내 주사 등 구강내 주입방식을 통해 적용되는 것이 바람직할 수 있다.
이때, 경구 투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 복합 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로스, 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제도 사용될 수 있다. 경구 투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 포함되며, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면, 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 사용될 수 있다. 경구 투여의 경우, SOD는 쉘락(shellac), 에틸 셀룰로오스, 히드록시프로필 메틸셀룰로스, 히드록시프로필 메틸셀루로스 프탈레이트, 제인(zein), 유드라짓(Eudragit) 및 이들의 조합과 같은 코팅제로 코팅될 수 있지만, 코팅제는 이로 한정되지 않는다.
비경구 투여를 위한 형태로는 치약, 구강세정제, 국소 투여제(예를 들어, 겔, 크림, 연고, 드레싱 용액, 분무제, 기타 도포제) 등을 들 수 있다. 상기 국소 투여제의 제형의 일 예로는, 본 발명의 유효 성분을 천연 섬유 또는 합성 섬유로 만든 거즈 등의 담체에 함침시킨 것일 수 있다. 상기 겔, 크림 또는 연고의 경우, 치아 및 잇몸을 포함한 환부 또는 충치 부위나 그 주위에 직접 도포하는데 적합할 수 있다. 상기 분무제의 경우, 통상적인 분무제 제조 방법으로 제조될 수 있고, 압축용기나 기타 분무용기에 충전포장하여 구강 질환 부위에 수시로 분무 도포하여 구강 질환을 예방하거나 치료할 수 있다. 상기 드레싱 용액의 경우, 통상적인 드레싱 용액의 제조 방법으로 제조될 수 있고, 구강 질환 부위에 드레싱하거나 기타 세균 감염 부위에 드레싱하여 구강 질환을 예방하거나 치료할 수 있다.
본 발명의 약학 또는 수의학적 조성물은 약학적으로 또는 수의학적으로 유효한 양으로 투여된다. 용어 "약학적으로 유효한 양" 또는 "수의학적으로 유효한 양"은 의학적 또는 수의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 환자 또는 동물의 체중, 성별, 연령, 건강상태, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.
본 발명의 약학 또는 수의학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 또한, 상기 약학 조성물은 필요에 따라 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이러한 양은 통상의 기술자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
식품 또는 사료 조성물
본 발명의 다른 태양에 따르면, 상기 기술한 바와 같은 수퍼옥시드 디스뮤타제(SOD) 효소 및 바실러스 종 균주 포자로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 조성물을 포함하는 식품 조성물이 제공된다. 이러한 식품 조성물은 의료용 또는 뉴트라슈티컬(nutraceutical) 식품 조성물을 포함한다.
용어 "의료용 식품" 또는 "뉴트라슈티컬 식품"은 인체에 유익한 기능을 할 가능성이 있는 원료 또는 성분으로 제조된 식품으로서, 정상적인 기능을 유지하거나 인체의 생리적 기능을 활성화함으로써 건강을 유지시키거나 개선시키는 식품을 지칭하고, 식품의약품안전처에 의해 규정되지만 이로 한정되지 않으며, 임의의 통상적인 건강 식품을 그 의미에서 배제하지 않는다.
또한, 상기 식품에는 각종 식품류, 식품 첨가제, 음료(예를 들어, 기능성 음료, 천연 과일 주스 및 야채 음료), 껌, 차, 비타민 복합제, 건강기능식품, 기타 기능성 식품 등이 포함되지만 이로 한정되지 않는다.
상기 식품은 당업계에 알려진 통상의 방법으로 제조될 수 있다. 예컨대, 상기 의료용 식품, 뉴트라슈티컬 식품 또는 건강기능식품은 구강 위생을 증진하거나 구강 질환을 예방하거나 개선시킬 목적으로 상기 SOD에 더하여 담체, 희석제, 부형제 및 첨가제 중 하나 이상을 추가로 포함하여 정제, 환제, 산제, 과립제, 분말제, 캡슐제 및 액제 제형으로 이루어진 군에서 선택된 하나로 제형화될 수 있다. 상기 담체, 부형제, 희석제 및 첨가제의 구체적인 예는 당업계에 잘 알려져 있으며 통상의 기술자는 그 제형에 따라 적절한 성분을 조합하여 제조할 수 있다.
