KR102555748B1 - 항균, 항진균, 항염 활성 및 치아 우식 억제 활성을 갖는 신규한 스트렙토코커스 살리바리우스 균주 kccm13161p 및 이를 포함하는 구강용 조성물 - Google Patents
항균, 항진균, 항염 활성 및 치아 우식 억제 활성을 갖는 신규한 스트렙토코커스 살리바리우스 균주 kccm13161p 및 이를 포함하는 구강용 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 항균, 항진균, 항염 활성를 갖는 신규한 스트랩토코커스 살리바리우스(S. salivarius G7, KCCM13161P) 균주 및 이를 포함하는 구강 질환의 예방 또는 개선용 조성물, 구강용 프로바이오틱스에 관한 것으로, 구체적으로는 신규한 스트랩토코커스 살리바리우스(S. salivarius G7, KCCM13161P) 균주는 치주질환을 유발하는 균주에 강한 항균 활성 및 항염 활성으로 치주질환을 예방, 치료 및 개선하고, 치아우식을 유발하는 균주에 강한 항균 활성 및 바이오필름 생성 억제능으로 충치발생을 예방, 치료 및 개선하며, 구강 질환에 의하여 발생하는 구취를 억제하여 구강 건강 개선에 기여할 수 있다.
Description
본 발명은 항균, 항진균, 항염 활성 및 치아 우식 억제 활성을 갖는 신규한 스트렙토코커스 살리바리우스 균주 및 이를 포함하는 구강용 조성물에 관한 것이다.
구강 내 감염성 질환은 치은(잇몸, gingival)과 치아(이빨, dental)성 질환으로 구분할 수 있으며, 이러한 감염성 질환은 다종의 세균으로 형성된 바이오필름(biofilm)과 관련이 있다. 건강한 사람의 경우 바이오필름은 공생 박테리아의 비율이 높은 다종 세균으로 균형을 맞추어 형성된다. 그러나 이러한 균형이 무너져 특정 세균이 증식하게 되면 이는 구강질환으로 이어진다.
악티노마이세스 이스라엘리(Actinomyces israelii)와 악티노마이세스 나이슬런디(Actinomyces naeslundii)는 대표적인 치은염 원인균이며, 스트렙토코커스 뮤탄스(충치균, Streptococcus mutans)와 스트렙토코커스 소브리너스(Streptococcus sobrinus)는 치아우식성 세균으로 알려져 있다(Howell A. et al., 1962; Loesche WJ. et al., 1978). 이들 세균은 산 생성능(acidogenesis)과 산 내성능(aciduricity)의 특징을 가지고 있어 치아우식증을 유발한다(Conrads G et al., 2014). 또한 엔테로코커스 페칼리스(Enterococcus faecalis)는 인간 장내구균의 우세종으로 항생제 내성 특성으로 인해 근관감염, 치주염, 임플란트 주위염 등의 구강질환에 관여한다(Dahlen G., et al., 1993; Rams TE., et al., 2013).
한편, 일부 균주는 구강 내 사용을 목적으로 하는 프로바이오틱스로 이용될 수 있다(Li X., 2021; Hale JDF., et al., 2022). 이러한 세균은 세균 간의 서식처를 놓고 경쟁하는 과정에서 박테리오신(bacteriocin)을 생산하여 주변의 세균을 억제한다. 스트렙토코커스 살리바리우스(Streptococcus salivarius)도 박테리오신과 유사한 salivaricin A, salivaricin B, salivaricin 9 및 salivaricin G3216-18과 같은 다양한 종류의 란티바이오틱스(lantibiotics)를 생산한다(Wescombe PA., et al., 2006). 스트렙토코커스 살리바리우스(Streptococcus salivarius)는 그람양성 통성혐기성 세균으로 사람의 점막 표면에 서식하는 공생세균으로 활동하면서(Aas JA., et al., 2005) 병원체에 대한 장벽을 형성하고 부착 및 집락을 감소시키는 중요한 생태학적 역할을 하여(Wescombe PA., et al., 2006), 구강용 프로바이오틱스 사용 가능성은 꾸준히 제기되고 있다.
또한 최근 다양한 연구논문을 통해 구강 내 존재하고 있는 유해균이 전신질환(루프스, 전신경화증, 염증성 장질환, 치매 등)에 악영향을 미친다는 결과들이 발표되고 있으며, 구강내 미생물 밸런스를 유지하는 것이 치아 건강은 물론 전신 건강에도 영향을 줄 수 있다는 개념으로 확장되고 있다.
전신질환은 대부분 인체에 정상 세균총의 균형이 깨지거나 외부 미생물의 침입과 증식에 의해서 발생되는 것으로 알려져 있다. 따라서 미생물의 생장을 억제하는 항생제를 사용하기 보다 항균효과를 가지면서도 미생물 생태계를 유지시킬 수 있는 구강용 프로바이오틱스를 이용하는 것이 국민 건강을 증진하는데 도움을 줄 수 있다.
이에 따라 넓은 항균 활성을 갖는 구강용 프로바이오틱스의 개발이 시급한 실정이다.
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본 발명의 목적은 높은 항균, 항진균, 항염 효과를 갖는 신규한 스트렙토코커스 살리바리우스 균주 및 이를 포함하는 구강용 조성물을 제공하는 데 있다.
상기 과제를 해결하기 위하여 본 발명은 항균, 항진균, 항염 활성를 갖는 신규한 스트렙토코커스 살리바리우스(S. salivarius G7, KCCM13161P) 균주를 제공한다.
상기 항균 활성는 아그레가티벡터 악티노마이세텀코미탄스(Aggregatibacter actinomycetemcomitans), 악티노마이세스 이스라엘리(Actinomyces israelii), 악티노마이세스 내슬런디(Actinomyces naeslundii), 엔테로코쿠스 페칼리스(Enterococcus faecalis), 후소박테리움 뉴클레아툼(Fusobacterium nucleatum), 포르피로모나스 진지발리스(Porphyromonas gingivalis), 프레보텔라 인터미디어(Prevotella intermedia , Bacteroides intermedius), 프레보텔라 니그레센스(Prevotella nigrescens), 스트렙토코쿠스 뮤탄스(Streptococcus mutans), 스트렙토코커스 소브리너스(Streptococcus sobrinus), 폐렴구균(Streptococcus pneumoniae), 스트렙토코쿠스 피오게네스(Streptococcus pyogenes), 악티노마이세스 비스코서스(Actinomyces viscosus), 대장균(Escherichia coli) 및 황색포도상구균(Staphylococcus aureus)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1 이상에 대한 항균 활성을 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 ‘아그레가티벡터 악티노마이세텀코미탄스(Aggregatibacter actinomycetemcomitans)’는 대표적인 치은염 유발 세균의 하나이며, 국소 공격성 치주염과 관련되는 그람 음성, 통성 혐기성 비운동성 박테리아이다. A. actinomycetemcomitans는 드물게 심내막염과 같은 비구강 감염을 일으키며, 외독소로 류코톡신(leukotoxin, LT)과 세포독성 팽창성 독소(cytolethal distending toxin, Cdt)를 생성시킨다. 외독소 LT는 단핵구(monocyte), 중성구(호중구)와 일부 림프구의 원형질막에 구멍을 형성하여 세포를 손상시킴으로써 면역을 저해하며, Cdt는 DNA분해효소로 상피세포, 치은 섬유모세포와 림프구를 포함한 여러 세포의 세포분열을 억제하여 세포분열이 억제된 일부 세포에서는 세포자멸사(apoptosis)를 유도시킨다. 내독소로는 지질다당류(lipopolysaccharide, LPS)를 분비하여 대식세포의 전염증성 사이토카인(IL-1, TNF) 생성을 유도하고 뼈흡수와 아교질 파괴를 유도한다.
본 발명에서 ‘악티노마이세스 이스라엘리(Actinomyces israelii)’는 정상인의 질, 결장 및 입에서 공생하며, 개체 면역력이 떨어졌을때 감염병을 일으키는 기회주의 병원성 세균으로 치은염을 유발한다. 또한 방선균증은 A. israelii에 의해 가장 흔하게 발생하며, 항생제로 치료할 수 있다.
본 발명에서 ‘악티노마이세스 내슬런디(Actinomyces naeslundii)’는 세균성 질염이 있는 여성 및 인간의 입에서 발견되는 그람 양성 막대 모양의 박테리아로 충치를 포함하는 다양한 치주 질환과 관련이 있으며, 특히 치은염을 쉽게 유발한다.또한 A . naeslundii는 방선균증의 원인이 되며, 부종과 고름을 분비할 수 있는 농양을 형성하고, 조직 섬유증을 동반할 수도 있다. A. naeslundii는 입, 얼굴 및 목에 흔히 감염되나 드물게 흉부, 복부, 골반 및 중추 신경계에도 감염을 일으킬 수 있다.
