KR20150080086A

KR20150080086A - 유산균 파쇄물의 분석 방법

Info

Publication number: KR20150080086A
Application number: KR1020130166852A
Authority: KR
Inventors: 정대균; 정봉준; 백윤수; 이도경; 방면호; 이종석
Original assignee: 주식회사 알엔에이
Priority date: 2013-12-30
Filing date: 2013-12-30
Publication date: 2015-07-09

Abstract

본 발명은 유산균 파쇄물의 LTA 내의 지방산의 종류 및 함량이 유산균주에 따라 상이한 것을 이용하여 유산균 파쇄물의 지방산 분석을 통해 항염 효과를 가지는 유산균 파쇄물의 원료표준화를 할 수 있으며, 유산균 파쇄물을 분석함으로써 항염 효과를 가지는 유산균을 선별할 수 있다.

Description

유산균 파쇄물의 분석 방법{Method for analyzing debris derived from lactic acid bacteria}

본 발명은 유산균 파쇄물의 분석 방법에 관한 것으로서, 특히 유산균 파쇄물의 LTA 내의 지방산의 종류 및 함량이 유산균주에 따라 상이한 것을 확인한 것에 관한 것이다.

염증반응은 생체의 세포나 조직에 어떠한 기질적 변화를 가져오는 침습으로 인한 손상을 수복 재생하기 위한 생체방어 반응과정으로서 국소의 혈관, 체액의 각종 조직세포 및 면역세포 등이 작용한다. 정상적으로 외부 침입균에 의하여 유도되는 염증반응은 생체를 보호하기 위한 방어 시스템인 반면, 비정상적으로 과도한 염증반응이 유도되면 다양한 질환들이 나타나게 되는데, 이러한 질환들을 염증질환이라 한다. 상기 염증질환은 외부 자극에 의하여 활성화된 표적세포로부터 분비되는 다양한 염증 매개물질이 염증을 증폭 및 지속시켜 인체의 생명을 위협하는 질환으로서 급성염증, 류마티스 관절염과 같은 관절 내에서의 만성염증 질환 등이 있다. 이러한 염증질환을 유도하는 핵심적인 염증 매개물질은 프로스타글란딘류(Prostaglandins), 수산화 지방산류(Hydroxyfatty acids) 등이며, 이들은 사이클로옥시게나제(Cyclooxygenase, COX) 및 리폭시게나제(Lipoxygenase)에 의하여 전구체인 아라키돈산(Arachidonic acid)으로부터 생성된다.

그런데, 서구화된 식생활 및 운동부족, 환경오염 등에 의하여 현대인에게 다양한 급성 및 만성 염증 질환이 점차 증가하는 추세에 있다. 이러한 여러 가지 염증성 질환에 대한 치료로써 항생제 및 소염제가 사용되고 있으며 다양한 약제 부작용 등이 점차 문제가 되고 있다. 염증 치료를 위하여, 여러 가지 항염증 물질이 개발되었으며, 현재까지 보고된 항염증성 물질들은 급성염증에서 손상된 조직세포, 염증에 관여하는 세포에서 활성화되는 프로스타글란딘의 생합성을 억제하는 물질들이다. 이와 같은 물질들은 급성염증에 대해서는 치료효과를 가지고 있지만 류마티스 관절염 같은 만성염증에 대해서는 1차적인 염증 현상만을 완화할 뿐이며, 면역학적 치료효과는 기대할 수 없으며 또한 심혈관계를 비롯한 다양한 부작용을 가지고 있다.

