JP2020523329A

JP2020523329A - バチルス・コアグランスの脂質低下効果

Info

Publication number: JP2020523329A
Application number: JP2019568048A
Authority: JP
Inventors: ムハンメドマジード; カリヤナムナガブシャナム; シャヒーンマジード; シヴァクマールアルムガム; フルカンアリ
Original assignee: サミラブズリミテッド
Priority date: 2017-06-09
Filing date: 2018-02-22
Publication date: 2020-08-06
Anticipated expiration: 2038-02-22
Also published as: CA3065162A1; WO2018226271A1; US20180353553A1; AU2018279794A1; KR20200014818A; JP7220677B2; EP3634439A4; CA3065162C; US11213553B2; EP3634439A1; NZ760204A

Abstract

Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓの脂質低下潜在能が開示される。より具体的には、本発明は、ＢａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓＭＴＣＣ５８５６のコレステロール低下潜在能およびその治療的／生物学的適用を開示する。

Description

関連特許出願の相互参照
本ＰＣＴ出願は、２０１７年６月９日に出願された米国仮出願第６２５１７３２０号の非仮出願であり、当該仮出願の内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
本発明は、全般的にはプロバイオティクスサプリメントの治療的／生物学的効果に関する。より具体的には、本発明は、バチルス・コアグランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓ）の脂質低下効果に関する。さらに一層具体的には、本発明は、ＢａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓＭＴＣＣ５８５６のコレステロール資化潜在能およびその治療的／生物学的適用に関する。

プロバイオティクスの補充による脂質低下効果は、これまで当技術分野において、以下の通り文書化されている。
1. Ataie-Jafari A, Larijani B, Alavi Majd H, Tahbaz F.Cholesterol-lowering effect of probiotic yogurt in comparison with ordinary yogurt in mildly to moderately hypercholesterolemic Subjects. Ann Nutr Metab.2009;54(1):22-7.)
2. Ejtahed HS, Mohtadi-Nia J, Homayouni-Rad A, Niafar M, Asghari-Jafarabadi M, Mofid V, et al. Effects of probiotic yogurt containing Lactobacillus acidophilus and Bifidobacterium lactis on lipid profile in individuals with type 2 diabetes mellitus. J Dairy Sci. 2011;94(7):3288-94.
3. Chang BJ, Park SU, Jang YS, Ko SH, Joo NM, Kim SI, et al. Effect of functional yogurt NY-YP901 in improving the trait of metabolic syndrome. Eur J Clin Nutr. 2011;65(11):1250-5.
4. Xiao JZ, Kondo S, Takahashi N, Miyaji K, Oshida K, Hiramatsu A, et al. Effects of milk products fermented by Bifidobacterium longum on blood lipids in rats and healthy adult male volunteers. J Dairy Sci. 2003;86(7):2452-61.
5. Guo Z et al,” Influence of consumption of probiotics on the plasma lipid profile: a meta-analysis of randomised controlled trials”, Nutr Metab Cardiovasc Dis. 2011 Nov;21(11):844-50.

米国特許文献である、米国特許第７２３２５７１号、米国特許第８３４９３３７号、米国特許第６８１１７８６号においても、他のコレステロール低下剤およびオリゴ糖と組み合わせた場合に、Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓ（Ｈａｍｍｅｒ株）がコレステロールを低下する性質が開示されている。しかしながら、科学文献にはまた、コレステロール低下効果を発揮するには、プロバイオティクスの補充では効果がない、または効果が不十分であることも記述されている。重要なものを以下に挙げる。
1. Jahreis G, Vogelsang H, Kiessling G, Schubert R, Bunte C, Hammes WP. Influence of probiotic sausage (Lactobacillus paracasei) on blood lipids and immunological parameters of healthy volunteers. Food Res Int. 2002; 35(2-3):133-8. [Consuming probiotic sausage containing 5×10⁹ CFU of L. paracasei LTH 2579 for 5 weeks had no influence on serum lipids in hypercholesterolemic subjects]
2. Lewis SJ, Burmeister S. A double-blind placebo-controlled study of the effects of Lactobacillus acidophilus on plasma lipids. Eur J Clin Nutr. 2005; 59(6):776-80 [ Supplementing hypercholesterolemic patients with 6×10¹⁰ CFU of L. acidophilus for 6 weeks did not improve lipid profile in hypercholesterolemic subjects].
3. Simons LA, Amansec SG, Conway P. Effect of Lactobacillus fermentum on serum lipids in subjects with elevated serum cholesterol. Nutr Metab Cardiovasc Dis. 2006;16(8):531-5 [Probiotic capsules containing 4×10⁹ CFU of L. fermentum for 10 weeks did not significantly modulate serum lipids in hypercholesterolemic subjects]
4. Hatakka K, Mutanen M, Holma R, Saxelin M, Korpela R, “Lactobacillus rhamnosus LC705 together with Propionibacterium freudenreichii ssp shermanii JS administered in capsules is ineffective in lowering serum lipids”, J Am Coll Nutr. 2008; 27(4):441-7.
5. Elnaz Vaghef-Mehrabany et al, “Effects of probiotic supplementation on lipid profile of women with rheumatoid arthritis: A randomized placebo-controlled clinical trial”, Health Promotion Perspectives, 2017, 7(2), 95-101 [Lactobacillus casei 1 could not improve serum lipids in rheumatoid arthritis patients].

一般に、プロバイオティクスの脂質低下効果の主要な機序には、腸内でのコレステロール吸収の低下、酵素による胆汁酸塩の脱抱合、プロバイオティクスの細胞膜へのコレステロールの取り込み、およびコレステロールからコプロスタノールへの変換が含まれる［Lye HS, Kuan CY, Ewe JA, Fung WY, Liong MT, “The improvement of hypertension by probiotics: effects on cholesterol, diabetes, renin and phytoestrogens. Int J Dairy Sci. 2009;10(9):3755-75;およびOoi LG, Liong MT, “Cholesterol-lowering effects of probiotics and prebiotics: a review of in vivo and in vitro findings”, Int J Mol Sci. 2010;11(6):2499-522］が、プロバイオティクス微生物のコレステロール低下効果の知見に一貫性がないことは、当技術分野における技術的問題となっている。この問題の技術的解決法は、プロバイオティクスの治療有益性は株特異的であり、一般化することができないという教示に十分に一致する脂質プロファイル有益性を備える独立型の株特異的なプロバイオティクスを同定することにある。Indian Council of Medical Research-Department of Biotechnology (ICMR-DBT), “Guidelines for the evaluation of probiotics in food (2011)を参照し、セクション２．３を参照されたい。また、Joint FAO/WHO Working Group Report on Drafting Guidelines for the Evaluation of Probiotics in Food London, Ontario, Canada, April 30 and May 1, 2002では、セクション３．１で、「エビデンスの現状は、プロバイオティクスの効果が株特異的であることを示唆している。株の同定は、株を特定の健康効果に関連づけるために、ならびに正確な調査および疫学的研究を可能にするために重要である。」と強調している。

したがって、本発明の原理目的は、新規であり自明でないＢａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓの脂質低下効果を開示することである。
本発明のさらに別の原理目的は、ＢａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓＭＴＣＣ５８５６の新規であり自明でないコレステロール資化効果を開示することである。
本発明は、前述の目的を達成し、さらに関連する利点を提供する。

