KR20200014818A - 바실러스 코아귤런스의 저지질혈증 효과 - Google Patents

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Abstract

바실러스 코아귤런스의 저지질혈증 잠재력(hypolipidemic potential)이 개시된다. 더욱 구체적으로는, 본 발명은 바실러스 코아귤런스 MTCC 5856의 콜레스테롤 저하 잠재력 및 이의 치료학적/생물학적 적응증(indication)을 개시한다.

Description

바실러스 코아귤런스의 저지질혈증 효과
관련출원의 상호참조
본 PCT 출원은 2017년 6월 9일자 미국 가출원 제62517320호의 정규 출원이고, 상기 가출원의 내용이 본원에 참고로 포함된다.
기술분야
본 발명은 대체로, 프로바이오틱 보조제(probiotic supplements)의 치료학적/생물학적 효과에 관한 것이다. 더욱 구체적으로는, 본 발명은 바실러스 코아귤런 스의 저지질혈증 효과(hypolipidemic effect)에 관한 것이다. 더욱 더 구체적으로는, 본 발명은 바실러스 코아귤런스 MTCC 5856의 콜레스테롤 동화 잠재력(cholesterol assimilation potential) 및 이의 치료학적/생물학적 적응증(indication)에 관련된 것이다.
프로바이오틱 보충의 저지질혈증 효과는 다음과 같이 당해분야에서 이전에 문서화되었다:
1. Ataie-Jafari A, Larijani B, Alavi Majd H, Tahbaz F.Cholesterol-lowering effect of probiotic yogurt in comparison with ordinary yogurt in mildly to moderately hypercholesterolemic Subjects. Ann Nutr Metab.2009;54(1):22-7;
2. Ejtahed HS, Mohtadi-Nia J, Homayouni-Rad A, Niafar M, Asghari-Jafarabadi M, Mofid V, 외. Effects of probiotic yogurt containing Lactobacillus acidophilus and Bifidobacterium lactis on lipid profile in individuals with type 2 diabetes mellitus. J Dairy Sci. 2011;94(7):3288-94;
3. Chang BJ, Park SU, Jang YS, Ko SH, Joo NM, Kim SI, 외. Effect of functional yogurt NY-YP901 in improving the trait of metabolic syndrome. Eur J Clin Nutr. 2011;65(11):1250-5;
4. Xiao JZ, Kondo S, Takahashi N, Miyaji K, Oshida K, Hiramatsu A, 외. Effects of milk products fermented by Bifidobacterium longum on blood lipids in rats and healthy adult male volunteers. J Dairy Sci. 2003;86(7):2452-61; 및
5. Guo Z 외, "Influence of consumption of probiotics on the plasma lipid profile: a meta-analysis of randomised controlled trials", Nutr Metab Cardiovasc Dis. 2011 Nov;21(11):844-50.