상기 상술한 제형 내 유효성분으로서의 본 발명에 따른 수퍼옥시드 디스뮤타제 효소 및/또는 바실러스 종 균주 포자의 함량은 사용 형태 및 목적, 환자 상태, 증상의 종류 및 경중 등에 의하여 적절하게 조절할 수 있으며, 고형분 중량 기준으로 0.001 내지 99.9 중량%, 바람직하게는 0.01 내지 50 중량%일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다
본 발명의 식품의 투여 용량은 환자의 나이, 몸무게, 성별, 투여형태, 건강상태 및 질환 정도에 따라 달라질 수 있으며, 의사 또는 약사의 판단에 따라 일정 시간간격으로 1일 1회 내지 수회로 분할 투여할 수도 있다. 예컨대, 유효성분 함량을 기준으로 1일 투여량이 10 내지 1,000 ㎎/kg일 수 있다. 상기한 투여량은 평균적인 경우를 예시한 것으로서 개인적인 차이에 따라 그 투여량이 높거나 낮을 수 있다. 본 발명의 건강기능식품의 1일 투여량이 상기 투여 용량 미만이면 유의성 있는 효과를 얻을 수 없을 수 있으며, 그 이상을 초과하는 경우 비경제적일 뿐만 아니라 상용량의 범위를 벗어나므로 바람직하지 않은 부작용이 나타날 수 있다.
본 발명의 또 다른 태양에 따르면, 상기 기술한 바와 같은 수퍼옥시드 디스뮤타제(SOD) 효소 및 바실러스 종 균주 포자로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 조성물을 포함하는 사료 조성물이 제공된다. 또한, 본 발명의 사료 조성물은 당업계에서 통상적으로 이용되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 사료 조성물은 아미노산, 무기염류, 비타민, 항생물질, 항균물질, 항산화, 항곰팡이 효소, 다른 생균 형태의 미생물 제제 등과 같은 보조제 성분; 곡물, 예를 들면 분쇄 또는 파쇄된 밀, 귀리, 보리, 옥수수 및 쌀; 식물성 단백질 사료, 예를 들면 평지, 콩 및 해바라기를 주성분으로 하는 것; 동물성 단백질 사료, 예를 들면 혈분, 육분, 골분 및 생선분; 당분 및 유제품, 예를 들면 각종 분유 및 유장 분말로 이루어지는 건조성분; 지질, 예를 들면 가열에 의해 임의로 액화시킨 동물성 지방 및 식물성 지방 등과 같은 주성분; 영양보충제, 소화 및 흡수향상제, 성장촉진제, 질병 예방제와 같은 첨가제를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 사료 조성물은 분말 또는 액체 상태의 제제 형태일 수 있으며, 사료첨가용 부형제(탄산칼슘, 말분, 제올라이트, 옥분 또는 미강 등)를 포함할 수 있다.
구강 위생의 증진 또는 구강 질환의 예방 또는 치료를 위한 방법
본 발명의 또 다른 태양에 따르면, 상기 기술한 바와 같은 수퍼옥시드 디스뮤타제(SOD) 효소 및 바실러스 종 균주 포자로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 구강 위생의 증진을 위한 방법이 제공된다. 또한, 상기 기술한 바와 같은 수퍼옥시드 디스뮤타제(SOD) 효소 및 바실러스 종 균주 포자로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 구강 질환을 예방하거나 치료하는 방법이 제공된다.