本発明は、ＢａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓＭＴＣＣ５８５６のコレステロール低下潜在能およびその治療的／生物学的適用を開示する。
本発明の利点には、プロバイオティクスの株特異的な脂質プロファイル有益性の同定、具体的には、新規であり自明でないＢａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓＭＴＣＣ５８５６のコレステロール低下［コレステロール資化］効果の同定が含まれる。
本発明の他の特長および利点は、例として本発明の原理を説明する添付の画像と併せてみれば、以下のより詳細な説明から明らかになる。

ウシ胆汁（０．３％、ｗ／ｖ）およびＣａＣＯ₃（０．１％、ｗ／ｖ）を補充したｄｅＭａｎＲｏｇｏｓａａｎｄＳｈａｒｐｅ（ＭＲＳ）軟寒天を使用して胆汁酸塩ヒドロラーゼ（ＢＳＨ）活性を測定するプレートアッセイ法を示す図である。プレート中の空洞区域はＢａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓＭＴＣＣ５８５６による胆汁酸塩ヒドロラーゼ活性を示すものであった。ウシ胆汁の存在下で測定した際の、ＢａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓＭＴＣＣ５８５６増殖がコレステロール低下に及ぼす効果を示すグラフである。ウシ胆汁（０．３％、ｗ／ｖ）の存在下で測定した際の、ＢａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓＭＴＣＣ５８５６の増殖細胞、休止細胞および加熱死（死滅）細胞が、コレステロールの除去（％）に及ぼす効果を示すグラフである。ＢａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓＭＴＣＣ５８５６が、異なる食物源（卵黄、鶏レバーおよびバター）からのコレステロールの資化／低下に及ぼす効果を示すグラフである。＊ｐ＜０．０５；（スチューデントのｔ検定）。

最も好ましい実施形態では、本発明は、プロバイオティクス細菌Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓによるコレステロール資化の方法であって、前記プロバイオティクス細菌を含有する組成物を有効量レジメンで哺乳動物に投与して、哺乳動物におけるコレステロール低下の効果をもたらすステップを含む、方法に関する。関連する実施形態では、Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓの株はＢａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓＭＴＣＣ５８５６である。別の好ましい実施形態では、投与されるＢａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓは、栄養細胞または芽胞である。さらに別の関連する実施形態では、芽胞には、Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓの、生存している、または加熱死したもしくは死滅した芽胞が含まれる。さらに別の関連する実施形態では、栄養細胞には、Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓの、生存している、または加熱死したもしくは死滅した細胞が含まれる。別の関連する実施形態では、Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓは、錠剤、カプセル剤、シロップ剤、グミ剤、散剤、懸濁剤、乳剤、チュアブル剤、キャンディーおよび食料品の形態で経口投与される。別の関連する実施形態では、Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓの有効量は、約１×１０⁶〜１×１０¹⁴コロニー形成単位（ＣＦＵ）である。別の関連する実施形態では、Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓの有効量は、好ましくは２×１０⁹ｃｆｕである。別の関連する実施形態では、哺乳動物は、好ましくはヒトである。

別の好ましい実施形態では、本発明は、プロバイオティクス細菌Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓを使用することによるＢＳＨ産生および胆汁酸塩脱抱合の方法であって、前記プロバイオティクス細菌を含有する組成物を有効量レジメンで前記哺乳動物に投与して、所望のＢＳＨ産生および胆汁酸塩脱抱合の効果をもたらすステップを含む、方法に関する。関連する実施形態では、プロバイオティクス細菌ＢａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓによるＢＳＨの産生および胆汁酸塩の脱抱合は、哺乳動物における有効なコレステロール低下をもたらす。関連する実施形態では、Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓの株はＢａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓＭＴＣＣ５８５６である。別の好ましい実施形態では、投与されるＢａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓは、栄養細胞または芽胞である。さらに別の関連する実施形態では、芽胞には、Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓの、生存している、または加熱死したもしくは死滅した芽胞が含まれる。さらに別の関連する実施形態では、栄養細胞には、Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓの、生存している、または加熱死したもしくは死滅した細胞が含まれる。別の関連する実施形態では、Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓは、錠剤、カプセル剤、シロップ剤、グミ剤、散剤、懸濁剤、乳剤、チュアブル剤、キャンディーおよび食料品の形態で経口投与される。別の関連する実施形態では、Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓの有効量は、約１×１０⁶〜１×１０¹⁴ｃｆｕである。別の関連する実施形態では、Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓの有効量は、好ましくは２×１０⁹ｃｆｕである。別の関連する実施形態では、哺乳動物は、好ましくはヒトである。

さらに別の最も好ましい実施形態では、本発明は、プロバイオティクス細菌Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓを使用して哺乳動物の高コレステロール血症を予防または処置する方法であって、前記哺乳動物に前記プロバイオティクス細菌を含有する組成物を有効量レジメンで投与して、前記哺乳動物の血液中を循環しているコレステロールのレベルを低下させる効果をもたらすステップを含む、方法に関する。関連する実施形態では、Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓの株はＢａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓＭＴＣＣ５８５６である。別の好ましい実施形態では、投与されるＢａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓは、栄養細胞または芽胞である。さらに別の関連する実施形態では、芽胞には、Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓの、生存している、または加熱死したもしくは死滅した芽胞が含まれる。さらに別の関連する実施形態では、栄養細胞には、Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓの、生存している、または加熱死したもしくは死滅した細胞が含まれる。別の関連する実施形態では、Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓは、錠剤、カプセル剤、シロップ剤、グミ剤、散剤、懸濁剤、乳剤、チュアブル剤、キャンディーおよび食料品の形態で経口投与される。別の関連する実施形態では、Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓの有効量は、約１×１０⁶〜１×１０¹⁴ｃｆｕである。別の関連する実施形態では、Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓの有効量は、好ましくは２×１０⁹ｃｆｕである。別の関連する実施形態では、哺乳動物は、好ましくはヒトである。

さらに別の最も好ましい実施形態では、本発明は、プロバイオティクス細菌Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓを使用する、哺乳動物における脂質異常症の治療管理の方法であって、前記哺乳動物に、前記プロバイオティクス細菌を含有する組成物を有効量レジメンで投与して、血液中を循環しているコレステロールのレベルを低下させ、低比重リポタンパク質（ＬＤＬ）、低比重リポタンパク質（ＬＤＬ）−コレステロールの濃度を減少させ、血液中を循環しているトリグリセリドのレベルを低下させる効果をもたらすステップを含む、方法に関する。関連する実施形態では、Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓの株はＢａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓＭＴＣＣ５８５６である。別の好ましい実施形態では、投与されるＢａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓは、栄養細胞または芽胞である。さらに別の関連する実施形態では、芽胞には、Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓの、生存している、または加熱死したもしくは死滅した芽胞が含まれる。さらに別の関連する実施形態では、栄養細胞には、Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓの、生存している、または加熱死したもしくは死滅した細胞が含まれる。別の関連する実施形態では、Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓは、錠剤、カプセル剤、シロップ剤、グミ剤、散剤、懸濁剤、乳剤、チュアブル剤、キャンディーおよび食料品の形態で経口投与される。別の関連する実施形態では、Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓの有効量は、約１×１０⁶〜１×１０¹⁴ｃｆｕである。別の関連する実施形態では、Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓの有効量は、好ましくは２×１０⁹ｃｆｕである。別の関連する実施形態では、哺乳動物は、好ましくはヒトである。