한편, 유산균은 포도당 혹은 유당과 같은 당류를 분해하여 유산을 만드는 박테리아로, 세균 중에서 가장 오래전부터 인간에게 유용하게 이용되고 있는 균으로서, 특히, 발효 유제품에서 보편적으로 이용되어 왔다. 유산균은 인체 내에서 유익한 역할을 하는 세균으로서 탄수화물 같은 당을 발효시켜 유산(젖산)을 생성하는 균으로, 지금까지 400여종이 발견되었으며, 그 중 상품성이 있는 것은 18종으로 알려져 있다. 이들 유산균은 면역증강 특히, 위 장관 면역 증강의 생리활성을 가진다고 알려져 있으며, 일부 유산균들의 항염증 활성에 대한 연구가 진행되고 있다. 그러나 아직까지 유산균 파쇄물에 존재하는 그람 양성 세균의 세포벽 성분인 리포테이코익산(lipoteichoic acid, LTA)을 구성하는 지방산의 종류 및 함량과 유산균 파쇄물의 항염 활성과의 관련성에 대해 보고된 바는 없다.

이에, 본 발명자들은 유산균 파쇄물의 LTA 내의 지방산 종류 및 함량이 유산균 균주마다 상이함을 확인하였으며, 이를 분석함으로써 유산균 파쇄물의 원료 표준화를 용이하게 할 수 있고, 더 나아가 우수한 항염증 효과를 가지는 유산균을 선별할 수 있음을 밝혔다.

본 발명의 목적은 유산균 파쇄물의 원료표준화를 위한 분석법을 제공하는 것이다.

아울러, 본 발명의 또 다른 목적은 항염 유산균 선별 방법을 제공하는 것이다.

본 발명은 유산균 파쇄물의 원료표준화를 위한 분석법을 제공한다.

아울러, 본 발명은 항염 유산균 선별 방법을 제공한다.

본 발명은 유산균 파쇄물 내의 지방산 종류 및 함량과 유산균 파쇄물의 항염증 활성과의 상관 관계를 확인함으로써, 유산균 파쇄물의 지방산 분석 통해 원료표준화를 할 수 있으며, 본 발명의 분석법은 유산균 중 항염 활성을 가지는 유산균을 선별하는데 이용될 수 있다.

도 1은 LC-MS 분석에서 분자량으로 확인된 유산균 파쇄물 내의 LTA 2 종의 예측되는 구조 모식도이다.
도 2는 각각의 유산균 균주 (K5-5, K55-5, K-8 및 K-88)의 파쇄물 내의 LTA를 구성하는 지방산의 종류 및 함량을 분석한 도이다.
도 3은 유산균 파쇄물 내의 LTA를 구성하는 지방산 내에 존재하는 팔미트산을 표준 팔미트산과 비교하여 확인한 도이다..

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은

1) 유산균 파쇄물을 제조하는 단계;

2) 상기 단계 1)의 유산균 파쇄물을 산가수분해하는 단계; 및

3) 상기 단계 2)의 산가수분해물의 지방산 종류 및 함량을 분석하는 단계를 포함하는 유산균 파쇄물의 원료표준화를 위한 분석법을 제공한다.

상기 단계 1)의 유산균은 락토바실러스 델브루에키 아종 불가리쿠스, 스트렙토코코스 서모필러스, 락토코코스 락티스 아종 크레모리스, 락토바실러스 카세이, 락토바실러스 애시도필러스, 비피도박테리움 롱검, 락토코코스 락티스 아종 락티스, 비피도박테리움 아돌레센티스, 락토바실러스 플란타룸, 루코노스톡 메센테로이드 및 페디오코코스 펜토사세우스로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상인 것이 바람직하며, 락토바실러스 플란타룸이 더욱 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

상기 단계 1) 이후에 유산균 파쇄물 내의 리포테이코익산(lipoteichoic acid, LTA)의 당지질을 검출하는 단계를 추가로 포함하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 본 발명의 일실시예에서 유산균 파쇄물을 이용하여 LC-MS 분석을 통한 지표성분의 분자량 및 MS/MS 분석을 수행하였다. 질량분석을 통해 LTA 지표성분의 분자량은 963.63 및 977.64로 확인되었으며, GC-MS 분석을 통해서 6 탄당을 포함하는 당지질(glycolipid)로 LTA의 종류로 확인되었다 (도 1 참조).