일부 구현예에서, 상기 방법은 SOD 및 바실러스 종 균주 포자를 조합하여 개체에 투여하는 단계를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 상기 구강 질환은 구강 통증, 구취, 치태, 치석, 치아 우식증 및 치주 질환으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 SOD 및 바실러스 종 균주 포자는, 조합 투여되는 경우에, 단일 조성물 또는 각각을 함유한 별개 조성물로서 동시에 투여될 수 있다. 또한, 상기 SOD 및 바실러스 종 균주 포자는 각각을 함유한 별개 조성물로서 순차적으로 또는 역순으로 투여될 수 있다. 동시 투여 또는 별개 투여의 경우에, SOD 및 바실러스 종 균주 포자는 그 투약 형태에 따라 동일한 경로 또는 상이한 경로로 투여될 수 있다. 상기 조성물, 투약 형태, 투여 경로 등에 관해서는 조성물에 대해 상기 기술한 바와 같다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐이고 본 발명의 범위가 하기 실시예로 한정되는 것은 아니다.
실시예
실시예 1.
바실러스 아밀로리쿼파시엔스
균주로부터 수퍼옥시드 디스뮤타아제의 분리 및 정제
본 실시예에 사용된 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 균주는 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 GF423 균주 및 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 GF424 균주이며, 이들 균주는 한국생명공학연구원에 각각 2017년 3월 6일자 및 2017년 3월 13일자로 수탁번호 KCTC 13222 BP 및 수탁번호 KCTC 13227BP로 기탁된 것이다.
상기 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 GF424 균주는 sodA 유전자의 발현을 개선하기 위해 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 GF423 균주에 UV를 조사하여 돌연변이를 유발시켜 얻은 균주이다.
실시예 1.1.
바실러스 아밀로리쿼파시엔스
GF423 또는 GF424 균주의 배양
바실러스 아밀로리쿼파시엔스 GF423 또는 GF424 균주의 배양을 위해, LB 한천 배지(LB(Luria-Bertani) 한천; 트립토판 10 g/L, 효모 추출물 5 g/L, NaCl 10 g/L, 한천 15 g/L)에서 형성된 단일 콜로니를 LB 배지 30 ml에 접종하고, 37℃에서 12시간 동안 배양하였다. 이 종 배양액(seed culture)을 다시 1 mM 황산망간(MnSO4)이 포함된 LB 배지 3 L에 접종하고, 37℃에서 20시간 동안 배양하였다.
실시예 1.2. 수퍼옥시드 디스뮤타아제(SOD)의 분리 및 정제
실시예 1.1에서 얻은 세포 배양액을 4℃, 3,578 x g에서 20분간 원심분리하여 상등액을 취한 후, 초미세여과(Ultrafiltration, 이하 UF, MWCO 10,000)를 이용하여 10배 농축하였다. 농축액을 제균 필터로 여과한 후, 동결건조하였다. SOD의 활성은 SOD 분석 키트(Cayman Chemical, Michigan, USA)를 이용하여 분석하였다. SOD 활성 1 단위(unit)는 수퍼옥시드 라디칼을 50% 억제하는 효소의 양으로 정의된다. 건조된 SOD 효소의 활성은 30 ± 6 U/mg이었다.
실시예 2.
바실러스 아밀로리쿼파시엔스
균주 포자의 준비
실시예 2.1. 배지 조성
본 실시예에 사용된 배지는 SYP 또는 DSM였다. SYP 배지는 1.5% 소이톤(soy tone), 0.5% 효모 추출물, 0.5 % K2HPO4, 0.1% MnSO4, 0.1% MgSO4, 10 mM FeSO4, 0.04% (NH4)2SO4, 0.04% (NH4)2PO4, 0.1% CaCl2 및 2% 포도당을 함유한다. DSM 배지는 박토 영양 브로쓰 8 g/L, KCl 1 g/L, MgSO4 0.25 g/L, Ca(NO3)2 0.16415 g/L, MnCl2 0.9521 mg/L 및 FeSO4 0.152 mg을 함유한다. MnSO4, MgSO4, FeSO4, (NH4)2SO4, (NH4)2PO4 및 CaCl2는 사용 전에 ddH2O에 용해시켜 첨가하였다.