さらに別の最も好ましい実施形態では、脂質異常症の治療管理は、高コレステロール誘発性アテローム性動脈硬化症、冠状動脈疾患、脂肪肝および関連する非アルコール性脂肪性肝疾患、糖尿病ならびに肥満症からなる群から選択される疾患状態を、発症前に予防するために行われる。

別の好ましい実施形態では、本発明は、プロバイオティクス細菌Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓによって食品中のコレステロール含量を低下させる方法であって、プレバイオティクス細菌を、胆汁酸塩および胆汁酸と一緒に、コレステロールを多く含む食品と接触させて、プロバイオティクス細菌による、食品からのコレステロールの低下および資化をもたらすステップを含む、方法を開示する。関連する実施形態では、Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓの株はＢａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓＭＴＣＣ５８５６である。別の関連する実施形態では、コレステロールを多く含む食品は、以下に限定されないが、鶏レバー、卵黄、魚および魚油、ファストフード、動物油脂、海産食品、加工肉、赤肉、チーズ、乳脂、バターおよび菓子からなる群から選択される。
以下の説明のための例は、本発明の技術の特長および利点を理解するために収載されている。

（例１）：ＢａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓＭＴＣＣ５８５６のコレステロール低下活性のｉｎ−ｖｉｔｒｏ評価
方法
胆汁酸塩ヒドロラーゼ（ＢＳＨ）活性
ａ）プレート法：ＢＳＨ活性を調べるためのプレートアッセイ法は、Dashkevicz M.P., Feighner S.D. (1989): Development of a differential medium for bile salt hydrolase-active Lactobacillus spp. Applied and Environmental Microbiology, 55: 11-16およびAhn,YT., G.B.Kim,K.S.Lim,Y.J.Baek,and H.U. Kim, “Deconjugation of bile salts by Lactobacillus acidophilus isolates,” International Dairy Journal, vol. 13, no. 4, pp. 303-311, 2003に記載されている方法に準拠し、少し変更を加えて実施した。寒天（１％、ｗ／ｖ）をＭＲＳブロス中に添加してＭＲＳ軟寒天を調製し、次いで胆汁酸塩（０．３％ｗ／ｖ；ウシ胆汁）およびＣａＣＯ₃（０．１％、ｗ／ｖ）を補充した。これを１２１℃で１５分間オートクレーブ処理し、プレートを準備し、室温で乾燥させた。ＢａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓＭＴＣＣ５８５６（１０μｌ、これは２×１０⁶ｃｆｕ／ｍｌに相当する）を１８時間培養しておき、これをＭＲＳ寒天に、この軟寒天中に刺すことによって播種した。次に、プレートを３７℃で７２時間インキュベートした。明確に視認できる刺した部分の周囲のハローは、ＢａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓＭＴＣＣ５８５６の胆汁酸塩ヒドロラーゼ（ＢＳＨ）活性が陽性であることを示すものであった。次いで、ハローの直径を測定することによって結果を査定した。胆汁酸塩を補充しないＭＲＳ寒天で増殖したＢａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓＭＴＣＣ５８５６を、陰性対照として使用した。測定は、３回繰り返した。
ｂ）薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）法：ＢａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓＭＴＣＣ５８５６の胆汁酸塩ヒドロラーゼ活性は、Guo C.F., Zhang l.W., Han X., Li J.Y., Du M., Yi H.X., Feng Z., Zhang Y.C., Xu X.R. (2011): Short communication: a sensitive method for qualitative screening of bile salt hydrolase-active lactobacilli based on thin-layer chromatography. Journal of Dairy Science, 94: 1732-1737に以前に記載されたＴＬＣプレート法に従って確認した。ＢａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓＭＴＣＣ５８５６をＭＲＳブロスに入れ、３７℃で１８時間増殖させ、次いで８０００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心分離した。次いで、細胞ペレットを２ｍｌの滅菌緩衝液（０．１ＭＰＢＳ、ｐＨ６．５）で洗浄した。洗浄後、５ｍｌの緩衝溶液をＢａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓＭＴＣＣ５８５６の細胞ペレットに添加した。細菌の懸濁液（１ｍｌ）を反応混合物（１ｍｌ）と混合した。この反応混合物は、リン酸緩衝液（０．１ｍｏｌ／ｌ）中に、ＭＲＳブロス、タウロデオキシコレート（ＴＤＣ、０．３％ｗ／ｖ）のナトリウム塩を含有し、最終ｐＨは６．５であった。次いで、株を３７℃で８時間培養した。培養後、試料を真空蒸発させ、次いで、残渣を１ｍｌのメタノールに溶解し、次いで、８，０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。上清をシリカＴＬＣプレート（１０×１０ｃｍ、ＴＬＣシリカゲル６０Ｆ２５４；Ｍｅｒｃｋ）のベースラインにスポットし、標準溶液、すなわちタウロデオキシコレートのメタノール（５ｍｍｏｌ／ｌ）溶液、デオキシコール酸のメタノール（５ｍｍｏｌ／ｌ）溶液もスポットした。移動相は、酢酸イソアミル、プロピオン酸、ｎ−プロパノールおよび水を４０：３０：２０：１０の比で含有していた。移動相を、ＴＬＣプレートに沿わせて３０分間移動させた。次いで、プレートを乾燥させ、リンモリブデン酸のエタノール中１０％ｗ／ｖ溶液をスプレーし、次いで熱風炉を使用して８０℃で５分間乾燥させた。デオキシコール酸は、ＢＳＨ陽性ＢａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓＭＴＣＣ５８５６によって胆汁酸塩から遊離された。ＴＬＣの結果を、標準と比較することによって評価した。

細菌の増殖およびコレステロール資化
コレステロールの存在下で、ＢａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓＭＴＣＣ５８５６の増殖を、様々な時間間隔で２４時間まで査定した。０．３０％ウシ胆汁および１００μｇ／ｍｌの水溶性コレステロール（ポリオキシエタニルコレステリルセバケート）を補充した滅菌ＭＲＳブロス培地に、ＢａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓＭＴＣＣ５８５６を播種した。次いでこれを、３７℃で穏やかに振盪させながら（１００ｒｐｍ）２４時間インキュベートした。試料を様々な時間間隔（０、６、１２、１８および２４時間）で採取し、ＵＶ−分光光度計（株式会社島津製作所ＵＶ−１６０１ＰＣ）を使用して、６００ｎｍで細菌の増殖を測定した。コレステロール資化は、ＲｕｄｅｌおよびＭｏｒｒｉｓ（１９７３）によって記載されている方法に従い、ＬｉｏｎｇおよびＳｈａｈ（２００５）によって提案された若干の変更を加えて測定した。インキュベート後、細胞を遠心分離し（８，０００ｒｐｍ、４℃で１０分間）、上清中の残留コレステロール濃度を、分光光度計（株式会社島津製作所ＵＶ−１６０１ＰＣ）法を使用して測定した。１ｍｌのアリコートに１ｍｌのＫＯＨ（３３％ｗ／ｖ）および２ｍｌの無水エタノールを添加し、１分間ボルテックスし、次いで３７℃で１５分間加熱した。冷却した後、２ｍｌの蒸留水および３ｍｌのヘキサンを添加し、１分間ボルテックスした。１ｍｌのヘキサン層をガラス管に移し、蒸発させた。残渣を２ｍｌのｏ−フタルアルデヒド試薬に直ちに溶解した。完全に混合した後、０．５ｍｌの濃硫酸を添加し、この混合物を１分間ボルテックスした。Rudel LL, Morris MD. Determination of cholesterol using o-phthalaldehyde. J Lipid Res. 1973;14 (3):364-6に記載されているように、１０分後に５５０ｎｍで吸光度を読み取った。実験はすべて３連で実施し、２回繰り返した。コレステロール濃度を、コレステロールの保存溶液を使用して用意した標準曲線から読み取った（図３）。ＢａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓＭＴＣＣ５８５６がコレステロールを資化する能力を、以下のように、各インキュベート間隔で除去されたコレステロールのパーセンテージとして表した。
コレステロールの資化／除去（％）＝１００−［（発酵後の残留コレステロール／添加された初期コレステロール）×１００］。

ＢａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓＭＴＣＣ５８５６の増殖細胞、休止細胞および加熱死（死滅）細胞によるコレステロールの除去／資化
ＢａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓＭＴＣＣ５８５６の休止細胞および加熱死（死滅）細胞などの非増殖細胞によってコレステロールを資化／除去する能力を測定し、増殖細胞と比較した。休止細胞は、ＢａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓＭＴＣＣ５８５６をＭＲＳ培地中で終夜増殖させ、次いで遠心分離（８，０００ｒｐｍ、４℃で１０分間）して細胞集団を得ることによって調製した。この細胞集団をさらに、０．３％（ｗ／ｖ）ウシ胆汁および１００μｇ／ｍｌの水溶性コレステロールを含有する滅菌リン酸緩衝液（０．０５Ｍ、ｐＨ６．５）中に懸濁させ、次いで３７℃で２４時間インキュベートした。加熱死（死滅）細胞は、ＢａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓＭＴＣＣ５８５６をＭＲＳ培地中で終夜増殖させ、次いで１２１℃で１５分間オートクレーブ処理することによって調製した。オートクレーブ処理後、細胞を遠心分離（８，０００ｒｐｍ、４℃で１０分間）によって回収し、０．３％（ｗ／ｖ）ウシ胆汁酸および１００μｇ／ｍｌの水溶性コレステロールを補充したＭＲＳブロス中に無菌的に懸濁させ、次いで３７℃で２４時間インキュベートした。増殖細胞は、ＢａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓＭＴＣＣ５８５６をＭＲＳ培地中で終夜増殖させることによって調製し、次いでこの１ｍｌを０．３％（ｗ／ｖ）ウシ胆汁酸および１００μｇ／ｍｌの水溶性コレステロールを補充したＭＲＳブロスに添加し、次いで３７℃で２４時間インキュベートした。インキュベート後、すべての試料を遠心分離し（８，０００ｒｐｍ、４℃で２０分間）、上清中のコレステロール濃度を、比色法に従って上記の分光光度計を使用して測定した。実験はすべて３連で実施し、２回アッセイした。

胃のストレス下でのＢａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓＭＴＣＣ５８５６による異なる食物源からのコレステロール資化
コレステロールを多く含む食物源に及ぼすＢａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓＭＴＣＣ５８５６によるコレステロール資化の効果を、de Palencia PF, Lopez P, Corbi AL, Pelaez C, Requena T. Probiotic strains: survival under simulated gastrointestinal conditions, in vitro adhesion to Caco-2 cells and effect on cytokine secretion. Eur Food Res Technol 2008; 227: 1475- 1484およびRitter P, Kohler C, von Ah U. Evaluation of the passage of Lactobacillus gasseri K7 and Bifidobacteria from the stomach to intestine using a single reactor model. BMC Microbiol 2009; 9: 87-95に以前に記載された方法によって、若干の変更を加えて調査した。既知の質量の卵黄、バター（牛乳脂）およびきれいに加工した鶏レバーを滅菌ビーカーに入れた。鶏レバーは、水で洗浄し、７０％エタノールに３０分間浸漬し、滅菌蒸留水ですすぎ、次いで０．２Ｍリン酸緩衝液ｐＨ７．０の中に添加することによってホモジナイズした。ｉｎ−ｖｉｖｏ条件を模倣するために、全試料を１０ｍｌの滅菌電解質溶液（６．２ｇ／ＬＮａＣｌ、２．２ｇ／ＬＫＣｌ、０．２２ｇ／ＬＣａＣｌ₂および１．２ｇ／ＬＮａＨＣＯ₃）およびリゾチーム（０．０１％、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）およびペプシン（０．３％、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）に添加した。１．０ｍｏｌ／ＬＨＣｌを添加することによって試料のｐＨを１．５まで下げた。ＢａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓＭＴＣＣ５８５６を各群に添加し、３７℃で穏やかに振盪させながら（１００ｒｐｍ）３時間インキュベートした。インキュベート後、滅菌炭酸水素ナトリウム飽和溶液（８％、ｗ／ｖ）を使用して、各試料のｐＨを無菌的に７．０に調整した。酸素還元酵素Ｏｘｙｒａｓｅ（Ｏｘｙｒａｓｅ（登録商標）ｆｏｒＢｒｏｔｈ、ＯｘｙｒａｓｅＩｎｃ、Ｏｈｉｏ、ＵＳＡ）を各フラスコに添加して、嫌気性環境を誘導した。滅菌胆汁酸塩（０．３％、ｗ／ｖ、ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ）およびブタ由来のパンクレアチン（０．１％、ｗ／ｖ、ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ）も各群に添加した。０．４５％胆汁酸塩および０．１％パンクレアチン（最終濃度、両者ともＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈから入手）を含有する滅菌電解質溶液を、全試料に添加した。全試料を３７℃で穏やかに振盪させながら（１００ｒｐｍ）２４時間インキュベートした。インキュベート後、試料を遠心分離し（８，０００ｒｐｍ、４℃で１０分間）、上清中のコレステロール含量を上記の方法で評価した。

結果：
ＢａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓＭＴＣＣ５８５６の胆汁酸塩ヒドロラーゼ活性
ＢａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓＭＴＣＣ５８５６の増殖が、ウシ胆汁および炭酸カルシウムを含有する寒天プレートで観察された。これにより、ウシ胆汁に対するその耐容性および胆汁酸塩ヒドロラーゼ活性の存在が示された。軟寒天プレート内に１８ｍｍの明らかな区域があり（図１）、これにより、胆汁酸塩ヒドロラーゼの存在が示された。さらに、胆汁酸塩ヒドロラーゼ活性を、感受性および容認可能性がさらに高いＴＬＣ法によって確認した。ＢａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓＭＴＣＣ５８５６によるタウロデオキシコール酸ナトリウムの加水分解およびデオキシコール酸の形成は、胆汁酸塩ヒドロラーゼの産生を明白に示唆した。標準的なデオキシコレートのＲｆ値は０．８９であったが、これはＢａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓＭＴＣＣ５８５６と一緒にインキュベートしたときにタウロデオキシコール酸ナトリウムから遊離されたデオキシコレートのＲｆ値と合致していた。

ＢａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓＭＴＣＣ５８５６によるコレステロールの資化／除去
ＢａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓＭＴＣＣ５８５６による時間依存性のコレステロールの資化／除去があった（図２）。インキュベート２４時間時点で、コレステロールの最大除去が観測され、最大増殖も２４時間時点で観測された。これは、ＢａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓＭＴＣＣ５８５６の増殖／コロニー形成がコレステロールの資化／除去を担っていることを示すものであった。さらに、様々な濃度のコレステロールを培地に添加し、ＢａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓＭＴＣＣ５８５６と一緒に、ウシ胆汁（胆汁酸塩）の存在下で、２４時間インキュベートした。時間依存性のコレステロールの資化／除去が認められた（表１）。しかし、コレステロールが最小濃度（２５μｇ／ｍｌ）であるか最大濃度（２００μｇ／ｍｌ）であるかに関係なく、資化はほぼ同様であり、コレステロールの最大資化／除去はインキュベート２４時間時点で認められた（表１）。

ＢａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓＭＴＣＣ５８５６の非増殖細胞によるコレステロールの資化／除去
増殖または非増殖（休止細胞または加熱死した死滅細胞）のＢａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓＭＴＣＣ５８５６がコレステロールを除去する能力を調査した。コレステロールの除去は、２４時間時点でそれぞれ、休止細胞および死滅細胞が３６．４６％および８．５％であったのと比較して、増殖細胞（４８．４２％）では著しく異なっていた（図３）。しかし、休止細胞および加熱死した死滅細胞もまた、コレステロールを除去することができていた。これは、ＢａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓＭＴＣＣ５８５６はその増殖形態または非増殖（休止および加熱死した死滅）形態においてコレステロールを資化／除去する能力を有していることを示すものであった。

コレステロールを多く含む食物におけるＢａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓＭＴＣＣ５８５６によるコレステロールの資化／除去
胃のストレス（酸および胆汁酸）下で、卵黄、鶏レバーおよびバターなどのコレステロールを多く含む食物源のコレステロールをＢａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓＭＴＣＣ５８５６が資化／除去する効果を、ＢａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓＭＴＣＣ５８５６のｉｎ−ｖｉｖｏ有効性を理解する目的で調査した。コレステロールを多く含む食物源すべてにおいて、ＢａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓＭＴＣＣ５８５６の発酵２４時間後にコレステロールの大幅な低下／資化が観測された（図４）。卵黄、鶏レバーおよびバターのコレステロールの低下は、ＢａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓＭＴＣＣ５８５６の発酵２４時間後に、それぞれ３９．７９％、４５．１４％および４９．５１％であった。この試験のデータから、ＢａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓＭＴＣＣ５８５６は、ｉｎ−ｖｉｖｏを模倣した条件で、食物中のコレステロールを資化／除去する能力を有しているという結論が得られ、このようにして有効性が確認された。

（例２）：ＢａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓＭＴＣＣ５８５６の脂質低下効果−臨床評価
倫理
施設倫理委員会
試験開始前に、関連性のある試験書類はすべて施設倫理委員会（ＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌＥｔｈｉｃｓＣｏｍｍｉｔｔｅｅ：ＩＥＣ）、ＬｉｆｅＣａｒｅＨｏｓｐｉｔａｌ、Ｂａｎｇａｌｏｒｅによってレビューされ、好意的意見が得られた。本ＩＥＣは、ＳａｍｉＬａｂｓＬｉｍｉｔｅｄまたはＣｌｉｎＷｏｒｌｄＰｒｉｖａｔｅＬｉｍｉｔｅｄ（ＣＲＯ）から独立して機能し、その運営は、連邦規則集（ＣｏｄｅｏｆＦｅｄｅｒａｌＲｅｇｕｌａｔｉｏｎｓ：ＣＦＲ）のタイトル２１パート５６および医薬品規制調和国際会議（ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＣｏｎｆｅｒｅｎｃｅｏｎＨａｒｍｏｎｉｚａｔｉｏｎ：ＩＣＨ）の各ガイドラインに従っている。上記の倫理委員会は、ＣＤＳＣＯの下で、１９４５年１２月２１日付の官報公告番号（ＧａｚｅｔｔｅＮｏｔｉｆｉｃａｔｉｏｎＮｕｍｂｅｒ）Ｆ．２８−１０／４５−Ｈ（１）により登録された。最終改正については２０１２年２月８日付の公告番号Ｇ．Ｓ．Ｒ．７６（Ｅ）を参照されたい。

試験の倫理的実施
本研究は、インドの薬物および化粧品法（ＤｒｕｇｓａｎｄＣｏｓｍｅｔｉｃｓＡｃｔ）１９４０年、インドの薬物および化粧品規則（ＤｒｕｇｓａｎｄＣｏｓｍｅｔｉｃｓＲｕｌｅｓ）１９４５年、インドにおけるインド医学研究評議会（ＩｎｄｉａｎＣｏｕｎｃｉｌｏｆＭｅｄｉｃａｌＲｅｓｅａｒｃｈ：ＩＣＭＲ）のヒト参加者の生物医学研究に関する倫理ガイドライン（ＥｔｈｉｃａｌＧｕｉｄｅｌｉｎｅｓｆｏｒＢｉｏｍｅｄｉｃａｌＲｅｓｅａｒｃｈｏｎＨｕｍａｎＰａｒｔｉｃｉｐａｎｔｓ）２００６年、ヘルシンキ宣言（ＤｅｃｌａｒａｔｉｏｎｏｆＨｅｌｓｉｎｋｉ）（Ｅｄｉｎｂｕｒｇｈ、２０００年）で言明された原理、およびＩＣＨ−優良臨床試験基準（ＧｏｏｄＣｌｉｎｉｃａｌＰｒａｃｔｉｃｅ：ＧＣＰ）に関する調和三極ガイドライン（ｈａｒｍｏｎｉｚｅｄｔｒｉｐａｒｔｉｔｅｇｕｉｄｅｌｉｎｅ）によって確立された各臨床研究ガイドラインに従って実施された。

被験者情報および同意
書面および口頭での、試験に関する情報を、試験志願者に容易に理解できる言語で用意した。スクリーニングに先立ち、考えられるリスクおよびベネフィットを含む本臨床試験の目的について、試験責任医師から各志願者に情報を提供し、インフォームドコンセントの手続きを患者のカルテに記録した。試験へのエントリーまたはいずれかの試験関連手続きの開始に先立ち、患者は、ＩＥＣが認可したインフォームドコンセントのフォームを読み、署名し、日付を記入した。各被験者が試験に参加するかどうかを決めるために十分な時間を設け、試験に関する質問および説明はすべて、患者の納得が得られるまで試験責任医師から明確に説明した。同意した人は、最終同意書の頁にも署名し、日付を記入した。試験に参加するという被験者の意志を、試験責任医師が元記録書に記録した。最初の署名済みインフォームドコンセントのフォームには、試験の目的、実行すべき手順、および考えられる危険性がある場合はそれが、非技術用語でまとめられている。

試験の理論的根拠
本臨床試験は、脂質異常症の患者（ｎ＝３０）におけるＢａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓＭＴＣＣ５８５６（２×１０⁹ｃｆｕ）の有効性および安全性を査定するために計画された。
試験の目的
主要目的
主要な目的は、脂質異常症の患者におけるＢａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓＭＴＣＣ５８５６の有効性を査定することであった。
有効性評価項目
・脂質プロファイルの変化。
・生活の質の変化。
副次的目的
副次的目的は、脂質異常症の患者におけるＢａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓＭＴＣＣ５８５６（２×１０⁹ｃｆｕ）の安全性を査定することであった。