상기 LTA 검출, 및 LTA 내의 지방산 종류 및 함량 분석은 LC/QTOF, LC-MS, GC-MS 또는 HPLC 분석을 이용한 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

상기 단계 3)의 지방산은 유산균에 따라 상이할 수 있으나, 주로 올레산(oleic acid), 옥타데세노익산(octadecenoic acid), 옥타데카노익산(octadecanoic acid) 팔미트산(palmitic acid) 또는 스테아릭산(stearic acid)일 수 있으며, 팔미트산(palmitic acid) 또는 스테아릭산(stearic acid)을 지표 지방산으로 이용할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

아울러, 본 발명은

1) 유산균 파쇄물을 제조하는 단계;

2) 상기 단계 1)의 유산균 파쇄물을 산가수분해하는 단계;

3) 상기 단계 2)의 산가수분해물의 지방산 종류 및 함량을 분석하는 단계; 및

4) 상기 단계 3)에서 분석한 지방산 종류 및 함량과 항염증 효과가 우수한 표준 균주의 LTA 내의 지방산 종류 및 함량을 비교하는 단계를 포함하는 항염 유산균 선별 방법을 제공한다.

상기 단계 1) 이후에 유산균 파쇄물 내의 리포테이코익산(lipoteichoic acid, LTA)의 당지질을 검출하는 단계를 추가로 포함하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 통상의 기술분야에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.

< 실시예 1> 유산균 균주별 세포 파쇄물의 면역 활성 확인

락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) K5-5, K55-5, K-8 및 K-88 균주를 MRS 배지(Difco) 3L에 각각 접종하여 37℃에서 18시간 동안 배양하였다. 배양 후 8000rpm, 4℃로 원심분리 (Vision, Korea)하여 유산균을 회수하였고, 증류수로 3회 세척한 후 동결 건조시켜 보관하였다. 상기에서 분리하여 동결 건조시킨 유산균을 증류수에 10 mg/ml농도로 현탁하여, 유산균의 세포수를 1x10¹⁰ CFUs/ml로 맞추었다. 현탁한 세포를 Microfludizer를 이용하여 13000psi의 압력으로 8℃에서 1 내지 13회 파쇄하여 유산균 파쇄물을 제조하였다. 제조한 각각의 균주의 파쇄물의 면역 활성을 확인하기 위하여, Monocyte 인 THP-1 세포 (면역세포) 2×10⁵cells/ml에 각각의 유산균 파쇄물 시료를 처리한 뒤 24시간 배양하였다. 배양한 세포에 LPS를 500 ng/ml 처리하고, 4시간 동안 배양한 뒤, 각각의 상등액을 수집하였다. 수집한 각각의 균주의 상등액을 이용한 hTNF-alpha의 발현 정도를 sandwich ELISA(R&D Cat MAB610, BAF210)를 통해 확인하였다.

< 실시예 2> 유산균 파쇄물의 균주별 LTA ( Lipoteichoic acid )의 당지질 함량 확인

상기 <실시예 1>에서 파쇄한 각각의 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) K5-5, K55-5, K-8 및 K-88 균주 파쇄물을 LC-MS 분석을 수행하여, 각각 균주의 세포벽에 존재하는 리포테이코익산(lipoteichoic acid)의 당지질 함량을 분석하였다. 구체적으로, LC-MS 분석 조건은 이동상으로 0.1% 포름산이 포함된 아세토니트릴 및 물을 이용하여 0.3 ml/min의 속도로 UPLC를 수행하면서, Thermo 사의 고분해능 질량분석기(LTQ-Orbitrap XL) 및 HESⅠ-Ⅱ 이온화 소스를 사용하여 수행하였다.

그 결과, 하기 표 1에서와 같이 각각의 균주에서 리포테이코익산(lipoteichoic acid, LTA)의 당지질(glycolipid)성분으로 확인된 주성분 2종류(분자량 963.63 및 977.64)를 LTA 지표 1 및 LTA 지표 2로 확인하였고, 2종류의 주성분 이외에 다양한 유도체들을 질량분석법을 통해 확인하였다. 각 피크들의 상대면적 비교분석을 통해 균주의 종류에 따라 파쇄물 내의 LTA 함량이 서로 다름을 확인할 수 있었다. 또한, 다른 피크들은 당의 갯수와 lipid chain에서의 이중 결합의 수에 따른 LTA 연관물질들로 확인되었다. 따라서, 락토바실러스 플란타룸 균주별 세포벽 구성 성분인 LTA 함량이 서로 상이함을 알 수 있었다.