실시예 2.2. 포자형성 유도
바실러스 아밀로리쿼파시엔스 균주 GF423 또는 GF424의 단일 콜로니를 14 mL 튜브에 들어있는 LB 1 mL에 접종하고, 37℃ 및 200 rpm에서 12 시간 동안 배양하였다. 배양액 1 mL를 500 mL 플라스크 내의 LB 배지 50 mL로 옮기고, 37℃ 및 200 rpm에서 12 시간 동안 배양하였다. 이후, 20 mL의 배양 배지를 2.5 L 배플 플라스크 내의 SYP 또는 DSM 1 L로 옮겼다. 접종된 배양액을 37℃ 및 200 rpm에서 24 시간 내지 120 시간 동안 배양하였다.
실시예 2.3. 포자 세척
배양 후, 라이소자임(0.5 g/L)을 배양 브로쓰에 첨가하고, 37℃ 및 200 rpm에서 1 시간 동안 배양하여 남아있는 영양 세포를 제거하였다. 6000 rpm에서 10 분 동안 원심분리하여 미정제 포자를 수거하였다. 수거된 미정제 포자를 물로 2회 세척하고, 0.02% SDS로 세척하고, 다시 물로 2회 세척하고, 이어서 PBS 용액에 현탁시킴으로써 정제하였다. 포자 현탁액을 -20℃에서 보관하였다. 희석된 포자 용액을 LB 한천 플레이트에 도말한 후 콜로니를 계수함으로써 포자 수를 결정하였다.
실험예 1. 동물 시험: 개
실시예 1에서 정제된 수퍼옥시드 디스뮤타아제(SOD)와 실시예 2에서 준비된 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 균주 포자의 혼합물이 구강 건강 증진 및 구강 위생 관리 효과를 나타내는지 확인하기 위해 비글견(beagle dog)을 이용한 시험을 수행하였다. 본 시험은 동물보호법에 근거한 ㈜차온의 동물실험윤리위원회에 의해 승인되었다(IACUC 승인번호: CE21115).
실험예 1.1. 시험 물질
사용한 시험 물질은 실시예 1에서 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 GF424로부터 정제된 수퍼옥시드 디스뮤타아제(SOD)와 실시예 2에서 제조된 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 GF423 균주 포자를 혼합하여 제조하였다(2.5% 혼합물, SOD 10,000 U/g).
구체적으로, 상기 혼합물은, 상온에서 구강 겔의 점성/점착 유지를 위한 라우르산과 같은 중쇄지방산 등을 용해하여 원하는 점도로 맞추고, 비테인, 올리고당, 난황 등 기호성 성분을 혼합한 후, 최종적으로 상기 SOD와 포자 2.5%(SOD 역가: 12,510 U/g, 포자: 1.2 x 10^10 CFU/g)를 균질 혼합함으로써 얻었다. 이러한 혼합물(SOD + 포자)을 겔 타입인 구강 겔 형태로 튜브에 담아 사용하였다(20 g/튜브, 250 U/g 겔).
실험예 1.2. 시험 동물 및 사육 환경
㈜오리엔트 바이오로부터 3년령 이상이고 구강 임상 증상이 없는 9 내지 13 kg의 수컷 비글견(non-naive) 16마리를 구입하고, 1개월 이상의 휴약기를 가졌다.
온도 23±3℃, 상대 습도 30±10 %, 환기 횟수 10 내지 15 회/시간, 조명 12 시간, 조도 150 내지 200 Lux의 환경 조건을 갖춘 사육실을 이용하였고, 순화 및 시험 기간 동안 스테인레스로 제작된 케이지에 케이지당 1마리씩 개별 사육하였다. 사료와 음용수는 자율 급이하였다.