본 발명에서 ‘엔테로코쿠스 페칼리스(Enterococcus faecalis)’는 사람과 다른 포유 동물의 위장관에 서식하는 그람 양성, 공생 세균으로 대표적인 치근단염증 유발 세균 중 하나이다. 치아 뿌리관(치근관(齒根管)) 치료를 한 치아에서 흔히 보균률의 30-90% 범위로 발견되며, 재감염된 치근관 치료 치아는 1차 감염의 경우보다 E. faecalis를 보유할 가능성이 약 9배 더 높은 것으로 알려져 있다. 드물게 심내막염, 패혈증, 요로 감염(UTI), 수막염 및 기타 사람의 감염을 유발할 수 있으며, 많이 사용되는 항균제인 아미노글리코사이드, 아즈트레오남, 세팔로스포린, 클린다마이신, 반합성 페니실린류 나프실린과 옥사실린, 트리메토프림/설파메톡사졸에 저항성을 나타내는 다중 약물 내성(Multi drug resistance, MDR)을 갖는 것으로 알려져 있다.
본 발명에서 ‘후소박테리움 뉴클레아툼(Fusobacterium nucleatum)’은 인간의 구강에 공생하는 그람 음성 세균으로 치주염을 유발하는 대표적인 세균 중 하나로, 구강 내 다른 박테리아 종과 응집하는 능력으로 인해 치주 플라크를 구성하는 주요 요소가 된다. 이 외에도 많은 연구에서 태아의 조산, 결장직장암과 연관성이 입증되었다.
본 발명에서 ‘포르피로모나스 진지발리스(Porphyromonas gingivalis)’는 비운동성, 그람 음성, 막대 모양, 혐기성, 병원성 박테리아로 대표적인 치주염 유발 세균이다. P. gingivalis는 치주염이 있는 구강과 상부 위장관, 호흡기관 및 결장에서 발견되며, 알츠하이머병 및 류마티스 관절염과도 관련이 있는 것으로 알려졌다.
본 발명에서 ‘프레보텔라 인터미디어(Prevotella intermedia , Bacteroides intermedius)’는 치은염 및 치주염을 포함하는 치주 감염에 관여하는 그람 음성 절대 혐기성 병원성 세균이며, 종종 급성 괴사성 궤양성 치은염에서 발견된다. P. intermedia는 스테로이드 호르몬을 성장 인자로 사용하므로 임산부에서 더 많이 발견되고, 세균성 질염이 있는 여성에게서도 분리된다.
본 발명에서 ‘프레보텔라 니그레센스(Prevotella nigrescens)’는 그람 음성균이며, 정상 구강 세균총의 일부이며, 기회성 치주염 유발 세균 중 하나로, 치주 질환 이외에 비인두 및 복강내 감염, 경동맥 죽상동맥 경화증과 관련이 있는 것으로 알려졌다.
본 발명에서 ‘악티노마이세스 비스코서스(Actinomyces viscosus)’는 성인 인간의 70%의 입에 서식하는 그람 양성, 통성 혐기성 세균이다. A. viscosus는 동물에서 치주 질환을 일으키고 인간의 치석 및 치근 표면 우식증뿐만 아니라 심내막염을 일으킬 수 있으며, 매우 드물게 폐 감염을 일으킬 수 있다.
본 발명에서 ‘스트렙토코쿠스 뮤탄스(Streptococcus mutans)’는 충치균으로도 알려져 있으며, 락토바실러스와 함께 충치의 주원인균이다. S. mutans는 치아 우식을 유발하여 치아를 검은색으로 변색시켜 썩게 만든다.
본 발명에서 ‘스트렙토코커스 소브리너스(Streptococcus sobrinus)’는 그람 양성, 비운동성 및 혐기성 세균으로, Streptococcus mutans 와 결합하여 치아 내 충치 형성을 촉진한다. 특히 S. sobrinus는 S. mutans 보다 우식의 유병률과 더 밀접한 관련이 있는 것으로 알려져 있다.
본 발명에서 ‘폐렴구균(Streptococcus pneumoniae)’은 그람 양성 및 용혈성을 보이는 연쇄상구균의 일종이다. 건강한 사람들에게서는 증상을 일으키지 않으나, 어린이나 노인들 중 면역력이 약한 경우 폐렴과 수막염을 일으키는 주원인이며 상부도 호흡기 질환을 유발한다.
본 발명에서 ‘스트렙토코쿠스 피오게네스(Streptococcus pyogenes)’는 화농성 연쇄상구균으로, 그람 양성의 호기성 세균이다. S. pyogenes는 인후, 생식기 점막, 직장 및 피부에 서식하며 연쇄구균 인두염, 류마티스열, 류마티스성 심장병, 성홍열과 같은 다양한 질병을 일으킬 수 있으며, 상부도 호흡기 질환을 유발한다.
본 발명에서 ‘대장균(Escherichia coli)’은 대표적인 그람 음성 병원성 세균으로, 대장균이 포함된 음식을 먹거나 이에 감염된 동물을 만지는 경우 감염되어 복부 경련통, 메스꺼움, 구토 등을 유발한다.
본 발명에서 ‘황색포도상구균(Staphylococcus aureus)’은 대표적인 그람양성병원성 세균으로 화농성질환 및 식중독의 원인균이다. S. aureus는 코, 호흡계통, 피부에 존재하며 S. aureus에 의한 식중독은 균이 식품 내에 증식하면서 생성된 독소를 섭취함으로써 발생되는 독소형 식중독이다.
본 발명에서 항진균 활성은 칸디다 알비칸스(Candida albicans)에 대한 항진균 활성일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 ‘칸디다 알비칸스(Candida albicans)’는 기회 병원성 진균으로, 인간 장내 세균총의 공통 구성원이다. 건강한 성인의 40~60%에서 위장관과 입에서 발견되나, 면역이 약화된 개체에서 병원성이 되어 칸디다증을 일으킨다. 칸디다증은 전 세계적으로 3 또는 4번째로 가장 빈번한 병원 감염으로, 특히 피부 및 생식기뿐만 아니라 구강 및 식도 감염을 일으키며, 전신감염에 대하여 암포 테리신 B , 에키노칸딘 또는 플루코나졸 등으로 치료한다.
본 발명의 신규한 스트렙토코커스 살리바리우스(S. salivarius G7, KCCM13161P) 균주는 종래의 스트렙토코커스 살리바리우스 K12(Streptococcus salivarius K12) 및 스트렙토코커스 살리바리우스(Streptococcus salivarius ATCC 7073(type strain))와 비교하여 4~8배 높은 항균 효과를 갖는다.
본 발명의 신규한 스트렙토코커스 살리바리우스(S. salivarius G7, KCCM13161P) 균주는 종래의 스트렙토코커스 살리바리우스 K12(Streptococcus salivarius K12) 및 스트렙토코커스 살리바리우스(Streptococcus salivarius ATCC 7073(type strain))와 비교하여 높은 구취 억제 효과를 갖는다. 본 발명의 S. salivarius G7(기탁번호 KCCM13161P) 배양액은 P. gingivalis 배양액의 구취 유발 휘발성 황화합물인 황화수소(H2S) 및 유화메틸(CH3SH)의 농도를 저감시킴으로써 구강 질환에 의한 구취를 현저히 억제할 수 있다.
본 발명은 상기 항균, 항진균, 항염 활성을 갖는 신규한 스트랩토코커스 살리바리우스(S. salivarius G7, KCCM13161P) 균주; 이의 파쇄물; 이의 농축물; 이의 건조물; 이의 배양물; 이의 추출물; 이의 열처리배양건조물; 및 이의 분획물 중 하나 이상을 포함하는 구강 질환의 예방 또는 개선용 조성물을 제공한다.
상기 구강 질환은 치은염(gingivitis), 치주염(periodontitis), 치아우식증(dental caries), 구취(halitosis), 시린이(sensitive teeth), 구강 칸디다증(oral candidiasis), 상부도 호흡기 질환(upper respiratory tract disease) 및 치근단 질환(periapical disease)으로 이루어진 군에서 선택되는 1 종 이상일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 구강 질환은 구강 내 또는 상부도 호흡기 내 병원균 또는 진균의 감염으로 유발될 수 있으며, 본 발명의 조성물은 항균, 항염 활성을 통하여 상기 구강 질환을 예방 또는 개선할 수 있다.
상기 구강 질환의 예방 또는 개선용 조성물은 치약, 가글링 제품, 껌, 사탕류, 캬라멜류, 젤리류, 구강 스프레이, 구강용 연고, 구강세정제, 구강 청정제 및 치아미백제로 이루어지는 군 중에서 선택되는 하나로 제품화될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명은 상기 항균, 항진균, 항염 활성를 갖는 신규한 스트랩토코커스 살리바리우스(S. salivarius G7, KCCM13161P) 균주 또는 이의 배양물을 포함하는 구강용 프로바이오틱스 조성물을 제공한다. 상기 구강용 프로바이오틱스 조성물은, 정제, 캡슐, 환, 과립, 액상, 분말, 편상, 페이스트상, 시럽, 겔, 젤리, 껌류 및 사탕류으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 제형일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 프로바이오틱스에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 말토덱스트린, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제, 감미제, 산미제 등의 희석제 또는 부형제를 사용할 수 있다.