Target		RT (min)	m/z ([M+FA-H]-)	Formula	Δppm	Area (%)
Target		RT (min)	m/z ([M+FA-H]-)	Formula	Δppm	K8	K88	K5-5	K55-5
963.63	sugar, reduction	21.26/21.40	1123.6630	C55 H98 O20	0.533	0.6	0.3	1.5	4.4
	reduction	21.71/21.83	961.6102	C49 H88 O15	0.855	2.9	2.7	10.4	9.6
	+ sugar	22.26	1125.6788	C55 H100 O20	0.621	6.9	2.6	5.3	26.9
	LTA 지표1	22.7	963.6263	C49 H90 O15	1.497	35.1	26.4	31.4	40.2
	reduction - sugar	22.59/22.77	799.5579	C43 H78 O10	1.571	0.2	0.2	0.7	0.8
	- sugar	23.73	801.5728	C43 H80 O10	0.731	4.4	3.3	6.0	8.5
977.64	sugar, reduction	22.04/22.16	1137.6783	C56 H100 O20	0.386	0.7	0.7	1.2	0.4
	reduction	22.47/22.62	975.6256	C50 H90 O15	0.525	6.4	11.3	13.7	0.9
	+ sugar	23.11	1139.6940	C56 H102 O20	0.403	3.6	2.4	1.6	2.1
	LTA 지표2	23.59	977.6420	C50 H92 O15	1.342	33.8	41.1	22.9	5.4
	reduction - sugar	23.47/23.64	813.5734	C44 H80 O10	1.359	0.5	0.8	1.3	0.1
	- sugar	24.75	815.5881	C44 H82 O10	0.24	4.7	8.3	4.0	0.7

또한, 하기 표 2의 질량분석 결과로부터 유추한 각각의 균주의 파쇄물 내의 당지질(glycolipid)인 LTA 지표 1 및 LTA 지표 2의 기본구조에 GC-MS 분석 결과를 참고하여 구성하였다 (도 1).

< 실시예 3> 유산균 파쇄물의 산가수분해

상기 <실시예 1>에서 제조한 각각의 유산균주의 파쇄물을 산가수분해하였다.

< 실시예 4> 유산균 파쇄물 내의 LTA 의 지방산 함량 분석

<4-1> GC-MS 분석

각각의 균주 세포벽에 존재하는 리포테이코익산(lipoteichoic acid) 내의 지방산 구성을 분석하기 위하여, 상기 <실시예 3>에서 산가수분해한 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) K5-5, K55-5, K-8 및 K-88 균주의 파쇄물을 각각 GC-MS 분석을 수행하였다.

그 결과, 도 2에서와 같이, 균주별 LTA를 구성하는 지방산의 종류와 비율을 확인할 수 있었다. 구체적으로 K5-5 균주의 경우 팔미트산(palmitic acid)이 13.2% 및 올레산(oleic acid)이 86.8%였으며, K55-5 균주의 경우 팔미트산이 31.3%, trans-13-옥타데세노익산(trans-13-octadecenoic acid)이 35.6% 및 올레산이 33.2%였고, K-8 균주의 경우 팔미트산이 28.8%, 9-옥타데세노익산이 43.3%, trans-13-옥타데세노익산이 12.4% 및 9,10-메틸렌-옥타데카노익산(9,10-octadecanoic acid)이 15.4%였으며, K-88 균주의 경우 팔미트산이 41.4%, 9-옥타데세노익산 25.9%, trans-13-옥타데세노익산이 12.7% 및 9,10-메틸렌-옥타데카노익산이 19.9%로 나타나 유산균 균주의 파쇄물 내에 LTA를 구성하는 지방산 종류 및 함량이 균주별로 다름을 알 수 있었다 (도 2).