시험 동물로 비글견을 선택한 이유는 비글견이 치은염 등 구강 관련 효능 평가 시험에 널리 사용되고 있으며, 풍부한 기초 시험 자료가 축적되어 있어 시험 결과의 해석 및 평가가 용이하기 때문이었다.
실험예 1.3. 시험군 구성
하기와 같이 시험군 G1("G1_Vehicle") 및 G2("G2_BASOD")를 구성하였다.
실험예 1.4. 시험 물질의 투여
실험예 1.1의 시험 물질을 4주간 매일 잇몸(양쪽 상악 대구치 외측 치은 부위)에 도포하여 투여하였다. 투여량은 1회 0.25 g(SOD 62.5 U)/head로 1일 2회 투여하였다.
실험예 1.5. 시험 평가 항목
(1) 구취 지수(Halitosis index)
0주차(투여 시작 전), 2주차, 및 4주차에 구취를 관능검사에 의해 평가하였다(아래의 표 참조).
(2) 치석 지수(Calculus index)
0주차(투여 시작 전), 2주차, 및 4주차에 치석 지수를 치면이 노출되게 입을 벌린 후, 치면의 사진을 촬영하고 육안으로 관찰하여 치석 지수를 산출하였다(아래의 표 및 도 1 참조).
(3) 치태 지수(Plaque index)
0주차(투여 시작 전), 2주차, 및 4주차에 치태 착색제를 이용하여 치태를 염색한 후 치면을 사진 촬영하고, 치태 착색제가 치아 표면을 덮고 있는 부위를 전체 치아 표면의 % 비율로 환산하여 치태 지수를 산출하였다(아래의 표 참조).
(4) 치은염 지수(Gingival index)
0주차(투여 시작 전), 2주차, 및 4주차에 치면 및 치아 주위 잇몸이 노출되게 입을 벌린 후 사진을 촬영하고, 육안으로 관찰하여 치은염 지수를 산출하였다(아래의 표 및 도 2 참조).
(5) 기타 이상 반응
시험 물질의 투여 기간 동안 기타 이상 반응이 관찰될 경우, 해당 증상을 기록하였다.
실험예 1.6. 통계학적 방법
시험군 내에서 시험 물질 처리 전후의 비교를 위해 paired sample t-test를 사용하여 통계학적 유의성을 검정하였고, 통계 처리 방법으로는 상용으로 널리 사용되는 통계 패키지인 Graphpad prism 5.01 프로그램을 이용하였다.
실험예 1.7. 시험 결과 및 고찰
(1) 구취 지수
혼합물을 투여한 모든 동물의 경우, 투여 후 4주차까지 통계적으로 유의미한 관찰은 할 수 없었지만, 구취 지수가 감소하는 경향이 나타남을 확인할 수 있었다(표 3 및 도 3).
(2) 치석 지수
SOD와 포자의 혼합물을 투여한 모든 동물의 경우, 투여 후 4주차까지 치석이 점차 제거되는 경향이 나타났으며, 특히 4주차에는 0주차에 비해 통계적으로 치석 지수가 통계적으로 유의하게 감소하였다(p<0.05)(표 4 및 도 4). 표 4 및 도 4에서, 통계적 유의성은 paired sample t-test로 검증되었다.
(3) 치태 지수
SOD와 포자의 혼합물을 투여한 모든 동물의 경우, 투여 후 4주차까지 통계적으로 유의한 것으로 관찰되지는 않았지만, 치태 지수가 감소하는 경향을 확인할 수 있었다(표 5 및 도 5).
(4) 치은염 지수
SOD와 포자의 혼합물을 투여한 모든 동물의 경우, 투여 후 4주차까지 잇몸의 출혈이 없어지고, 부종 및 발적이 개선되는 효능이 관찰되었으며, 특히 4주차에는 0주차에 비해 치은염 지수가 통계적으로 유의하게 감소하였다(p<0.01)(표 6 및 도 6). 표 6 및 도 6에서, 통계적 유의성은 paired sample t-test로 검증되었다.