安全性評価項目
・何らかの有害事象または重篤な有害事象の報告。
・異常なバイタルサインおよび臨床検査パラメーター。
試験集団の選定
被験者が、選択基準のすべてに「はい」を、および除外基準のすべてに「いいえ」を示した場合、試験に組み入れた。
選択基準
選択基準は次の通りとした。
１．脂質異常症の患者。
２．年齢が３０〜６５歳。
３．リクルートメント前の直近２カ月間にプロバイオティクスをいずれも摂取していない。
４．試験実施計画書に従うことができる。
除外基準
除外基準は次の通りとした。
１．妊婦、授乳婦、または試験において指定された避妊に同意しない被験者。
２．急性または慢性の疾病（がんまたは関節リウマチなど）の既往歴。
３．リクルートメント時および介入期中に腸内微生物の生存能に影響を及ぼす恐れのあるステロイドまたは抗生物質などのいずれかの薬物の使用。
４．先立つ９０日間に臨床試験に参加。
５．何らかの採血禁忌。
６．日常食にヨーグルトを使用している患者。

処置ライン
投与用量および処置レジメン
被験者に、２×１０⁹ｃｆｕを含有するＢａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓＭＴＣＣ５８５６のカプセル剤を、１日１回１カプセル、９０日間経口投与した。
以前の、および併用の治療
過去に使用していた薬物をすべて聞き出して記録した。試験期間中に使用した他の薬物もすべて記録した。被験者を定期的に追跡調査し、スクリーニング時から追跡調査来院までのすべての併用投与を把握して記録し、試験において、合併症のおよび併用の薬剤を把握した。
処置のコンプライアンス
試験薬物の服用コンプライアンスを来院の度に点検した。戻された薬物の調査および患者への問診によりこの課題を遂行した。説明責任の記録はすべて、試験責任医師の試験ファイルに組み入れた。

有効性および安全性の可変要素を査定する方法
スクリーニングから９０日目までの臨床検査パラメーターの変化を観測した。スクリーニング時に血液試料（１２．０ｍｌ）が遠心分離管の中に採取される。採取、試料の移送および処理は、臨床検査マニュアルで推奨または特定されている通りに実施される。
以下について査定した。
血液学的検査（ヘモグロビン、血中血球容積、白血球数−白血球分画、平均赤血球容積、平均赤血球ヘモグロビン、平均赤血球ヘモグロビン濃度、平均血小板容積）。
完全脂質プロファイル（低比重リポタンパク質、超低比重リポタンパク質、高比重リポタンパク質、総コレステロール、トリグリセリド）。
尿妊娠検査−閉経が来ていない女性は全員、妊娠検査を受ける。

統計法
臨床検査データは、生データの要約統計量およびベースラインから試験終了までの変化を示すベースライン値からの変化を提示して集計した。本試験において使用し、実施した統計手段は統計解析計画書に詳述され、これに従って解析が行われる。年齢などの連続型データについては、記述統計学の平均値、最頻値、中央値、Ｑ１、Ｑ３、ＩＱＲ、ひげ、９５％ＣＩ平均値および９５％ＣＩを提示した。性別などのカテゴリーデータについては、頻度およびパーセンテージを提示した。肝臓プロファイルのようなすべてのパラメーターについては、抗酸化酵素（バイオマーカー）、血液学的検査、脂質プロファイル、および生活の質の質問表を、スクリーニングから４回目の来院までで集計した。スクリーニングと４回目の来院との間でＱＯＬ領域についてＰ値を測定した。Ｐ値は、ＭＩＮＩＴＡＢで、ルビーンのスケール検定を使用して解析した。これらのスコアは、平均値変化のルビーンのスケールについて、帰無仮説の方法を使用し、２標本ｔ検定および多重比較を使用して得た。製品の有効性の解析は、脂質および糖尿病性のプロファイルについて評価し、これは、ＡＮＯＶＡおよび多重比較ｔ−検定ならびに帰無仮説の方法によって実施した。これらの有効性パラメーターについて、実施計画書に０日目から９０日目までと通知されていた１回目の来院から４回目の来院まで、平均値変化のＰ値を、観測し、計算した。血液学的プロファイルのような安全性パラメーターについて、０日目から９０日目まで、ｔ−検定およびＡＮＯＶＡにより、平均の平均値およびＰ値を９５％ＣＩ平均値とともに計算した。人口統計学的プロファイルについては、平均および範囲を単純な統計法によって得た。

安全性評価
安全性の査定は、主に被験者による有害事象の報告に基づくものとした。他の安全性データ（例えば、バイタルサイン、臨床検査）は、数字を提示することによって集計したが、有害事象は発生しなかった。臨床検査データは、臨床検査値の生データの要約統計量およびスクリーニング値からの変化、ならびにスクリーニングから試験終了までの変化を示す変化表を、参照正常範囲と比較して提示することによって集計した。
有害事象の解析：９０日目に臨床現場に来院した患者から、１５日間の電話による追跡調査まで、有害事象は報告されなかった。
死亡、他の重篤な有害事象、および他の重要な有害事象：本試験において、重篤な有害事象も重要な有害事象も認められなかった。

結果
選択基準および除外基準の厳格な基準線に鑑みて、合計３０名の被験者を登録した。代表試験責任医師および試験チームは実施計画書に厳格に従った。試験の全般的な安全性および有効性のパラメーターは、平均値変化およびＰ値に基づいて計算した。試験の有効性パラメーターは脂質プロファイルについて評価し、安全性パラメーターは、血液学的検査のような血液検査および人口統計学的プロファイルとした。有効性パラメーターについて、スクリーニングから９０日目までの平均値変化により結果を正当と認めた。以下の表に、患者のスクリーニング来院での人口統計学的データを報告している。

安全性評価
曝露期間：９０日。
有害事象の概要
安全性評価のために、本試験において考察されるパラメーターは、身体検査、バイタルサイン、すなわち血圧、心拍数、脈拍数および呼吸数とした。
有害事象の解析
スクリーニングから試験終了まで、バイタル、臨床検査パラメーターおよび臨床所見に関して統計的に有意な変化は認められなかった。

患者の個々の臨床検査測定値およびそれぞれの異常な臨床検査値の一覧化
異常な臨床検査値は認められなかった。
死亡、他の重篤な有害事象および他の重要な有害事象
本試験に登録した患者にはひとりも、重篤なまたは重要な有害事象はみられなかった。本試験において死亡は報告されなかった。

安全性の結論
スクリーニング来院時、および試験の全期間中、バイタルサインは正常であった。統計的に有意な変化は認められなかった。スクリーニングから試験終了まで、臨床検査パラメーターに関して、安全性に関する臨床的有意性は認められなかった。
表４および表５に、スクリーニングおよび最終来院での安全性パラメーターを報告している。

有効性評価
総コレステロール、ＬＤＬ、ＴＧおよび生活の質のような有効性パラメーターについては、ＢａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓＭＴＣＣ５８５６について、平均値変化のＰ値がｐ≦０．０５として得られた。これは、ＢａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓＭＴＣＣ５８５６が、０日目から９０日目まで、総コレステロール、ＬＤＬ、ＴＧおよび生活の質に対して統計的に有意な効果を示したことを意味する。

（例３）：Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓを含有する、コレステロールを低下する組成物／配合物
表７、表８および表９は、コレステロールを低下するためのＢａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓを含有する配合物食品を説明する例を挙げている。

表１０、表１１および表１２は、コレステロールを低下するためのＢａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓを含有する栄養補助配合物を説明する例を挙げている。