본 발명은 상기 항균, 항진균, 항염 활성을 갖는 신규한 스트랩토코커스 살리바리우스(S. salivarius G7, KCCM13161P) 균주; 이의 파쇄물; 이의 농축물; 이의 건조물; 이의 배양물; 이의 추출물; 이의 열처리배양건조물; 및 이의 분획물 중 하나 이상을 포함하는 구강 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
상기 구강 질환은 치은염(gingivitis), 치주염(periodontitis), 치아우식증(dental caries), 구취(halitosis), 시린이(sensitive teeth), 구강 칸디다증(oral candidiasis), 상부도 호흡기 질환(upper respiratory tract disease) 및 치근단 질환(periapical disease)으로 이루어진 군에서 선택되는 1 종 이상일 수 있다.
상기 신규한 스트랩토코커스 살리바리우스(S. salivarius G7, KCCM13161P) 균주; 이의 파쇄물; 이의 농축물; 이의 건조물; 이의 배양물; 이의 추출물; 이의 열처리배양건조물; 및 이의 분획물은 전체 약학 조성물 총 중량에 대하여 바람직하게는 0.001~50중량%, 더 바람직하게는 0.001~40중량%, 가장 바람직하게는 0.001~30중량%로 하여 첨가될 수 있다.
상기 약학적 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 액제, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로스 또는 락토즈, 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한 단순한 부형제 이외에 스테아린산 마그네슘, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다.
본 발명의 약학적 조성물의 투여량은 치료받을 대상의 연령, 성별, 체중과, 치료할 특정 질환 또는 병리 상태, 질환 또는 병리 상태의 심각도, 투여 경로 및 처방자의 판단에 따라 달라질 수 있으며, 이러한 인자에 기초한 투여량 결정은 당업자의 수준 내에 있으며, 일반적으로 투여량은 1×106 CFU/일 내지 대략 1×1011 CFU/일의 범위이다. 바람직한 투여량은 1×108 CFU/일 내지 1×1011 CFU/일이며, 더 바람직한 투여량은 1×108 CFU/일 내지 1×1010 CFU/일이다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다. 본 발명의 약학적 조성물은 쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다.
상기 조성물은 상기 항균, 항진균, 항염 활성를 갖는 신규한 스트랩토코커스 살리바리우스(S. salivarius G7, KCCM13161P) 균주; 이의 파쇄물; 이의 농축물; 이의 건조물; 이의 배양물; 이의 추출물; 이의 열처리배양건조물; 및 이의 분획물 중 하나 이상을 포함하는 구강 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다.
상기 건강기능식품은 상기 항균, 항진균, 항염 활성을 갖는 신규한 스트랩토코커스 살리바리우스(S. salivarius G7, KCCM13161P) 균주; 이의 파쇄물; 이의 농축물; 이의 건조물; 이의 배양물; 이의 추출물; 이의 열처리배양건조물; 및 이의 분획물 중 하나 이상이 전체 식품 총 중량에 대하여 바람직하게는 0.001~50중량%, 더 바람직하게는 0.001~30중량%, 가장 바람직하게는 0.001~10중량%로 하여 첨가될 수 있다.
상기 건강기능식품은 정제, 캡슐제, 분말, 환제 또는 액제 등의 형태를 포함하며, 본 발명의 추출물을 첨가할 수 있는 식품으로는, 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강기능성식품류 등이 있다.
본 발명은 항균, 항진균, 항염 활성을 갖는 신규한 스트랩토코커스 살리바리우스(S. salivarius G7, KCCM13161P) 균주 및 이를 포함하는 구강 질환의 예방 또는 개선용 조성물, 구강용 프로바이오틱스에 관한 것으로, 구체적으로는 신규한 스트랩토코커스 살리바리우스(S. salivarius G7, KCCM13161P) 균주는 치주질환을 유발하는 균주에 강한 항균 활성 및 항염 활성으로 치주질환을 예방, 치료 및 개선하며, 구강 질환에 의하여 발생하는 구취를 억제하여 구강 건강 개선에 기여할 수 있다.
도 1은 Streptococcus salivarius G7(기탁번호 KCCM13161P) 16S rRNA 서열(서열번호 1)을 나타낸 것이다.
도 2는 Streptococcus salivarius G7(기탁번호 KCCM13161P)의 계통도를 나타낸 것이다.
도 3은 Streptococcus salivarius G7(기탁번호 KCCM13161P)의 치은염 유발 세균 A. actinomycetemcomitans, A. israelii, A. naeslundii 및 치근단염증 유발 세균 E. faecalis에 대한 항균력 실험 결과이다.
도 4는 Streptococcus salivarius G7(기탁번호 KCCM13161P)의 치주염 유발 세균 F. nucleatum, P. gingivalis, P. intermedia 및 P. nigrescens에 대한 항균력 실험 결과이다.
도 5는 Streptococcus salivarius G7(기탁번호 KCCM13161P)의 치아 우식 유발 세균 A. viscosus, S. mutans 및 S. sobrinus, 상부도 호흡기 질환 유발 세균 S. pneumoniae 및 S. pyogens에 대한 항균력 실험 결과이다.
도 6은 Streptococcus salivarius G7(기탁번호 KCCM13161P)의 대표적인 그람 음성 병원균 E. coli 및 그람 양성 병원균 S. aureus에 대한 항균력 실험 결과이다.
도 7은 Streptococcus salivarius G7(기탁번호 KCCM13161P)의 구강 칸디다증 유발 진균 C. albicans에 대한 항진균력 실험 결과이다.
도 8은 본 발명의 S. salivarius G7(기탁번호 KCCM13161P)의 세포 표면 물질을 포함하는 세포 파쇄물의 병독력을 확인한 것이다. A. TNF-α mRNA 발현 B. IL-8 mRNA 발현 C. TNF-α 생성 D. IL-8 생성
도 9는 P. gingivalis LPS에 의해 유도된 염증성 싸이토카인에 본 발명의 S. salivarius G7(기탁번호 KCCM13161P) LTA가 미치는 효과를 나타낸 그래프이다. A. TNF-α mRNA 발현 B. IL-8 mRNA 발현 C. TNF-α 생성 D. IL-8 생성
도 10은 T. forsythia LPS에 의해 유도된 염증성 싸이토카인에 본 발명의 S. salivarius G7(기탁번호 KCCM13161P) LTA가 미치는 효과를 나타낸 그래프이다. A. TNF-α mRNA 발현 B. IL-8 mRNA 발현 C. TNF-α 생성 D. IL-8 생성
도 11은 F. alocis LTA에 의해 유도된 염증성 싸이토카인에 본 발명의 S. salivarius G7(기탁번호 KCCM13161P) LTA가 미치는 효과를 나타낸 그래프이다. A. TNF-α mRNA 발현 B. IL-8 mRNA 발현 C. TNF-α 생성 D. IL-8 생성
도 12는 본 발명의 S. salivarius G7(기탁번호 CCM13161P) LTA에 의한 LPS 및 LTA의 세포 부착 억제능을 나타낸 유세포 분석 결과이다. A. P. gingivalis LPS 결합 B. T. forsythia LPS 결합 C. F. alocis LTA 결합
도 13은 본 발명의 S. salivarius G7(기탁번호 KCCM13161P) LTA에 의한 치주염 관련 세균 물질 CD14 및 LBP 부착 억제능을 나타낸 그래프이다. A, B, C. P. gingivalis, T. forsythia, F. alocis 의 CD14 부착 억제 D, E. F. P. gingivalis , T. forsythia, F. alocis 의 LBP 부착 억제
도 14는 본 발명의 S. salivarius G7(기탁번호 KCCM13161P) 배양액의 P. gingivalis 유래 휘발성 황화합물 H2S 및 CH3SH 의 농도에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.
도 15는 본 발명의 S. salivarius G7(기탁번호 KCCM13161P) 균주의 P. gingivalis 유래 휘발성 황화합물 H2S 및 CH3SH 의 농도에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.
도 16은 본 발명의 S. salivarius G7(기탁번호 KCCM13161P) 처리 여부에 따른 우식원성 바이오필름의 공초점 레이저 현미경 3차원 이미지이다. (녹색은 살아있는 세균, 빨강은 죽은 세균)
도 17은 본 발명의 S. salivarius G7(기탁번호 KCCM13161P) 처리 농도에 따른 우식원성 바이오필름 내 총 세균수, S. mutans 및 S. salivarius G7 균수를 나타낸 그래프이다.
도 2는 Streptococcus salivarius G7(기탁번호 KCCM13161P)의 계통도를 나타낸 것이다.
도 3은 Streptococcus salivarius G7(기탁번호 KCCM13161P)의 치은염 유발 세균 A. actinomycetemcomitans, A. israelii, A. naeslundii 및 치근단염증 유발 세균 E. faecalis에 대한 항균력 실험 결과이다.