(5) 고찰
시험 물질인 SOD와 포자의 혼합물을 1회 0.25 g(SOD 62.5 U)/head의 용량으로 매일 2회 비글견의 잇몸에 도포한 결과, 투여 후 2주차부터 4주차까지 0주차에 비해 구취 지수, 치석 지수, 치태 지수, 및 치은염 지수 모두가 감소하는 경향을 확인할 수 있었다. 특히 치석 및 치은염은 0주차에 비해 통계적으로 유의하게 증상이 개선되었다. 또한, 시험 전과정에서 특별한 이상 반응은 나타나지 않아 시험 물질은 유해성이 없음을 확인하였다.
위와 같은 결과를 토대로 판단하였을 때, 시험 물질인 SOD와 포자의 혼합물은 구취, 치석, 치태 및 치은염과 같은 구강 질환을 개선하는 데에 유용함을 확인할 수 있었다.
실험예 2. 동물 시험: 고양이
실시예 1에서 정제된 수퍼옥시드 디스뮤타아제(SOD)가 구강 건강 증진 및 구강 위생 관리 효과를 나타내는지 확인하기 위해 반려묘를 이용한 시험을 수행하였다.
실험예 2.1. 시험 물질
사용한 시험 물질은 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 GF423 균주 포자를 제외하고 실험예 1.1에서와 동일하게 제조하였다.
실험예 2.2. 시험 동물
성별이나 품종과 무관하게 생후 6개월령 이상이고 체중 1 kg 이상 10 kg 이내인 반려묘 중에서 구취 및 통증으로 인한 기력 저하, 저작 곤란, 식욕 저하, 침 흘림, 잇몸 발적(미란 및 증식성 궤양의) 등의 구강 증상을 보이는 환묘를 피험묘로서 무작위로 선별하였다.
실험예 2.3. 시험군 구성
각각의 피험묘 보호자로부터 자의에 의해 임상 시험에 참여한다는 동의를 받은 후, 피험묘들에 대해 무작위배정을 실시하였다.
시험군 G1의 경우, 품종은 믹스종(mixed), KSH(Korean short hair), Exotic, 또는 Siamese이고, 성별은 중성화된 수컷(NM) 또는 중성화된 암컷(SF)이고, 연령은 2세 내지 10세였다.
시험군 G2의 경우, 품종은 T.A.(Turkish Angora) 또는 KSH(Korean short hair)이고, 성별은 중성화된 수컷(NM) 또는 중성화된 암컷(SF)이고, 연령은 1세 내지 11세였다.
실험예 2.4. 시험 물질의 투여
실험예 2.1의 시험 물질을 4주간 매일 우측 상악 대구치 치은 부위에 도포하여 투여하였다. 투여량은 1회 0.3 g(SOD 75 U)/head로 1일 2회 투여하였다.
실험예 2.5. 시험 평가 항목
임상 시험의 시작 전에 피험묘의 혈액 검사(ALT(알라닌 아미노전이효소) 등) 및 기본 신체 검사(체중 등)를 진행하였다.
(1) 사료 섭취
0주차(투여 시작 전), 2주차, 및 4주차에 피험묘의 사료 섭취량을 평가하였다(아래의 표 참조).
(2) 활동성(기분)
0주차(투여 시작 전), 2주차, 및 4주차에 피험묘의 활동성(기분)을 관찰하여 평가하였다(아래의 표 참조).
(3) 촉진성 통증 지수
0주차(투여 시작 전), 2주차, 및 4주차에 피험묘의 질환부위를 손으로 만졌을 때, 나타나는 반응을 관찰하여 촉진성 통증을 평가하였다(아래의 표 참조).
(4) 구취 지수
0주차(투여 시작 전), 2주차, 및 4주차에 구취를 관능검사에 의해 평가하였다(아래의 표 참조).