上記の配合物は単に説明するための例であり、前記目的に向けられた上記の活性成分を含有する配合物はいずれも、均等物であると考えられる。
本発明を好ましい実施形態に関して説明してきたが、本発明はそれらに限定されないことが当業者に明確に理解されるべきである。むしろ、本発明の範囲は添付の特許請求の範囲と併せてのみ、解釈されるべきである。

上記の配合物は単に説明するための例であり、前記目的に向けられた上記の活性成分を含有する配合物はいずれも、均等物であると考えられる。
本発明を好ましい実施形態に関して説明してきたが、本発明はそれらに限定されないことが当業者に明確に理解されるべきである。むしろ、本発明の範囲は添付の特許請求の範囲と併せてのみ、解釈されるべきである。
本発明の好ましい態様は、下記の通りである。
〔１〕プロバイオティクス細菌Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓによるコレステロールの資化、吸収および除去の方法であって、哺乳動物に前記プロバイオティクス細菌を含有する組成物を有効量レジメンで投与して、前記細菌によって哺乳動物におけるコレステロールの除去／低下の効果をもたらす工程を含む、方法。
〔２〕Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓの株が、ＢａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓＭＴＣＣ５８５６である、前記〔１〕に記載の方法。
〔３〕Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓが、栄養細胞または芽胞の形態で投与される、前記〔１〕に記載の方法。
〔４〕前記芽胞が、Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓの、生存している、または加熱死したもしくは死滅した芽胞を含む、前記〔１〕に記載の方法。
〔５〕前記栄養細胞が、Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓの、生存している、または加熱死したもしくは死滅した細胞を含む、前記〔１〕に記載の方法。
〔６〕Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓが、錠剤、カプセル剤、シロップ剤、グミ剤、散剤、懸濁剤、乳剤、チュアブル剤、キャンディーおよび食料品の形態で経口投与される、前記〔１〕に記載の方法。
〔７〕Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓの有効量が、約１×１０ ⁶ 〜１×１０ ¹⁴ ｃｆｕである、前記〔１〕に記載の方法。
〔８〕Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓの有効量が、好ましくは２×１０ ⁹ ｃｆｕである、前記〔１〕に記載の方法。
〔９〕前記哺乳動物が、好ましくはヒトである、前記〔１〕に記載の方法。
〔１０〕プロバイオティクス細菌Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓを使用することによる胆汁酸塩ヒドロラーゼ産生および胆汁酸塩脱抱合の方法であって、哺乳動物に前記プロバイオティクス細菌を含有する組成物を有効量レジメンで投与して、胆汁酸塩ヒドロラーゼ産生および胆汁酸塩脱抱合の所望の効果をもたらす工程を含む、方法。
〔１１〕プロバイオティクス細菌ＢａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓによるＢＳＨの産生および胆汁酸塩の脱抱合が、哺乳動物における有効なコレステロール低下をもたらす、前記〔１０〕に記載の方法。
〔１２〕Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓの株が、ＢａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓＭＴＣＣ５８５６である、前記〔１０〕に記載の方法。
〔１３〕投与されるＢａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓが、栄養細胞または芽胞である、前記〔１０〕に記載の方法。
〔１４〕前記芽胞が、Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓの、生存している、または加熱死したもしくは死滅した芽胞を含む、前記〔１０〕に記載の方法。
〔１５〕前記栄養細胞が、Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓの、生存している、または加熱死したもしくは死滅した細胞を含む、前記〔１０〕に記載の方法。
〔１６〕Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓが、錠剤、カプセル剤、シロップ剤、グミ剤、散剤、懸濁剤、乳剤、チュアブル剤、キャンディーおよび食料品の形態で経口投与される、前記〔１０〕に記載の方法。
〔１７〕Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓの有効量が、約１×１０ ⁶ 〜１×１０ ¹⁴ ｃｆｕである、前記〔１０〕に記載の方法。
〔１８〕Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓの有効量が、好ましくは２×１０ ⁹ ｃｆｕである、前記〔１０〕に記載の方法。
〔１９〕前記哺乳動物が、好ましくはヒトである、前記〔１０〕に記載の方法。
〔２０〕プロバイオティクス細菌Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓを使用する、哺乳動物における高コレステロール血症を予防または処置する方法であって、前記哺乳動物に前記プロバイオティクス細菌を含有する組成物を有効量レジメンで投与して、前記哺乳動物の血液中の循環コレステロールのレベルを低下させる効果をもたらす工程を含む、方法。
〔２１〕Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓの株が、ＢａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓＭＴＣＣ５８５６である、前記〔２０〕に記載の方法。
〔２２〕Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓが、栄養細胞または芽胞の形態で投与される、前記〔２０〕に記載の方法。
〔２３〕前記芽胞が、Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓの、生存している、または加熱死したもしくは死滅した芽胞を含む、前記〔２０〕に記載の方法。
〔２４〕前記栄養細胞が、Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓの、生存している、または加熱死したもしくは死滅した細胞を含む、前記〔２０〕に記載の方法。
〔２５〕Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓが、錠剤、カプセル剤、シロップ剤、グミ剤、散剤、懸濁剤、乳剤、チュアブル剤、キャンディーおよび食料品の形態で経口投与される、前記〔２０〕に記載の方法。
〔２６〕Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓの有効量が、約１×１０ ⁶ 〜１×１０ ¹⁴ ｃｆｕである、前記〔２０〕に記載の方法。
〔２７〕Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓの有効量が、好ましくは２×１０ ⁹ ｃｆｕである、前記〔２０〕に記載の方法。
〔２８〕前記哺乳動物が、好ましくはヒトである、前記〔２０〕に記載の方法。
〔２９〕プロバイオティクス細菌Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓを使用する、哺乳動物における脂質異常症の治療管理の方法であって、前記哺乳動物に前記プロバイオティクス細菌を含有する組成物を有効量レジメンで投与して、血液中の循環コレステロールのレベルを低下させ、低比重リポタンパク質、低比重リポタンパク質−コレステロールの濃度を減少させ、血液中の循環トリグリセリドのレベルを低下させる効果をもたらす工程を含む、方法。
〔３０〕Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓの株が、ＢａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓＭＴＣＣ５８５６である、前記〔２９〕に記載の方法。
〔３１〕Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓが、栄養細胞または芽胞の形態で投与される、前記〔２９〕に記載の方法。
〔３２〕前記芽胞が、Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓの、生存している、または加熱死したもしくは死滅した芽胞を含む、前記〔２９〕に記載の方法。
〔３３〕前記栄養細胞が、Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓの、生存している、または加熱死したもしくは死滅した細胞を含む、前記〔２９〕に記載の方法。
〔３４〕Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓが、錠剤、カプセル剤、シロップ剤、グミ剤、散剤、懸濁剤、乳剤、チュアブル剤、キャンディーおよび食料品の形態で経口投与される、前記〔２９〕に記載の方法。
〔３５〕Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓの有効量が、約１×１０ ⁶ 〜１×１０ ¹⁴ ｃｆｕである、前記〔２９〕に記載の方法。
〔３６〕Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓの有効量が、好ましくは２×１０ ⁹ ｃｆｕである、前記〔２９〕に記載の方法。
〔３７〕脂質異常症の治療管理が、高コレステロール誘発性アテローム性動脈硬化症、冠状動脈疾患、脂肪肝および関連する非アルコール性脂肪性肝疾患、糖尿病ならびに肥満症からなる群から選択される疾患状態を、発症前に予防するために行われる、前記〔２９〕に記載の方法。
〔３８〕前記哺乳動物が、好ましくはヒトである、前記〔２９〕に記載の方法。
〔３９〕プロバイオティクス細菌Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓによって食品中のコレステロール含量を低下させる方法であって、前記プレバイオティクス細菌を、胆汁酸塩および胆汁酸と一緒に、コレステロールを多く含む食品と接触させて、前記プロバイオティクス細菌による、前記食品からのコレステロールの低下および資化をもたらす工程を含む、方法。
〔４０〕Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓの株が、ＢａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓＭＴＣＣ５８５６である、前記〔３９〕に記載の方法。
〔４１〕コレステロールを多く含む食品が、鶏レバー、卵黄、魚および魚油、ファストフード、動物油脂、海産食品、加工肉、赤肉、チーズ、乳脂、バターおよび菓子からなる群から選択されるが、これらに限定されない、前記〔３９〕に記載の方法。