도 4는 Streptococcus salivarius G7(기탁번호 KCCM13161P)의 치주염 유발 세균 F. nucleatum, P. gingivalis, P. intermedia 및 P. nigrescens에 대한 항균력 실험 결과이다.
도 5는 Streptococcus salivarius G7(기탁번호 KCCM13161P)의 치아 우식 유발 세균 A. viscosus, S. mutans 및 S. sobrinus, 상부도 호흡기 질환 유발 세균 S. pneumoniae 및 S. pyogens에 대한 항균력 실험 결과이다.
도 6은 Streptococcus salivarius G7(기탁번호 KCCM13161P)의 대표적인 그람 음성 병원균 E. coli 및 그람 양성 병원균 S. aureus에 대한 항균력 실험 결과이다.
도 7은 Streptococcus salivarius G7(기탁번호 KCCM13161P)의 구강 칸디다증 유발 진균 C. albicans에 대한 항진균력 실험 결과이다.
도 8은 본 발명의 S. salivarius G7(기탁번호 KCCM13161P)의 세포 표면 물질을 포함하는 세포 파쇄물의 병독력을 확인한 것이다. A. TNF-α mRNA 발현 B. IL-8 mRNA 발현 C. TNF-α 생성 D. IL-8 생성
도 9는 P. gingivalis LPS에 의해 유도된 염증성 싸이토카인에 본 발명의 S. salivarius G7(기탁번호 KCCM13161P) LTA가 미치는 효과를 나타낸 그래프이다. A. TNF-α mRNA 발현 B. IL-8 mRNA 발현 C. TNF-α 생성 D. IL-8 생성
도 10은 T. forsythia LPS에 의해 유도된 염증성 싸이토카인에 본 발명의 S. salivarius G7(기탁번호 KCCM13161P) LTA가 미치는 효과를 나타낸 그래프이다. A. TNF-α mRNA 발현 B. IL-8 mRNA 발현 C. TNF-α 생성 D. IL-8 생성
도 11은 F. alocis LTA에 의해 유도된 염증성 싸이토카인에 본 발명의 S. salivarius G7(기탁번호 KCCM13161P) LTA가 미치는 효과를 나타낸 그래프이다. A. TNF-α mRNA 발현 B. IL-8 mRNA 발현 C. TNF-α 생성 D. IL-8 생성
도 12는 본 발명의 S. salivarius G7(기탁번호 CCM13161P) LTA에 의한 LPS 및 LTA의 세포 부착 억제능을 나타낸 유세포 분석 결과이다. A. P. gingivalis LPS 결합 B. T. forsythia LPS 결합 C. F. alocis LTA 결합
도 13은 본 발명의 S. salivarius G7(기탁번호 KCCM13161P) LTA에 의한 치주염 관련 세균 물질 CD14 및 LBP 부착 억제능을 나타낸 그래프이다. A, B, C. P. gingivalis, T. forsythia, F. alocis 의 CD14 부착 억제 D, E. F. P. gingivalis , T. forsythia, F. alocis 의 LBP 부착 억제
도 14는 본 발명의 S. salivarius G7(기탁번호 KCCM13161P) 배양액의 P. gingivalis 유래 휘발성 황화합물 H2S 및 CH3SH 의 농도에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.
도 15는 본 발명의 S. salivarius G7(기탁번호 KCCM13161P) 균주의 P. gingivalis 유래 휘발성 황화합물 H2S 및 CH3SH 의 농도에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.
도 16은 본 발명의 S. salivarius G7(기탁번호 KCCM13161P) 처리 여부에 따른 우식원성 바이오필름의 공초점 레이저 현미경 3차원 이미지이다. (녹색은 살아있는 세균, 빨강은 죽은 세균)
도 17은 본 발명의 S. salivarius G7(기탁번호 KCCM13161P) 처리 농도에 따른 우식원성 바이오필름 내 총 세균수, S. mutans 및 S. salivarius G7 균수를 나타낸 그래프이다.
이하 본 발명의 바람직한 실시예를 상세히 설명한다. 그러나, 본 발명은 여기서 설명되는 실시예에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화될 수도 있으며, 여기서 소개되는 내용은 본 발명의 사상을 충분히 전달하기 위해 제공하는 것이다.
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실시예
1.
스트렙토코커스
살리바리우스
스트레인 준비>
본 발명의 Streptococcus salivarius G7(기탁번호 KCCM13161P)은 건강한 한국 남성의 치은연하샘플로부터 분리하여 동정 및 특성화하고 한국구강미생물자원은행(Korean Collection for Oral Microbiology, KCOM)에 등록하였으며(Streptococcus salivarius KCOM 2137), 상기 균주가 항균, 항염 활성, 치아우식 억제 활성 및 구취 억제 활성이 종래 Streptococcus salivarius 보다 특히 뛰어난 것을 확인하고 한국미생물보존센터(사단법인 한국종균협회)에 특허기탁하였다(기탁번호 : KCCM1316P, 기탁일 : 2023.04.21.).
본 발명의 Streptococcus salivarius G7(기탁번호 KCCM13161P)의 16SrRNA 서열(서열번호 1)을 도 1에 나타내었으며, 이를 토대로 계통발생학적 분석을 수행하고 그 결과를 도 2에 나타내었다.
비교균주로서 Streptococcus salivarius K12는 시중에 판매되고 있는 제품으로 분리 동정하였으며 Streptococcus salivarius ATCC 7073(type strain)은 아메리칸 타입 컬처 컬렉션(American Type Culture Collection, ATCC)에서 구입하여 사용하였다.
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실시예
2. 항균, 항진균 활성 평가>
2.1 세균 배양
상기 균주의 항균력 시험을 위한 구강 세균은 총 12종의 미생물로, 표 1에서와 같이 구강내 질환 관련 그람양성 및 그람음성 세균, 대표적인 항균시험 균주, 그리고 진균으로 구성하였다. 치아우식균관련 세균으로는 Streptococcus mutansATCC 25175, S. sobrinusATCC 27607로 trypticase soy broth(TSB; BD bioscience, San jose, CA, USA)를 이용하고, Actinomyces naeslundiiATCC 12104는 brain heart infusion(BHI; BD bioscience) 액체배지를 이용하여 배양하였다. 치은 및 치주질환 관련 세균으로는 Actinomyces israelii(ATCC 12102), Aggregatibacter actinomycetemcomitans(ATCC 43718)은 brain heart infusion(BD bioscience)을 이용하였고, Fusobacterium nucleatum(ATCC 25586), Porphyromonas gingivalis(ATCC 33277), Prevotella intermedia(ATCC 25611), Prevotella nigrescens (ATCC 33563)은 헤민(hemin; 1 μg/ml)과 비타민 K(0.2 μg/ml)을 첨가한 BHI 액체배지를 이용하여 37℃ 혐기상태(H2 5%, CO2 10%, N2 85%)에서 배양하였다. 치근단염 관련 세균인 Enterococcus faecalis(ATCC 29212)은 BHI 액체배지를 이용하여 37℃ 혐기상태(H2 5%, CO2 10%, N2 85%)에서 배양하였다. 진균인 Candida albicans(ATCC 10231)은 TSB를 이용하여 호기상태에서 배양하였다. 상부도 호흡기 질환 관련 세균인 Streptococcus pyogenes(ATCC 12344) 및 S. pneumoniae(ATCC 49416)은 todd hewitt broth(BD bioscience)을 이용하여 호기상태에서 배양하였다. 마지막으로 대표적인 그람 양성 및 그람 음성 세균인 Staphylococcus aureus(ATCC 23235) 및 Escherichia coli(ATCC 53868)는 TSB를 이용하여 호기상태에서 배양하였다. 본 발명의 S. salivarius G7(기탁번호 KCCM13161P)은 M17(BD bioscience) 액체배지를 이용하여 배양하였다.
시험 균주 | 관련 질환 | 시험균주 | 관련 질환 |
A. actinomycetemcomitans | 청소년 치주염 | A. viscosus | 치아 우식증 |
A. israelii | 치은염 | S. mutans | |
A. naeslundii | S. sobrinus | ||
F. nucleatum | 치주염 | S. pneumoniae | 상부도 호흡기 질환 |
P. gingivalis | S. pyogens | ||
P. intermedia | C. albicans | 구강 칸디다증 | |
P. nigrescens | E. coli | 대표적인 병원성 세균 |
|
E. faecalis | 치근단염 | S. aureus |
2.2 항균력 시험
항균력 시험은 임상검사 표준 연구소(Clinical & Laboratory Standard Institute)에서 권장하는 방법을 이용하여 수행하였다. 액체배지에서 배양된 세균을 4,000 × g 에서 5분간 원심분리하고 깨끗한 액체배지를 넣고 박테리아 계수 챔버(Bacterial counting chamber)를 이용하여 세균양을 측정하였다. 측정된 세균 부유액에 깨끗한 배지를 이용하여 혐기성 세균은 1.5 × 106cell/ml, 호기성 및 통성혐기성세균은 1.0 × 106cell/ml이 되도록 조정하여 실험에 사용하였다.