(5) 치태 지수
0주차(투여 시작 전), 2주차, 및 4주차에 치태 착색제를 이용하여 우측 대구치를 염색한 후, 치태 착색제가 치아 표면을 덮고 있는 부위를 전체 치아 표면의 % 비율로 환산하여 치태 지수를 산출하고(아래의 표 참조) 사진을 촬영하였다.
(6) 치석 지수
0주차(투여 시작 전), 2주차, 및 4주차에 치석을 우측 상악 대구치에서 육안으로 관찰하여 치석 지수를 산출하고(아래의 표 및 도 1 참조) 사진을 촬영하였다.
(7) 치은염 지수
0주차(투여 시작 전), 2주차, 및 4주차에 우측 상악 대구치의 치은 부위를 육안으로 관찰하고, 아래 표의 기준으로 점수를 측정한 후 합계 점수를 계산하여 치은염 지수를 산출하고 사진을 촬영하였다.
(8) 기타 이상 반응
유효성 확인을 위한 시험 물질의 투여 기간 동안 나타나는 모든 이상 반응(식욕상실, 구토, 설사, 혈변, 토혈, 무기력, 위장관 장애 등)을 보호자 또는 시험 관리자가 관찰하여 기록하였다.
실험예 2.6. 통계학적 방법
시험군 내에서 시험 물질 처리 전후의 비교를 위해 paired sample t-test를 사용하여 통계학적 유의성을 검정하였고, 통계 처리 방법으로는 상용으로 널리 사용되는 통계 패키지인 Graphpad prism 5.01 프로그램을 이용하였다.
실험예 2.7. 시험 결과 및 고찰
(1) 사료 섭취량 및 체중
사료 섭취량 및 체중은 시험 기간 동안 모든 군에서 유의한 차이가 관찰되지 않았다(데이터는 제시되지 않음).
(2) 활동성
vehicle 대조군에서 활동성이 2주차부터 유의하게 개선되었고, SOD 군에서는 활동성이 점차적으로 증가하는 경향을 보였으나 통계적 유의성은 없었다(데이터는 제시되지 않음).
(3) 촉진성 통증 지수
vehicle 대조군에서는 촉진성 통증이 시험 종료시까지 거의 변화가 없었으나, SOD 군에서는 촉진성 통증이 2주차부터 감소하여 4주차에 통계적으로 유의하게 개선되었다(도 7).
(4) 구취 지수
vehicle 대조군에서는 구취 지수가 시험 종료시까지 변화가 없었으나, SOD 군에서는 구취 지수가 지속적으로 감소하는 경향을 확인할 수 있었다(도 8).
(5) 치태 지수
vehicle 대조군에서는 치태 지수가 시험 기간 동안 확연히 증가한 반면, SOD 군에서는 치태 지수가 2주차부터 시험 종료시까지 통계적 유의성을 보이며 감소하였다(도 9).
(6) 치석 지수
vehicle 대조군에서는 치석 지수가 점차 증가한 반면, SOD 군에서는 치석 지수가 4주차에 통계적유의성을 보이며 감소하였다(도 10).
(7) 치은염 지수
vehicle 대조군에서는 치은염 지수에 별다른 변화가 없었지만, SOD 군에서는 2주차부터 치은염 지수가 감소하여 4주차에 통계적으로 유의한 감소가 확인되었다(도 11).
(8) 고찰
시험 물질인 SOD를 1회 0.3 g(SOD 62.5 U)/head의 용량으로 매일 2회 반려묘의 잇몸에 도포한 결과, 투여 후 2주차부터 4주차까지 0주차에 비해 구취 지수, 촉진성 통증 지수, 치태 지수, 치석 지수, 및 치은염 지수 모두가 감소하는 경향을 확인할 수 있었다. 특히, 촉진성 통증, 치태, 치석, 및 치은염은 0주차에 비해 통계적으로 유의하게 증상이 개선되었다. 또한, 시험 전과정에서 특별한 이상 반응은 나타나지 않아 시험 물질은 유해성이 없음을 확인하였다.