Claims

プロバイオティクス細菌Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓによるコレステロールの資化、吸収および除去の方法であって、哺乳動物に前記プロバイオティクス細菌を含有する組成物を有効量レジメンで投与して、前記細菌によって哺乳動物におけるコレステロールの除去／低下の効果をもたらす工程を含む、方法。
Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓの株が、ＢａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓＭＴＣＣ５８５６である、請求項１に記載の方法。
Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓが、栄養細胞または芽胞の形態で投与される、請求項１に記載の方法。
前記芽胞が、Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓの、生存している、または加熱死したもしくは死滅した芽胞を含む、請求項１に記載の方法。
前記栄養細胞が、Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓの、生存している、または加熱死したもしくは死滅した細胞を含む、請求項１に記載の方法。
Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓが、錠剤、カプセル剤、シロップ剤、グミ剤、散剤、懸濁剤、乳剤、チュアブル剤、キャンディーおよび食料品の形態で経口投与される、請求項１に記載の方法。
Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓの有効量が、約１×１０⁶〜１×１０¹⁴ｃｆｕである、請求項１に記載の方法。
Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓの有効量が、好ましくは２×１０⁹ｃｆｕである、請求項１に記載の方法。
前記哺乳動物が、好ましくはヒトである、請求項１に記載の方法。
プロバイオティクス細菌Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓを使用することによる胆汁酸塩ヒドロラーゼ産生および胆汁酸塩脱抱合の方法であって、哺乳動物に前記プロバイオティクス細菌を含有する組成物を有効量レジメンで投与して、胆汁酸塩ヒドロラーゼ産生および胆汁酸塩脱抱合の所望の効果をもたらす工程を含む、方法。
プロバイオティクス細菌ＢａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓによるＢＳＨの産生および胆汁酸塩の脱抱合が、哺乳動物における有効なコレステロール低下をもたらす、請求項１０に記載の方法。
Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓの株が、ＢａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓＭＴＣＣ５８５６である、請求項１０に記載の方法。
投与されるＢａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓが、栄養細胞または芽胞である、請求項１０に記載の方法。
前記芽胞が、Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓの、生存している、または加熱死したもしくは死滅した芽胞を含む、請求項１０に記載の方法。
前記栄養細胞が、Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓの、生存している、または加熱死したもしくは死滅した細胞を含む、請求項１０に記載の方法。
Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓが、錠剤、カプセル剤、シロップ剤、グミ剤、散剤、懸濁剤、乳剤、チュアブル剤、キャンディーおよび食料品の形態で経口投与される、請求項１０に記載の方法。
Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓの有効量が、約１×１０⁶〜１×１０¹⁴ｃｆｕである、請求項１０に記載の方法。
Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓの有効量が、好ましくは２×１０⁹ｃｆｕである、請求項１０に記載の方法。
前記哺乳動物が、好ましくはヒトである、請求項１０に記載の方法。
プロバイオティクス細菌Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓを使用する、哺乳動物における高コレステロール血症を予防または処置する方法であって、前記哺乳動物に前記プロバイオティクス細菌を含有する組成物を有効量レジメンで投与して、前記哺乳動物の血液中の循環コレステロールのレベルを低下させる効果をもたらす工程を含む、方法。
Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓの株が、ＢａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓＭＴＣＣ５８５６である、請求項２０に記載の方法。
Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓが、栄養細胞または芽胞の形態で投与される、請求項２０に記載の方法。
前記芽胞が、Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓの、生存している、または加熱死したもしくは死滅した芽胞を含む、請求項２０に記載の方法。
前記栄養細胞が、Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓの、生存している、または加熱死したもしくは死滅した細胞を含む、請求項２０に記載の方法。
Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓが、錠剤、カプセル剤、シロップ剤、グミ剤、散剤、懸濁剤、乳剤、チュアブル剤、キャンディーおよび食料品の形態で経口投与される、請求項２０に記載の方法。
Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓの有効量が、約１×１０⁶〜１×１０¹⁴ｃｆｕである、請求項２０に記載の方法。
Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓの有効量が、好ましくは２×１０⁹ｃｆｕである、請求項２０に記載の方法。
前記哺乳動物が、好ましくはヒトである、請求項２０に記載の方法。
プロバイオティクス細菌Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓを使用する、哺乳動物における脂質異常症の治療管理の方法であって、前記哺乳動物に前記プロバイオティクス細菌を含有する組成物を有効量レジメンで投与して、血液中の循環コレステロールのレベルを低下させ、低比重リポタンパク質、低比重リポタンパク質−コレステロールの濃度を減少させ、血液中の循環トリグリセリドのレベルを低下させる効果をもたらす工程を含む、方法。
Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓの株が、ＢａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓＭＴＣＣ５８５６である、請求項２９に記載の方法。
Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓが、栄養細胞または芽胞の形態で投与される、請求項２９に記載の方法。
前記芽胞が、Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓの、生存している、または加熱死したもしくは死滅した芽胞を含む、請求項２９に記載の方法。
前記栄養細胞が、Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓの、生存している、または加熱死したもしくは死滅した細胞を含む、請求項２９に記載の方法。
Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓが、錠剤、カプセル剤、シロップ剤、グミ剤、散剤、懸濁剤、乳剤、チュアブル剤、キャンディーおよび食料品の形態で経口投与される、請求項２９に記載の方法。
Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓの有効量が、約１×１０⁶〜１×１０¹⁴ｃｆｕである、請求項２９に記載の方法。
Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓの有効量が、好ましくは２×１０⁹ｃｆｕである、請求項２９に記載の方法。
脂質異常症の治療管理が、高コレステロール誘発性アテローム性動脈硬化症、冠状動脈疾患、脂肪肝および関連する非アルコール性脂肪性肝疾患、糖尿病ならびに肥満症からなる群から選択される疾患状態を、発症前に予防するために行われる、請求項２９に記載の方法。
前記哺乳動物が、好ましくはヒトである、請求項２９に記載の方法。
プロバイオティクス細菌Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓによって食品中のコレステロール含量を低下させる方法であって、前記プレバイオティクス細菌を、胆汁酸塩および胆汁酸と一緒に、コレステロールを多く含む食品と接触させて、前記プロバイオティクス細菌による、前記食品からのコレステロールの低下および資化をもたらす工程を含む、方法。
Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓの株が、ＢａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓＭＴＣＣ５８５６である、請求項３９に記載の方法。
コレステロールを多く含む食品が、鶏レバー、卵黄、魚および魚油、ファストフード、動物油脂、海産食品、加工肉、赤肉、チーズ、乳脂、バターおよび菓子からなる群から選択されるが、これらに限定されない、請求項３９に記載の方法。