96-well plate에 각각의 배지를 180 μl씩 넣고 첫 번째 열에 준비된 본 발명의 G7(기탁번호 KCCM13161P) 및 S. salivarius K12와 S. salivarius ATCC 7073을 20 μl씩 넣은 다음, 각각 2배씩 연속 희석법으로 희석하여 혐기배양기에서 24시간 또는 36시간 배양하였다. 이후 분광광도계를 이용하여 660 nm에서 흡광도를 측정하여 세균 성장을 분석하여 도 3 내지 도 6에 나타내었다.
도 3에서 보는 바와 같이, 본 발명에 따른 S. salivarius G7(기탁번호 KCCM13161P)의 치은염 유발 세균 A. actinomycetemcomitans, A. israelii, A. naeslundii 및 치근단염증 유발 세균 E. faecalis에 대하여 종래 알려진 S. salivarius 균주인 S. salivarius ATCC 7073(type strain) 또는 S. salivarius K12 보다 뛰어난 항균력을 나타내었다. A. actinomycetemcomitans는 치은염을 일으키며, 청소년에서는 치주염을 유발하기도 한다. 본 발명의 S. salivarius G7(기탁번호 KCCM13161P)은 A. actinomycetemcomitans를 16배 희석한 배양된 배지에서 성장이 억제되는 것으로 관찰되었으며, 8배 희석한 배양된 배지에서 완벽하게 성장을 억제시켰다. A. israelii 또한 8배 희석한 배양된 배지에서 성장이 억제되는 것으로 관찰되었으며, 4배 희석한 배양된 배지에서 성장을 완벽하게 억제시켰고, A. naeslundii에 대하여는 8배 희석한 배양된 배지에서 성장이 억제되는 것으로 관찰되었으며, 4배 희석한 배양된 배지에서 성장을 완벽하게 억제시켰다. E. faecalis는 16배 희석한 배양된 배지에서 성장이 유의적으로 억제되는 것으로 관찰되었으며, 8배 희석한 배양된 배지에서 완벽하게 성장을 억제시켰다. 이러한 결과는 종래 균주보다 8배 이상의 항균력을 갖는 것을 시사한다.
도 4에서 보는 바와 같이, 본 발명의 S. salivarius G7(기탁번호 KCCM13161P)은 치주염 유발 세균 F. nucleatum, P. gingivalis, P. intermedia 및 P. nigrescens에 대하여 종래 알려진 S. salivarius 균주인 S. salivarius ATCC 7073(type strain) 또는 S. salivarius K12 보다 뛰어난 항균력을 나타내었다. S. salivarius G7(기탁번호 KCCM13161P)은 F. nucleatum, P. gingivalis, P. intermedia 및 P. nigrescens에 대하여 16배 희석한 배양된 배지에서 성장이 유의적으로 억제되는 것으로 관찰되었으며, 8배 희석한 배양된 배지에서 성장을 완벽하게 억제시키는 것으로 나타났다. 이러한 결과는 종래 균주보다 8배 이상의 항균력을 갖는 것을 시사한다.
도 5에서 보는 바와 같이, 본 발명의 S. salivarius G7(기탁번호 KCCM13161P)은 치아 우식 유발 세균 S. mutans 및 S. sobrinus와 상부도 호흡기 질환 유발 세균 S. pneumoniae 및 S. pyogens에 대하여 종래 알려진 S. salivarius 균주인 S. salivarius ATCC 7073(type strain) 또는 S. salivarius K12 보다 뛰어난 항균력을 나타내었다. S. salivarius G7(기탁번호 KCCM13161P)은 S. mutans 및 S. sobrinus와 S . pneumoniae 및 S. pyogens에 대하여 16배 희석한 배양된 배지에서 성장이 유의적으로 억제되는 것으로 관찰되었으며, 8배 희석한 배양된 배지에서 성장을 완벽하게 억제시키는 것으로 나타났다. 이러한 결과는 종래 균주보다 8배 이상의 항균력을 갖는 것을 시사한다.
도 6에서 보는 바와 같이, 본 발명의 S. salivarius G7(기탁번호 KCCM13161P)은 대표적인 그람 음성 병원균 E. coli 및 그람 양성 병원균 S. aureus에 대하여 종래 알려진 S. salivarius 균주인 S. salivarius ATCC 7073(type strain) 또는 S. salivarius K12 보다 뛰어난 항균력을 나타내었다. S. salivarius G7(기탁번호 KCCM13161P)은 E. coli 및 S. aureus에 대하여 8배 희석한 배양된 배지에서 성장이 유의적으로 억제되는 것으로 관찰되었으며, 4배 희석한 배양된 배지에서 성장을 완벽하게 억제시키는 것으로 나타났다. 이러한 결과는 종래 균주보다 4배 이상의 항균력을 갖는 것을 시사한다.
2.3
항진균력
시험
상기 항균시험과 동일한 방법으로 구강 칸디다증 유발 진균 C. albicans에 대한 항진균력 실험을 수행하고 그 결과를 도 7에 나타내었다.
도 7에서 보는 바와 같이, 본 발명의 S. salivarius G7(기탁번호 KCCM13161P)은 C. albicans에 대하여 종래 알려진 S. salivarius 균주인 S. salivarius ATCC 7073(type strain) 또는 S. salivarius K12 보다 뛰어난 항진균력을 나타내었다. S. salivarius G7(기탁번호 KCCM13161P)은 C. albicans에 대하여 8배 희석한 배양된 배지에서 성장이 유의적으로 억제되는 것으로 관찰되었으며, 4배 희석한 배양된 배지에서 성장을 완벽하게 억제시키는 것으로 나타났다. 이러한 결과는 종래 균주보다 4배 이상의 항균력을 갖는 것을 시사한다.
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실시예
3. 항염증 활성 평가>
치은섬유아세포를 이용하여 본 발명의 S. salivarius G7(기탁번호 KCCM13161P)의 염증 억제 효과를 확인하였다. 염증 유발 물질로는 하기 표 2와 같이, Porpyromonas gingivalis 유래 lipopolysaccharide(LPS) 또는 Tannerella forsythia 유래 lipopolysaccharide(LPS) 또는 Filifactor alocis 유래 lipoteichoic acid(LTA)를 이용하였다.
염증 유발 물질 | 비고 |
Porphyromonas gingivalis lipopolysaccharide | 치주염 관련 그람음성 세균 |
Tannerella forsythia lipopolysaccharide | |
Filifactor alocis lipoteichoic acid | 치주염 관련 그람양성 세균 |
P. gingivalis LPS, T. forsythia LPS 및 F. alocis LTA는 각각 구강 내 세포막의 TLR4 및 TLR2와 결합을 시작으로 신호전달을 개시하면서 염증을 유발한다. LPS 또는 LTA가 TLR4 및 TLR2에 부착하기 위해서는 CD14와 LBP(Lipopolysaccharide-binding Protein)가 필요하다. S. salivarius LTA는 치주염 세균의 LPS 및 LTA가 CD14와 LBP에의 부착을 경쟁적으로 억제하여 TLR에 부착하는 것을 방지함으로써 LPS 및 LTA의 염증 유도 활성을 억제할 수 있다.
12-well polystyrene plate에 치은섬유아세포주 HGF-1을 접종하고 80% 정도 찰 때까지 배양한 후, 배지를 제거하고 2% 사람혈청(Sigma-aldrich Co., San Jose, CA, USA)와 penicillin/streptomycin(Hyclone)이 첨가된 DMEM 배지를 1 ml를 넣었다. 이후, 초음파기를 이용하여 본 발명의 S. salivarius G7(기탁번호 KCCM13161P)를 파괴하고 얻은 세포 파쇄물을 처리하고, 염증 유발 물질인 LPS 또는 LPA 100 μg을 혼합처리한 다음, 12시간 배양하였다. 이후 배양액은 ELISA kit를 이용하여 TNF-α 및 IL-8을 분석하였다. 또한, 세포는 TRIzol(Invitrogen, Carlsbad, CA)를 이용하여 총 RNA를 추출하였고, 추출된 RNA는 Nanodrop(Invitrogen)을 이용하여 순도와 농도를 측정하고 1 μg의 총 RNA를 Maxime RT premix(IntronBiotech., Gyeonggi)를 이용하여 cDNA를 합성하고 염증 관련 사이토카인을 실시간 유전자 증폭기(AB 7500 Real-time PCR instrument system; Applied biosystems)를 이용하여 조사하여 도 8 내지 도 11에 나타내었다. 본 실험에 사용한 염증성 사이토카인의 primer 정보는 하기 표 3과 같다.