또한, 미국 특허문헌 US 제7232571호, US 제8349337호 및 US 제6811786호는 기타 콜레스테롤 감소제 및 올리고당과 병용되는 바실러스 코아귤런스 (해머 균주)의 콜레스테롤 감소 특성을 개시한다. 그러나, 과학기술 문헌은 또한, 저콜레스테롤 혈증 효과를 발휘하는 프로바이오틱 보충의 무효력(inefficacy) 또는 좋지 못한 효력을 문서화했다. 중요한 과학기술 문헌은 다음을 포함한다:
1. Jahreis G, Vogelsang H, Kiessling G, Schubert R, Bunte C, Hammes WP. Influence of probiotic sausage (Lactobacillus paracasei) on blood lipids and immunological parameters of healthy volunteers. Food Res Int. 2002; 35(2-3):133-8. [5Х109 CFU의 락토바실러스 파라카제이 (L. paracasei ) LTH 2579를 함유하는 프로바이오틱 소세지를 5주 동안 소비하는 것은 고콜레스테롤 대상체(hypercholesterolemic subject)의 혈청 지질(serum lipid)에 영향을 끼치지 않았다];
2. Lewis SJ, Burmeister S. A double-blind placebo-controlled study of the effects of Lactobacillus acidophilus on plasma lipids. Eur J Clin Nutr. 2005; 59(6):776-80 [고콜레스테롤 환자(hypercholesterolemic patient)에게 6Х1010 CFU의 락토바실러스 아시도필루스(L. acidophilus)를 6주 동안 보충하는 것은 고콜레스테롤 대상체에서 지질 프로필(lipid profile)을 개선시키지 않았다];
3. Simons LA, Amansec SG, Conway P. Effect of Lactobacillus fermentum on serum lipids in subjects with elevated serum cholesterol. Nutr Metab Cardiovasc Dis. 2006;16(8):531-5 [10주 동안의 4Х109 CFU의 락토바실러스 퍼 멘텀(L. fermentum )을 함유하는 프로바이오틱 캡슐제는 고콜레스테롤 대상체에서 혈청 지질을 유의하게 조절하지 않았다];
4. Hatakka K, Mutanen M, Holma R, Saxelin M, Korpela R, "Lactobacillus rhamnosus LC705 together with Propionibacterium freudenreichii ssp shermanii JS administered in capsules is ineffective in lowering serum lipids", J Am Coll Nutr. 2008; 27(4):441-7; 및
5. Elnaz Vaghef-Mehrabany 외, "Effects of probiotic supplementation on lipid profile of women with rheumatoid arthritis: A randomized placebo-controlled clinical trial", Health Promotion Perspectives, 2017, 7(2), 95-101 [락토바실러스 카제이 (Lactobacillus casei ) 1은 류마티스 관절염 환자에서 혈청 지질을 개선시킬 수 없었다].
대체로, 프로바이오틱스의 저질혈증 효과에 대한 주요 메커니즘이 장에서의 콜레스테롤 흡수의 감소, 담즙염(bile salt)의 효소 탈포합(enzymatic deconjugation), 프로바이오틱 세포막으로의 콜레스테롤의 편입(incorporation), 및 코프로스타놀(coprostanol)로의 콜레스테롤의 전환을 포함하나 [Lye HS, Kuan CY, Ewe JA, Fung WY, Liong MT, "The improvement of hypertension by probiotics: effects on cholesterol, diabetes, renin and phytoestrogens. Int J Dairy Sci. 2009;10(9):3755-75; 및 Ooi LG, Liong MT, "Cholesterol-lowering effects of probiotics and prebiotics: a review of in vivo and in vitro findings", Int J Mol Sci. 2010;11(6):2499-522], 프로바이오틱 미생물의 저콜레스테롤혈증 효과의 모순되는 발견이 당해분야의 기술적 문제점이다. 상기 문제점에 대한 기술적 해결방안은 프로바이오틱의 치료학적 이점이 균주-특이적이고 일반화될 수 없다는 교시와 매우 일치하는 지질 프로필 이점(lipid profile benefit)으로 독립형 균주-특이적 프로바이오틱(standalone strain-specific probiotic)을 동정하는 것(identifying)에 있다. 인도 의학연구 위원회-생명공학기술과 (Indian Council of Medical Research-Department of Biotechnology, ICMR-DBT), "식품 내 프로바이오틱스의 평가에 대한 가이드라인(2011) [Guidelines for the evaluation of probiotics in food (2011)], 섹션 2.3; 및 섹션 3.1 하에서 "근거의 현황은 프로바이오틱 효과가 균주 특이적이라는 것을 시사한다. 균주 정체(Strain identity)는 균주를 특이적인 건강효과(health effect)에 연결하는 것과 정확한 감시(surveillance) 및 역학적 연구를 가능하게 하는 것에 중요하다"를 강조하는, 2002년 4월 30일 및 5월 1일, 캐나다, 온타리오주, 런던 소재에서의 식품 내 프로바이오틱스의 평가에 대한 가이드라인 초고작성(drafting)에 관한 공동 FAO/WHO 실무그룹 보고서 (Joint FAO/WHO Working Group Report)를 참고한다.