위와 같은 결과를 토대로 판단하였을 때, 시험 물질인 SOD 단독 투여의 경우에도 구취, 치태, 치석 및 치은염과 같은 구강 질환을 개선하는 데에 유용할 뿐만 아니라 그러한 구강 질환으로 인한 통증을 감소시키는 데에도 유용함을 확인할 수 있었다.
Claims (21)
- 수퍼옥시드 디스뮤타제(SOD) 및 바실러스 종 균주 포자로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 유효성분으로 포함하는
구강용 조성물로서,
상기 SOD는 바실러스 종 균주로부터 유래된 것인
구강용 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 조성물은 SOD 및 바실러스 종 균주 포자를 포함하는
조성물. - 삭제
- 제1항에 있어서,
상기 바실러스 종 균주는 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 GF423 균주(KCTC 13222 BP) 또는 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 GF424 균주(KCTC 13227 BP)를 포함하는
조성물. - 제1항에 있어서,
상기 SOD는 Mn-SOD 또는 탈아미드화된 Mn-SOD를 포함하는
조성물. - 제1항에 있어서,
상기 SOD는 서열번호 2 또는 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는
조성물. - 제1항에 있어서,
상기 바실러스 종 균주 포자는 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 GF423 균주(KCTC 13222 BP)의 포자 또는 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 GF424 균주(KCTC 13227 BP)의 포자를 포함하는
조성물. - 제1항에 있어서,
상기 조성물은 구강 건강 증진 또는 구강 위생 관리를 위해 사용되는
조성물. - 제1항에 있어서,
상기 조성물은 구강 통증, 구취, 치석, 치태, 치아 우식증 또는 치주 질환의 예방 또는 개선을 위해 사용되는
조성물. - 제1항에 있어서,
상기 조성물은 겔 또는 페이스트 형태인
조성물. - 제1항, 제2항 및 제4항 내지 제10항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는
구강용 제품. - 제11항에 있어서,
상기 제품은 치약, 구강 세정제, 구강 청정제, 껌, 캔디류, 구강 스프레이, 구강 겔, 구강 연고제, 구강 패치, 및 구강 양치액으로부터 선택된 어느 하나를 포함하는
제품. - 제1항, 제2항 및 제4항 내지 제10항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는
구강 질환의 예방 또는 치료를 위한 약학 조성물로서,
상기 구강 질환은 구취, 치석, 치태, 치아우식증, 치주 질환 및 만성 구내염으로부터 선택된 하나 이상의 질환인
약학 조성물. - 제1항, 제2항 및 제4항 내지 제10항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는
수의학적 조성물. - 제1항, 제2항 및 제4항 내지 제10항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는
식품 조성물. - 제1항, 제2항 및 제4항 내지 제10항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는
사료 조성물. - 수퍼옥시드 디스뮤타제(SOD) 및 바실러스 종 균주 포자로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 인간을 제외한 개체에 투여하는 단계를 포함하는
구강 질환을 예방하거나 치료하는 방법으로서,
상기 SOD는 바실러스 종 균주로부터 유래된 것인
방법. - 수퍼옥시드 디스뮤타제(SOD) 및 바실러스 종 균주 포자로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 개체에 투여하는 단계를 포함하는
구강 위생을 증진하는 방법으로서,
상기 SOD는 바실러스 종 균주로부터 유래된 것인
방법. - 제17항 또는 제18항에 있어서,
SOD 및 바실러스 종 균주 포자를 개체에 투여하는 단계를 포함하는
방법. - 제19항에 있어서,
상기 SOD 및 바실러스 종 균주 포자는 하나의 조성물로 또는 각각을 함유하는 별개의 조성물로 투여되는
방법. - 제19항에 있어서,
상기 SOD 및 바실러스 종 균주 포자는 동시에, 순차적으로 또는 역순으로 투여되는
방법.
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