번호 | 유전자명 | 방 향 | 염기서열 |
1 | IL-8 | Forward | 5’-GTG AAG GTG CAG TTT TGC CA-3’ |
Reverse | 5’-TCT CCA CAA CCC TCT GCA C-3’ | ||
2 | TNF-α | Forward | 5’-CAG GGA CCT CTC TCT AAT CA-3’ |
Reverse | 5’-AGC TGG TTA TCT CTC AGC TC-3’ | ||
3 | GAPDH | Forward | 5’-GTG GTG GAC CTG ACC TGC-3’ |
Reverse | 5’-TGA GCT TGA CAA AGT GGT CG-3’ |
도 8은 본 발명의 S. salivarius G7(기탁번호 KCCM13161P)의 세포 표면 물질을 포함하는 세포 파쇄물의 병독력을 확인한 것이다. 사람 치은섬유아세포주 HGF-1에 대장균 유래 Lipopolysaccharides(Ec LPS), S. salivarius type strain(ATCC 7073) 유래 Lipoteichoic Acid(Ss type LTA), S . salivarius type strain(ATCC 7073) 유래 Surface Proteins(Ss type SP), 본 발명에 따른 S. salivarius G7(기탁번호 KCCM13161P) 유래 LTA (SS G7 LTA), 본 발명에 따른 S. salivarius G7(기탁번호 KCCM13161P) 유래 SP (SS G7 SP)를 처리하고 TNF-α 및 IL-8의 mRNA 및 단백질 생성량을 도 8에 나타내었다. 도 8에서 보는 바와 같이, 대장균 유래 LPS(Ec LPS)의 처리 시에만 TNF-α 및 IL-8의 mRNA 및 단백질 생성량이 증가하였으며, S. salivarius 종의 LTA 또는 SP는 독력인자로 작용하지 않음을 확인하였다.
도 9는 P. gingivalis LPS에 의해 유도된 염증성 싸이토카인에 본 발명의 S. salivarius G7(기탁번호 KCCM13161P) LTA가 미치는 효과를 나타낸 그래프이다. 도 9에서 보는 바와 같이, 치은섬유아세포주 HGF-1에 P. gingivalis LPS(Pg LPS)를 처리한 경우, TNF-α 및 IL-8의 mRNA 및 단백질 생성량이 증가하였으며, S. salivarius type strain 및 본 발명의 S. salivarius G7(기탁번호 KCCM13161P) LTA를 함께 처리하는 경우, TNF-α 및 IL-8의 mRNA 및 단백질 생성량이 억제되었다. 특히 본 발명의 S. salivarius G7(기탁번호 KCCM13161P)의 LTA는 S. salivarius type strain과 비교하여 TNF-α 및 IL-8의 mRNA 및 단백질 생성량을 현저하게 억제하는 것을 확인하였다.
도 10은 T. forsythia LPS에 의해 유도된 염증성 싸이토카인에 본 발명의 S. salivarius G7(기탁번호 KCCM13161P) LTA가 미치는 효과를 나타낸 그래프이다. 도 10에서 보는 바와 같이, 치은섬유아세포주 HGF-1에 T. forsythia LPS(Tf LPS)를 처리한 경우, TNF-α 및 IL-8의 mRNA 및 단백질 생성량이 증가하였으며, S. salivarius type strain 및 본 발명의 S. salivarius G7(기탁번호 KCCM13161P) LTA를 함께 처리하는 경우, TNF-α 및 IL-8의 mRNA 및 단백질 생성량이 억제되었다. 특히 본 발명의 S. salivarius G7(기탁번호 KCCM13161P)의 LTA는 S. salivarius type strain과 비교하여 TNF-α 및 IL-8의 mRNA 및 단백질 생성량을 현저하게 억제하는 것을 확인하였다.
도 11은 F. alocis LTA에 의해 유도된 염증성 싸이토카인에 본 발명의 S. salivarius G7(기탁번호 KCCM13161P) LTA가 미치는 효과를 나타낸 그래프이다. 도 11에서 보는 바와 같이, 치은섬유아세포주 HGF-1에 F. alocis LTA(FaLTA)를 처리한 경우, TNF-α 및 IL-8의 mRNA 및 단백질 생성량이 증가하였으며, S. salivarius type strain 및 본 발명의 S. salivarius G7(기탁번호 KCCM13161P) LTA를 함께 처리하는 경우, TNF-α 및 IL-8의 mRNA 및 단백질 생성량이 억제되었다. 특히 본 발명의 S. salivarius G7(기탁번호 KCCM13161P)의 LTA는 S. salivarius type strain과 비교하여 TNF-α 및 IL-8의 mRNA 및 단백질 생성량을 현저하게 억제하는 것을 확인하였다.
상기 결과를 통하여 본 발명의 S. salivarius G7(기탁번호 KCCM13161P)는 치주염 유발 세균에 의하여 유도되는 염증을 억제할 수 있음을 확인하였다.
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실시예
4. 치주염 관련 세균의 물질 세포 부착
억제능
평가>
4.1
유세포
분석
상기 결과를 바탕으로, 본 발명의 S. salivarius G7(기탁번호 KCCM13161P) LTA가 치주염 유발 세균으로부터 유래된 LPS 또는 LTA가 세포에 부착하는 것을 억제할 수 있는지 평가하였다. P. gingivalis LPS, T. forsythia LPS 및 F. alocis LTA에 형광물질을 부착한 후, S. salivarius type strain(ATCC 7073) 유래 LTA(Ss type LTA) 또는 본 발명의 S. salivarius G7(기탁번호 KCCM13161P) LTA 를 각각 함께 인간 치은섬유아세포주 HGF-1에 처리하여 배양하고, 세포의 형광 정도를 유세포분석(flow cytometry)으로 확인하여 도 12에 나타내었다.
P. gingivalis 및 T. forsythia 유래 LPS(1 mg) 및 F. alocis 유래 LTA 를 4℃에서 30분 동안 차가운 sodium metaperiodate와 반응시킨 후, standard RC dialysis membrane tubing(Spectrum Laboratories Inc., Ranch Dominaquez, CA, USA)에 반응액을 넣고 100 mM sodium acetate(pH 5.5)에서 12시간 동안 투석하였다. 상기 LPS 및 LTA를 포함하는 용액을 200 mM KCl에 용해 시켜 제조한 10 mM Alexa FluorTM-488 hydrazide(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)와 혼합하고 커플링 완충액(0.1 M 인산나트륨, 0.15 M NaCl, pH 7.2)에서 6시간 동안 실온에서 방치하고, 1 L의 내독소가 없는 물에서 12시간 동안 3회 투석 후, 형광 표지된 LPS 및 LTA를 새 튜브에 옮겨 -20℃에 보관하였다.
이 후, 상기 Alexa FluorTM 488로 표지된 LPS 또는 LTA를 다양한 농도의 S. salivarius G7 표면 추출물의 존재 또는 부재 하에 37℃에서 1시간 동안 인간 단핵구 세포주인 THP-1 세포주에 처리하였다. 그 다음, CO2 인큐베이터에서 상기 세포를 500xg에서 3분 동안 원심분리하여 얻고 차가운 DPBS(Dulbecco's phosphate buffered saline, pH 7.2)로 3회 세척하였다. 이후 상기 세포에 대한 Alexa 488-표지된 LPS 및 LTA의 결합을 유동 세포측정법(FACS calibur, BD biosciences, Sparks, MD, USA)으로 분석하였다. 10,000개의 세포를 계수하여 데이터를 수집하였고 Alexa FluorTM 488-표지된 LPS와 LTA의 결합이 FL-1 채널에서 검출하였으며, CellQuest 소프트웨어(BD biosciences)를 사용하여 데이터를 분석하였다.
도 12에서 보는 바와 같이, P. gingivalis LPS, T. forsythia LPS 및 F. alocis LTA의 처리로 형광을 띠는 세포, 즉, LPS 및 LTA가 부착된 세포가 크게 증가하였으며, S. salivarius type strain(ATCC 7073) 유래 LTA(Ss type LTA) 또는 본 발명의 S. salivarius G7(기탁번호 KCCM13161P) LTA 를 함께 배양한 경우, 형광을 나타내는 세포수가 크게 감소하였다. 특히 본 발명의 S. salivarius G7(기탁번호 KCCM13161P)의 LTA는 S. salivarius type strain과 비교하여 LPS 및 LTA가 부착된 세포가 현저하게 감소하는 것을 확인하였다.
4.2 CD14 및 LBP 부착 억제 분석
상기 P. gingivalis LPS, T. forsythia LPS 또는 F. alocis LTA는 각각 TLR4 및 TLR2를 통해 염증성 싸이토카인을 유발하기 위해서는 먼저 LPS 및 LTA는 구강 내 세포막의 CD14와 LBP와 결합해야 한다. S. salivarius LTA는 치주염 세균의 LPS 및 LTA가 CD14와 LBP에의 부착을 경쟁적으로 억제하는지 확인하였다.