따라서, 본 발명의 본질적 목적은 신규하고 비-자명한 바실러스 코아귤런스의 저지질혈증 효과를 개시하는 것이다.
본 발명의 또 다른 본질적 목적은 바실러스 코아귤런스 MTCC 5856의 신규하고 비-자명한 콜레스테롤 동화 효과를 개시하는 것이다.
본 발명은 상기 목적들을 충족하고 추가의 관련 이점을 제시한다.
본 발명은 바실러스 코아귤런스 MTCC 5856의 저콜레스테롤혈증 잠재력 및 이의 치료학적/생물학적 적응증을 개시한다.
본 발명의 이점은 프로바이오틱 균주-특이적 지질 프로필 이점의 확인, 특히, 신규하고 비-자명한 바실러스 코아귤런스 MTCC 5856의 저콜레스테롤혈증 [콜레스테롤 동화(cholesterol assimilation)] 효과를 포함한다.
본 발명의 다른 특징 및 이점이 본 발명의 원리를 예시로서 도시하는 첨부된 도면과 함께, 다음의 더욱 상세한 설명으로부터 명백해질 것이다.
도 1은 우담즙(ox bile) (0.3%, w/v) 및 CaCO3 (0.1%, w/v)로 보충된 드 맨, 로고사 및 샤프 (de Man, Rogosa and Sharpe, MRS) 연한천(soft agar)을 이용한 담즙-염 가수분해효소 (Bile-Salt Hydrolase, BSH) 활성 측정에 대한 플레이트 검정법을 나타낸다. 플레이트 중 중공 구역(Hollow zone)은 바실러스 코아귤런스 MTCC 5856에 의한 담즙염 가수분해효소 활성의 지시(indication)였다.
도 2는 우담즙이 존재하는 경우에 측정된 콜레스테롤 감소에 대한 바실러스 코아귤런스 MTCC 5856 성장의 효과의 그래프 표현을 나타낸다.
도 3은 우담즙(0.3%, w/v)이 존재하는 경우에 측정된 콜레스테롤 제거(%)에 대한 바실러스 코아귤런스 MTCC 5856의 성장기 세포, 휴지기 세포 및 가열-살균된 (사멸된) 세포의 효과의 그래프 표현을 나타낸다.
도 4는 측정된, 상이한 식품 공급원(난황, 닭의 간, 및 버터)으로부터 콜레스테롤의 동화/감소에 대한 바실러스 코아귤런스 MTCC 5856의 효과의 그래프 표현을 나타낸다. *p< 0.05; (스튜던트 t 검정)
가장 바람직한 양태에서, 본 발명은 프로바이오틱 박테리아인 바실러스 코아 귤런스에 의해 콜레스테롤을 동화하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 상기 프로바이오틱 박테리아를 함유하는 조성물의 유효용량 요법을 포유동물에 투여하여, 상기 포유동물에서 콜레스테롤 감소의 효과를 초래하는 단계를 포함한다. 관련 양태에서, 바실러스 코아귤런스 균주는 바실러스 코아귤런스 MTCC 5856이다. 다른 바람직한 양태에서, 투여된 바실러스 코아귤런스는 영양세포 또는 포자이다. 또 다른 관련 양태에서, 포자는 바실러스 코아귤런스의 생포자 또는 가열-살균된 포자 또는 사멸된 포자를 포함한다. 또 다른 관련 양태에서, 영양세포는 바실러스 코아 귤런스의 생세포 또는 가열-살균된 세포 또는 사멸된 세포를 포함한다. 다른 관련 양태에서, 바실러스 코아귤런스는 정제, 캡슐제, 시럽제, 거미제, 파우더제, 현탁제, 에멀젼제, 츄어블제, 캔디제 및 식료품제의 형태로 경구투여된다. 다른 관련 양태에서, 바실러스 코아귤런스의 유효용량은 약 1Х106　내지 1Х1014　콜로니 형성 단위(colony forming unit, CFU)이다. 다른 관련 양태에서, 바실러스 코아귤런스의 유효용량은 바람직하게는, 2Х109　cfu이다. 다른 관련 양태에서, 상기 포유동물은 바람직하게는, 인간이다.