<4-2> 유산균 LTA 내 팔미트산 확인

각각의 균주 세포벽에 존재하는 리포테이코익산(lipoteichoic acid) 내의 지방산들 중 팔미트산을 확인하기 위하여, 상기 <실시예 3>에서 산가수분해한 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) K5-5, K55-5, K-8 및 K-88 균주의 파쇄물을 Agilent Q-TOF를 이용하여 분석하였다.

그 결과, 유산균주의 파쇄물을 산가수분해한 EtOAc 층의 MS 데이터와 팔미트산 표준물의 MS 데이터가 동일하여 두 물질이 동일한 물질임을 알 수 있었으며, 이로부터 유산균주의 세포벽 구성 당지질인 리포테이코익산 내에 팔미트산이 존재함을 다시 한번 확인할 수 있었다 (도 3).

따라서, 각각의 락토바실러스 플란타룸 균주별로 상이한 면역활성이 각각의 균주의 세포벽을 구성하는 LTA의 함량 및 LTA를 구성하는 지방산의 함량에 따라 상이한 것으로 판단되며, 이와 같이 각각의 유산균의 LTA를 구성하는 지방산의 함량을 분석하는 분석법은 면역조절기능이 있는 유산균 파쇄물의 원료 표준화에 활용될 수 있을 것이다. 더 나아가, 본 발명의 유산균 파쇄물의 지방산 분석을 통해 항염증 효과가 우수한 유산균 선별을 용이하게 할 수 있다.

Claims

1) 유산균 파쇄물을 제조하는 단계;
2) 상기 단계 1)의 유산균 파쇄물을 산가수분해하는 단계; 및
3) 상기 단계 2)의 산가수분해물의 지방산 종류 및 함량을 분석하는 단계를 포함하는 유산균 파쇄물의 원료표준화를 위한 분석법.

제 1항에 있어서, 상기 단계 1)의 유산균은 락토바실러스 델브루에키 아종 불가리쿠스, 스트렙토코코스 서모필러스, 락토코코스 락티스 아종 크레모리스, 락토바실러스 카세이, 락토바실러스 애시도필러스, 비피도박테리움 롱검, 락토코코스 락티스 아종 락티스, 비피도박테리움 아돌레센티스, 락토바실러스 플란타룸, 루코노스톡 메센테로이드 및 페디오코코스 펜토사세우스로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 유산균 파쇄물의 원료표준화를 위한 분석법.

제 1항에 있어서, 상기 단계 1) 이후에 유산균 파쇄물 내의 리포테이코익산(lipoteichoic acid, LTA)의 당지질을 검출하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 유산균 파쇄물의 원료표준화를 위한 분석법.

제 1항에 있어서, 상기 단계 3)의 지방산 종류 및 함량 분석은 LC-MS, GC-MS 또는 HPLC 분석인 것을 특징으로 하는 유산균 파쇄물의 원료표준화를 위한 분석법.

제 1항에 있어서, 상기 단계 3)의 지방산은 올레산(oleic acid), 옥타데세노익산(octadecenoic acid), 옥타데카노익산(octadecanoic acid) 팔미트산(palmitic acid) 또는 스테아릭산(stearic acid)인 것을 특징으로 하는 유산균 파쇄물의 원료표준화를 위한 분석법.

1) 유산균 파쇄물을 제조하는 단계;
2) 상기 단계 1)의 유산균 파쇄물을 산가수분해하는 단계;
3) 상기 단계 2)의 산가수분해물의 지방산 종류 및 함량을 분석하는 단계; 및
4) 상기 단계 3)에서 분석한 지방산 종류 및 함량과 항염증 효과가 우수한 표준 균주의 LTA 내의 지방산 종류 및 함량을 비교하는 단계를 포함하는 항염 유산균 선별 방법.

제 6항에 있어서, 상기 단계 1) 이후에 유산균 파쇄물 내의 리포테이코익산(lipoteichoic acid, LTA)의 당지질을 검출하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 항염 유산균 선별 방법.