형광물질이 부착된 P. gingivalis LPS, T. forsythia LPS 또는 F. alocis LTA을 농도별 S. salivarius type strain(ATCC 7073) 유래 LTA(Ss type LTA) 또는 본 발명의 S. salivarius G7(기탁번호 KCCM13161P)의 LTA의 존재하에 CD14 또는 LBP 단백질과 배양하여 부착정도를 측정하고 그 결과를 도 13에 나타내었다.
Anti-LBP mAb(MAB870, R&D systems, Minneapolis, MN, USA) 및 Anti-CD14 Ab(AF982, R&D systems)를 DPBS에 1 ㎍/ml의 농도로 용해시키고, 항체(50 ng/well)는 EIA 플레이트(Corning Co., Corning, NY, USA)에 분주한 다음 4℃에서 12시간 동안 코팅하였다. 상기 항체가 코팅된 EIA 플레이트를 0.1% tween 20을 포함하는 인산완충용액(PBST)로 5회 세척하고, 1% 소 혈청 알부민(BSA)이 포함된 DPBST를 분주한 다음 약한 진탕 조건에서 2시간 동안 불활성화시켰다. 이 후, 재조합 인간 LBP(rhLBP, R&D 시스템) 및 인간 CD14(rhCD14, R&D 시스템)를 2 ㎍/ml의 농도로 DPBS에 용해시키고 상기 항체가 코팅된 EIA 플레이트의 웰에 첨가하였다. 상기 플레이트를 실온에서 4시간 동안 방치한 후 PBST로 5회 세척한 다음, 비오틴-표지된(biotin-labelled) LPS 또는 LTA를 S. salivarius LTA와 각각 또는 공동으로 준비된 웰에 처리하고 실온에서 2시간 동안 방치하였다. rhLBP 및 rhCD14에 결합된 비오틴-표지된 LPS 및 LTA를 측정하기 위해서 2% BSA를 함유하는 PBST에서 50 μl의 HRP-표지된 스트렙타비딘(1 μg/ml)과 1시간 동안 반응시켰다. PBST로 5회 세척한 후 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine(TMB) 용액을 상기 웰에 넣은 다음 실온에서 30분 동안 방치하고, 효소 반응을 1N 황산으로 정지시켰다. 마이크로플레이트 리더기(Biotek, Winooski, VT, USA)로 450 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다.
도 13에서 보는 바와 같이, S. salivarius type strain(ATCC 7073) 유래 LTA(Ss type LTA) 또는 본 발명의 S. salivarius G7(기탁번호 KCCM13161P)의 LTA 농도가 증가할수록, P. gingivalis LPS, T. forsythia LPS 또는 F. alocis LTA의 CD14 또는 LBP의 결합이 감소하였다. 특히 본 발명의 S. salivarius G7(기탁번호 KCCM13161P)의 LTA는 S. salivarius type strain과 비교하여 LPS 또는 LTA의 CD14 또는 LBP의 결합을 현저하게 억제하는 것을 확인하였다.
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실시예
5. 휘발성 황화합물
억제능
평가>
본 발명의 S. salivarius G7(기탁번호 KCCM13161P)가 구취억제 효과를 갖는지 확인하기 위하여 휘발성 황 화합물을 생산하는 P. gingivalis의 배지를 이용하여 실험을 수행하였다. 1 ml의 P. gingivalis(1 × 108 cell/ml)를 10 ml 새 배지에 접종하고 48시간 배양 후, 세균 배양액 300 ㎕을 깨끗한 50 ml 원주튜브에 옮긴 다음, 상기 P. gingivalis 배양액이 들어있는 원주튜브에 본 발명의 S. salivarius G7(기탁번호 KCCM13161P) 배양액 300 ㎕ 또는 600 ㎕ 또는 생균 107 또는 108 cell을 넣고 최종량이 5 ml이 되도록 배지를 추가하였다. 이후 상기 원주튜브를 vertical shaker를 이용하여 1분간 흔들고, 5분간 실온에 방치하였다. 그 다음, 1 ml 주사기를 이용하여 용액표면 바로 위에 있는 공기 1 ml을 수득하여 가스 크로마토그래프 (OralchromaTM; Nissha FIS, Inc, Osaka, Japan)을 이용하여 황화수소 (H2S) 및 유화메틸(CH3SH)의 농도를 측정하고 그 결과를 도 14 및 도 15에 나타내었다.
도 14에서 보는 바와 같이, 본 발명의 S. salivarius G7(기탁번호 KCCM13161P) 배양액은 P. gingivalis 배양액의 구취 유발 휘발성 황화합물인 황화수소 (H2S) 및 유화메틸(CH3SH)의 농도를 농도 의존적으로 감소시켰다.
또한 도 15에서 보는 바와 같이, 본 발명의 S. salivarius G7(기탁번호 KCCM13161P) 균주 자체 또한 농도 의존적으로 황화수소 (H2S) 및 유화메틸(CH3SH)의 농도를 감소시켰다.
상기 결과를 통하여 본 발명의 S. salivarius G7(기탁번호 KCCM13161P) 가 P. gingivalis 에 의하여 생성되는 구취를 효과적으로 억제할 수 있음을 확인하였다.
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실시예
6. 바이오필름 형성 억제 평가>
6.1 바이오필름 형성 억제 효과
본 발명의 S. salivarius G7(기탁번호 KCCM13161P)가 실질적으로 바이오필름 형성을 억제하는지 평가하였다. 10명의 치주염이 없는 성인의 타액을 모아서 혼합한 후, 두 개의 튜브에 나누어 담았다. 먼저, 타액 코팅된 plate를 제조하기 위하여 상기 튜브 중 하나에 동량의 인산완충용액을 넣고 4℃ 6,000 × g 에서 10분간 원심분리하고 상층액을 깨끗한 튜브로 옮겼다. 타액 세균은 나머지 튜브의 타액 혼합액에 동량의 BHI 배지를 넣고 2,000 × g 에서 10분간 원심분리하고 상층액을 깨끗한 튜브로 옮겨 준비하였다.
상기 코팅용 타액을 8-well glass plate에 200 μl 분주하고 40℃ 오븐에서 건조시키는 과정을 10번 반복하였다. 상기 에서 제작한 타액 코팅된 plate는 UV 멸균기에 넣고 멸균시켰다. 이후, 2% 자당이 포함된 10 ml의 타액 세균 부유액에 우식원성 바이오필름을 형성하기 위해서 100 ㎕의 S. mutans(1 × 108 cell/ml)을 첨가한 다음, 8-well glass plate 및 12-well polystyleneplate에 각각 400 μl 및 1 ml을 넣고 호기 상태에서 배양하였다. 이후, 대조군은 매일 2% 자당이 포함된 BHI 배지만을 이용하여 배지를 교체하며 7일간 배양하였고, 실험군은 2% 자당이 포함된 BHI에 본 발명의 S. salivarius G7(기탁번호 KCCM13161P)을 107 및 108 균주수를 포함하도록 두 농도로 접종하고 배지를 교체하며 7일간 배양하였다. 이 후 바이오필름 양을 조사하기 위해서 8-well plate는 Bacterial live/dead staining kit (Invitrogen)을 이용하여 염색하고 공초점 레이저현미경을 이용하여 3D 관찰하여 도 16에 나타내었다.
도 16에서 보는 바와 같이, 타액코팅된 플레이트에 타액균주와 S. mutans가 복합적으로 바이오필름을 형성하였으며, 여기에 본 발명의 S. salivarius G7(기탁번호 KCCM13161P)을 추가하는 경우, 사멸된 바이오필름 형성 균주가 증가하면서 바이오필름이 느슨해 지는 것을 확인하였다.
6.2 바이오필름 내의 세균수 측정
상기 형성된 바이오필름 내의 총 세균수(Oral streptococci), S. mutans 및 S. salivarius G7(기탁번호 KCCM13161P)의 세균수를 측정하였다. 상기에서 12-well plate에 1 ml의 DPBS를 넣어 배양된 바이오필름을 물리적으로 떨어트렸다. 이를 5,000 × g에서 1분간 원심분리하여 세균 침전물을 얻은 후, 상기 세균 침전물로부터 G-spin Genomic DNA extraction kit(iNtRON Biotechnology, Gyeonggi, Korea)을 이용하여 총 DNA를 추출한 다음, 실시간 유전자 증폭기를 이용하여 세균 정량을 수행하였다.
실시간 유전자 분석은 해당 표준 정량 DNA와 샘플을 같이 수행하였다. TB green premix(Takara Co., Tokyo, Japan), ROX II dye, Primers 및 DNA를 혼합하고 94℃에서 5분간 예열(pre-heating) 후, 95℃에서 10초(denaturation stage), 60℃에서 10초(annealing stage) 및 72℃에서 33초(extension stage)를 40회 반복하고 비특이적결합을 조사하기 위해서 생산물 melting curve를 이용하여 조사하였다. 표준용량 DNA를 이용하여 Ct값과 세균 양에 대한 표준곡선을 형성하고, 이를 바탕으로 샘플 DNA의 Ct값을 이용하여 세균수를 계산하여 그 결과를 도 17에 나타내었다. 이때 사용한 프라이머를 표 4에 나타내었다.