다른 바람직한 양태에서, 본 발명은 프로바이오틱 박테리아인 바실러스 코아 귤런스를 이용해, 담즙염 가수분해효소(bile salt hydrolase, BSH)를 생성하고 담즙염을 탈포합하는 방법에 관한 것이고, 상기 방법은 상기 프로바이오틱 박테리아를 함유하는 조성물의 유효용량 요법을 포유동물에 투여하여, BSH 생성 및 담즙염 탈포합의 목적하는 효과를 초래하는 단계를 포함한다. 관련 양태에서, 상기 프로바이오틱 박테리아인 바실러스 코아귤런스에 의한 BSH의 생성 및 담즙염의 탈포합은 포유동물에서 효과적인 콜레스테롤 감소를 야기한다. 관련 양태에서, 바실러스 코아귤런스 균주는 바실러스 코아귤런스 MTCC 5856이다. 다른 바람직한 양태에서, 투여되는 바실러스 코아귤런스는 영양세포 또는 포자이다. 또 다른 관련 양태에서, 포자는 바실러스 코아귤런스의 생포자 또는 가열-살균된 포자 또는 사멸된 포자를 포함한다. 또 다른 관련 양태에서, 영양세포는 바실러스 코아귤런스의 생세포 또는 가열-살균된 세포 또는 사멸된 세포를 포함한다. 다른 관련 양태에서, 바실러스 코아귤런스는 정제, 캡슐제, 시럽제, 거미제(gummies), 파우더제, 현탁제, 에멀젼제, 츄어블제(chewables), 캔디제 및 식료품제(eatables)의 형태로 경구투여된다. 다른 관련 양태에서, 바실러스 코아귤런 스의 유효용량은 약 1Х106　내지 1Х1014 cfu이다. 다른 관련 양태에서, 바실러스 코아귤런스의 유효용량은 바람직하게는, 2X109 cfu이다. 다른 관련 양태에서, 상기 포유동물은 바람직하게는, 인간이다.
또 다른 가장 바람직한 양태에서, 본 발명은 프로바이오틱 박테리아인 바실 러스 코아귤런스를 이용하여 포유동물에서 고콜레스테롤혈증(hypercholesterolemia)을 예방 또는 치료하는 방법에 관한 것이고, 상기 방법은 상기 프로바이오틱 박테리아를 함유하는 조성물의 유효용량 요법을 상기 포유동물에 투여하여, 상기 포유동물의 혈중 순환 콜레스테롤(circulating cholesterol in blood)의 수준을 저하시키는 효과를 초래하는 단계를 포함한다. 관련 양태에서, 바실러스 코아귤런스 균주는 바실러스 코아귤런스 MTCC 5856이다. 다른 바람직한 양태에서, 투여되는 바실러스 코아귤런스는 영양세포 또는 포자이다. 또 다른 관련 양태에서, 포자는 바실러스 코아귤런스의 생포자 또는 가열-살균된 포자 또는 사멸된 포자를 포함한다. 또 다른 관련 양태에서, 영양세포는 바실러스 코아귤런 스의 생세포 또는 가열-살균된 세포 또는 사멸된 세포를 포함한다. 다른 관련 양태에서, 바실러스 코아귤런스는 정제, 캡슐제, 시럽제, 거미제(gummies), 파우더제, 현탁제, 에멀젼제, 츄어블제(chewables), 캔디제 및 식료품제(eatables)의 형태로 경구투여된다. 다른 관련 양태에서, 바실러스 코아귤런스의 유효용량은 약 1Х106　내지 1Х1014 cfu이다. 다른 관련 양태에서, 바실러스 코아귤런스의 유효용량은 바람직하게는, 2Х109　cfu이다. 다른 관련 양태에서, 상기 포유동물은 바람직하게는, 인간이다.