번호 | 이름 | 방 향 | 염기서열 |
1 | Oral streptococci | Forward | 5-AAG CAA CGC GAA GAA CCT TA-3' |
Reverse | 5'-GTC TCG CTA GAG TGC CCA AC-3' | ||
2 | S. mutans | Forward | 5‘-CTA CAC TTT CGG GTG GCT TG-3’ |
Reverse | 5‘-GAA GCT TTT CAC CAT TAG AAG CTG-3‘ | ||
3 | S. salivarius | Forward | 5’-TTG CCA CAT CTT CAC TCG CTT-3’ |
Reverse | 5’-GTT TAG TAG CAA CTT CTG GCT T-3’ |
도 17에서 보는 바와 같이, 바이오필름 내 S. salivarius G7(기탁번호 KCCM13161P) 양은, 처리한 양이 증가함에 그의 균수는 증가하였으나 치아 우식 원인균인 S. mutans는 본 발명의 S. salivarius G7(기탁번호 KCCM13161P) 처리한 양이 증가함에 따라 유의적으로 감소한 것을 확인하였다.
Claims (11)
- 항균, 항진균, 항염 활성 및 치아우식 억제능을 갖는 신규한 스트렙토코커스 살리바리우스 G7, 기탁번호: KCCM13161P (Streptococcus salivarius G7, 기탁번호: KCCM13161P) 균주에 있어서,
상기 항균 활성은 아그레가티벡터 악티노마이세텀코미탄스(Aggregatibacter actinomycetemcomitans), 악티노마이세스 이스라엘리(Actinomyces israelii), 악티노마이세스 내슬런디(Actinomyces naeslundii), 엔테로코쿠스 페칼리스(Enterococcus faecalis), 후소박테리움 뉴클레아툼(Fusobacterium nucleatum), 포르피로모나스 진지발리스(Porphyromonas gingivalis), 프레보텔라 인터미디어(Prevotella intermedia, Bacteroides intermedius), 프레보텔라 니그레센스(Prevotella nigrescens), 스트렙토코쿠스 뮤탄스(Streptococcus mutans), 스트렙토코커스 소브리너스(Streptococcus sobrinus), 폐렴구균(Streptococcus pneumoniae), 스트렙토코쿠스 피오게네스(Streptococcus pyogenes), 악티노마이세스 비스코서스(Actinomyces viscosus), 대장균(Escherichia coli) 및 황색포도상구균 (Staphylococcus aureus)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1 이상에 대한 항균 활성이며,
상기 항진균 활성은 칸디다 알비칸스(Candida albicans)에 대한 항진균 활성인 것을 특징으로 하는 균주. - 삭제
- 삭제
- 제1항의 균주; 이의 파쇄물; 이의 농축물; 이의 건조물; 이의 배양물; 이의 추출물; 이의 열처리배양건조물; 및 이의 분획물 중 하나 이상을 포함하는 구강 질환의 예방 또는 개선용 조성물에 있어서,
상기 구강질환은, 아그레가티벡터 악티노마이세텀코미탄스(Aggregatibacter actinomycetemcomitans), 악티노마이세스 이스라엘리(Actinomyces israelii), 악티노마이세스 내슬런디(Actinomyces naeslundii), 엔테로코쿠스 페칼리스(Enterococcus faecalis), 후소박테리움 뉴클레아툼(Fusobacterium nucleatum), 포르피로모나스 진지발리스(Porphyromonas gingivalis), 프레보텔라 인터미디어(Prevotella intermedia, Bacteroides intermedius), 프레보텔라 니그레센스(Prevotella nigrescens), 스트렙토코쿠스 뮤탄스(Streptococcus mutans), 스트렙토코커스 소브리너스(Streptococcus sobrinus), 폐렴구균(Streptococcus pneumoniae), 스트렙토코쿠스 피오게네스(Streptococcus pyogenes), 악티노마이세스 비스코서스(Actinomyces viscosus), 대장균(Escherichia coli), 황색포도상구균 (Staphylococcus aureus) 및 칸디다 알비칸스(Candida albicans)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1 이상에 의한 청소년 치주염(juvenile periodontitis), 치은염(gingivitis), 치주염(periodontitis), 치아우식증(dental caries), 구취(halitosis), 시린이(sensitive teeth), 구강 칸디다증(oral candidiasis), 상부도 호흡기 질환(upper respiratory tract disease) 및 치근단질환(periapical disease)으로 이루어진 군에서 선택되는 1 이상인 것을 특징으로 하는 구강 질환의 예방 또는 개선용 조성물. - 삭제
- 제4항에 있어서,
상기 조성물은 치약, 가글링 제품, 껌, 사탕류, 캬라멜류, 젤리류, 구강 스프레이, 구강용 연고, 구강세정제, 구강 청정제 및 치아미백제로 이루어지는 군 중에서 선택되는 하나로 제품화되는 것을 특징으로 하는, 구강 질환의 예방 또는 개선용 조성물. - 제1항의 균주 또는 이의 배양물을 포함하는 구강용 프로바이오틱스 조성물.
- 제7항에 있어서,
상기 구강용 프로바이오틱스 조성물은, 정제, 캡슐, 환, 과립, 액상, 분말, 편상, 페이스트상, 시럽, 겔, 젤리, 껌류 및 사탕류으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 제형인 것을 특징으로 하는 구강용 프로바이오틱스 조성물. - 제1항의 균주; 이의 파쇄물; 이의 농축물; 이의 건조물; 이의 배양물; 이의 추출물; 이의 열처리배양건조물; 및 이의 분획물 중 하나 이상을 포함하는 구강 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 있어서,
상기 구강질환은, 아그레가티벡터 악티노마이세텀코미탄스(Aggregatibacter actinomycetemcomitans), 악티노마이세스 이스라엘리(Actinomyces israelii), 악티노마이세스 내슬런디(Actinomyces naeslundii), 엔테로코쿠스 페칼리스(Enterococcus faecalis), 후소박테리움 뉴클레아툼(Fusobacterium nucleatum), 포르피로모나스 진지발리스(Porphyromonas gingivalis), 프레보텔라 인터미디어(Prevotella intermedia, Bacteroides intermedius), 프레보텔라 니그레센스(Prevotella nigrescens), 스트렙토코쿠스 뮤탄스(Streptococcus mutans), 스트렙토코커스 소브리너스(Streptococcus sobrinus), 폐렴구균(Streptococcus pneumoniae), 스트렙토코쿠스 피오게네스(Streptococcus pyogenes), 악티노마이세스 비스코서스(Actinomyces viscosus), 대장균(Escherichia coli), 황색포도상구균 (Staphylococcus aureus) 및 칸디다 알비칸스(Candida albicans)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1 이상에 의한 청소년 치주염(juvenile periodontitis), 치은염(gingivitis), 치주염(periodontitis), 치아우식증(dental caries), 구취(halitosis), 시린이(sensitive teeth), 구강 칸디다증(oral candidiasis), 상부도 호흡기 질환(upper respiratory tract disease) 및 치근단질환(periapical disease)으로 이루어진 군에서 선택되는 1 종 이상인 것을 특징으로 하는 구강 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물. - 삭제
- 제1항의 균주; 이의 파쇄물; 이의 농축물; 이의 건조물; 이의 배양물; 이의 추출물; 이의 열처리배양건조물; 및 이의 분획물 중 하나 이상을 포함하는 구강 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품에 있어서,
상기 구강질환은, 아그레가티벡터 악티노마이세텀코미탄스(Aggregatibacter actinomycetemcomitans), 악티노마이세스 이스라엘리(Actinomyces israelii), 악티노마이세스 내슬런디(Actinomyces naeslundii), 엔테로코쿠스 페칼리스(Enterococcus faecalis), 후소박테리움 뉴클레아툼(Fusobacterium nucleatum), 포르피로모나스 진지발리스(Porphyromonas gingivalis), 프레보텔라 인터미디어(Prevotella intermedia, Bacteroides intermedius), 프레보텔라 니그레센스(Prevotella nigrescens), 스트렙토코쿠스 뮤탄스(Streptococcus mutans), 스트렙토코커스 소브리너스(Streptococcus sobrinus), 폐렴구균(Streptococcus pneumoniae), 스트렙토코쿠스 피오게네스(Streptococcus pyogenes), 악티노마이세스 비스코서스(Actinomyces viscosus), 대장균(Escherichia coli), 황색포도상구균 (Staphylococcus aureus) 및 칸디다 알비칸스(Candida albicans)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1 이상에 의한 청소년 치주염(juvenile periodontitis), 치은염(gingivitis), 치주염(periodontitis), 치아우식증(dental caries), 구취(halitosis), 시린이(sensitive teeth), 구강 칸디다증(oral candidiasis), 상부도 호흡기 질환(upper respiratory tract disease) 및 치근단질환(periapical disease)으로 이루어진 군에서 선택되는 1 종 이상인 것을 특징으로 하는 구강 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품.
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