또 다른 가장 바람직한 양태에서, 본 발명은 프로바이오틱 박테리아인 바실러스 코아귤런스를 이용하여 포유동물에서 이상지질혈증(dyslipidemia)을 치료학적으로 관리하는 방법에 관한 것이고, 상기 방법은 상기 프로바이오틱 박테리아를 함유하는 조성물의 유효용량 요법을 상기 포유동물에 투여하여, 혈중 순환 콜레스테롤의 수준을 저하시키고, 저밀도 지질 단백질(Low density lipoprotein) 및 저밀도 지질 단백질-콜레스테롤(Low density lipoprotein-cholesterol)의 농도를 감소시키며, 혈중 순환 트리글리세리드(circulating triglyceride in blood)의 수준을 저하시키는 효과를 초래하는 단계를 포함한다. 관련 양태에서, 바실러스 코아귤런스 균주는 바실러스 코아귤런스 MTCC 5856이다. 다른 바람직한 양태에서, 투여되는 바실러스 코아귤런스는 영양세포 또는 포자이다. 또 다른 관련 양태에서, 포자는 바실러스 코아귤런스의 생포자 또는 가열-살균된 포자 또는 사멸된 포자를 포함한다. 또 다른 관련 양태에서, 영양세포는 바실러스 코아귤런스의 생세포 또는 가열-살균된 세포 또는 사멸된 세포를 포함한다. 다른 관련 양태에서, 바실러스 코아귤런스는 정제, 캡슐제, 시럽제, 거미제(gummies), 파우더제, 현탁제, 에멀젼제, 츄어블제(chewables), 캔디제 및 식료품제(eatables)의 형태로 경구투여된다. 다른 관련 양태에서, 바실러스 코아귤런스의 유효용량은 약 1Х106　내지 1Х1014 cfu이다. 다른 관련 양태에서, 바실러스 코아귤런스의 유효용량은 바람직하게는, 2Х109　cfu이다. 다른 관련 양태에서, 상기 포유동물은 바람직하게는, 인간이다.
또 다른 가장 바람직한 양태에서, 이상지질혈증의 치료학적 관리는, 고콜레스테롤에 의해 유도된 죽상경화증(atherosclerosis), 관상동맥 질병(coronary artery disease), 간 지방증(hepatic steatosis) 및 관련된 비-알코올성 지방간 질병(associated non-alcoholic fatty liver disease), 당뇨병(diabetes mellitus) 및 비만(obesity)으로 이루어진 군으로부터 선택된 질병상태의 발병 전에 이를 예방하기 위해 수행된다.
다른 바람직한 양태에서, 본 발명은 프로바이오틱 박테리아인 바실러스 코아 귤런스에 의해 식품 중 콜레스테롤 함량을 감소시키는 방법을 개시하고, 상기 방법은 프리바이오틱 박테리아를 담즙염 및 담즙산과 함께, 콜레스테롤이 풍부한 음식과 접촉시켜, 상기 프로바이오틱 박테리아에 의해 상기 식품으로부터 콜레스테롤의 감소 및 동화를 초래하는 단계를 포함한다. 관련 양태에서, 바실러스 코아귤런스 균주는 바실러스 코아귤런스 MTCC 5856이다. 다른 관련 양태에서, 상기 콜레스테롤이 풍부한 음식은 닭의 간(liver), 난황(egg yolk), 어류 및 어유(fish oil), 패스트 푸드, 동물성 지방 및 기름, 해산물, 가공육, 적색육(red meat), 치즈, 유지방, 버터, 및 과자류(confectionery)로 이루어진 군으로부터 선택되나 이에 한정되지 않는다.
다음의 실례적인 실시예는 본 발명의 기술적 특징 및 이점을 이해하기 위해 포함된다.
[ 실시예 1: 바실러스 코아귤런스 MTCC 5856의 콜레스테롤 저하 활성의 시 험관내 추정]
방법론
담즙-염 가수분해효소 (Bile-Salt Hydrolase , BSH ) 활성
a) 플레이트 방법: 경미한 변형을 가한, Dashkevicz M.P., Feighner S.D. (1989): Development of a differential medium for bile salt hydrolase-active Lactobacillus spp. Applied and Environmental Microbiology, 55: 11-16; 및 Ahn, YT., G.B.Kim, K.S.Lim, Y.J.Baek, 및 H.U. Kim, "Deconjugation of bile salts by Lactobacillus acidophilus isolates", International Dairy Journal, vol. 13, no. 4, pp. 303-311, 2003;에 의해 기재된 방법에 따라서, BSH 활성에 대한 플레이트 검정법을 수행했다. 한천 (1%, w/v)을 MRS 브로쓰(broth)에 추가한 후에, 담즙염 (0.3% w/v; 우담즙), 및 CaCO3 (0.1%, w/v)로 보충하여 MRS 연한천(Soft MRS agar)을 제조했다. 이를 121°C에서, 15분 동안 고압 멸균시켰고(autoclaving), 플레이트를 제조하여 실온에서 건조시켰다. 18시간 동안 배양시킨 바실러스 코아 귤런스 MTCC 5856 (10 μl는 2 Х 106 cfu/ml에 해당)을 연한천에 천공을 만들어(puncturing), MRS 한천 상에 접종했다. 후속적으로, 플레이트를 37°C에서 72시간 동안 배양시켰다. 천공 주위의 명료하게 가시적인 할로(halo)는 바실러스 코 아귤런스 MTCC 5856의 양성 답즙염 가수분해효소 (BSH) 활성을 나타냈다. 이어서, 헤일로의 직경을 측정함으로써 결과를 평가했다. 담즙염이 없는 MRS 한천 상에서 성장시킨 바실러스 코아귤런스 MTCC 5856은 음성 대조군으로 이용했다. 측정은 3회 반복했다.
b) 박층 크로마토그래피(Thin Layer Chromatography, TLC) 방법: 바실러스 코아귤런스 MTCC 5856의 담즙염 가수분해효소 활성을 Guo C.F., Zhang l.W., Han X., Li J.Y., Du M., Yi H.X., Feng Z., Zhang Y.C., Xu X.R. (2011): Short communication: a sensitive method for qualitative screening of bile salt hydrolase-active lactobacilli based on thin-layer chromatography. Journal of Dairy Science, 94: 1732-1737에 의해 이전에 기술된, 다음의 TLC 플레이트 방법에 의해 확인했다. 바실러스 코아귤런스 MTCC 5856을 MRS 브로쓰 중에, 37°C에서, 18시간 동안 성장시킨 다음에, 8000 rpm, 4 °C에서 10분 동안 원심분리시켰다. 이어서, 세포 플레이트를 2 ml의 멸균 버퍼 (0.1 M PBS, pH 6.5)로 세척했다. 세척 후에, 5 ml의 버퍼 용액을 바실러스 코아귤런스 MTCC 5856의 세포 펠렛에 추가했다. 박테리아 현탁액 (1 ml)을 반응 믹스(1 ml)와 혼합시켰다. 반응 믹스는 포스페이트 버퍼(0.1 mol/l) 중에 MRS 브로쓰, 타우로데옥시콜레이트(taurodeoxycholate)의 소듐 염(TDC, 0.3% w/v)을 함유했는데, 이는 6.5의 최종 pH를 제공했다. 이어서, 균주를 37°C에서 8시간 동안 배양시켰다. 배양 후에, 샘플을 진공 증발시켰고(vacuum evaporating), 잔여물을 후속적으로, 1 ml의 에탄올에 용해시킨 후에 8,000 rpm에서 5분 동안 원심분리시켰다. 상등액을 실리카 TLC 플레이트(10 Х 10 cm, TLC 실리카 겔 60 F254; Merck 사) 상의 기초선(baseline)에 점을 찍었고(spotting), 마찬가지로, 메탄올 중 타우로데옥시콜레이트 (5 mmol/l), 메탄올 중 데옥시콜산(Deoxycholic acid) (5 mmol/l)인 표준 용액으로 점을 찍었다. 이동상은 이소아밀 아세테이트(isoamyl acetate), 프로피온산(propionic acid), n-프로판올 및 물을 40:30:20:10의 비율로 함유했다. 이동상은 30분 동안 TLC 플레이트를 따라 이동하는 것이 가능했다. 이어서, 플레이트를 건조시켰고, 10 % w/v의 에탄올 중 포스포몰리브덴산(phosphomolybdic acid) 용액을 분무한 후에, 80°C에서 5분 동안 열풍 오븐(hot air oven)을 이용해 건조시켰다. BSH 양성 바실러스 코아 귤런스 MTCC 5856에 의해, 데옥시콜산을 담즙염으로부터 유리시켰다(liberating). TLC의 결과를 표준과 비교하여 평가했다.
박테리아 성장 및 콜레스테롤 동화
콜레스테롤이 존재하는 경우의 바실러스 코아귤런스 MTCC 5856의 성장을 24시의 상이한 시간 간격에서 평가했다. 0.30%의 우담즙 및 100 μg/ml의 수-가용성 콜레스테롤 [폴리옥시에타닐콜리스테릴 세바케이트(polyoxyethanylcholesteryl sebacate)]로 보충된, 멸균된 MRS 브로쓰 배지에 바실러스 코아귤런스 MTCC 5856을 접종했다. 이어서, 이를 약하게 진탕시키며(100 rpm), 37°C에서 24시간 동안 배양시켰다. 상이한 시간 간격에서(0, 6, 12, 18 및 24시) 샘플을 수득했고, 박테리아 성장을 600 nm에서 UV-분광광도계(spectrophotometer) (Shimadzu UV-1601PC)를 이용하여 측정했다. 콜레스테롤 동화를 Rudel 및 Morris (1973)에 의해 기재된 방법 - Liong 및 Shah (2005)에 의해 제안된 약간의 변형을 수반하는 - 에 따라 측정했다. 배양 후에, 세포를 원심분리시켰고 (8,000 rpm, 4° C에서, 10분 동안), 상등액 중 잔여 콜레스테롤 농도를 분광광도계(Shimadzu UV-1601PC) 법을 이용하여 측정했다. 1ml의 분획에 1 ml의 KOH (33% w/v) 및 2 ml의 무수 에탄올(absolute ethanol)을 추가했고, 1분 동안 볼텍싱한 후에, 37°C에서 15분 동안 가열시켰다. 냉각 후에, 2 ml의 증류수 및 3 ml의 헥산을 추가하였고, 1분 동안 볼텍싱했다. 1ml의 헥산층을 유리 튜브로 옮겨 증발시켰다. 잔류물을 즉시, 2 ml의 o-프탈알데히드 시약(o-phthalaldehyde reagent) 중에 용해시켰다. 완전히 혼합시킨 후에, 0.5 ml의 농축 황산을 추가했고, 혼합물을 1분 동안 볼텍싱했다. Rudel LL, Morris MD. Determination of cholesterol using o-phthalaldehyde. J Lipid Res. 1973;14 (3):364-6에 기재된 대로, 10분 후에 550 nm에서 흡광도를 리딩했다. 모든 실험을 트리플리케이트(triplicate)로 수행했고 2회 반복했다. 콜레스테롤 저장 용액을 이용하여 작성된 표준 곡선으로 콜레스테롤 농도를 읽어냈다(reading off) (도 3). 콜레스테롤을 동화하는 바실러스 코아귤런스 MTCC 5856의 능력을 각 배양 간격에서 제거된 콜레스테롤의 백분율로 표현했고, 이는 다음과 같다:
콜레스테롤 동화/제거 (%) = 100 - [(발효 후 잔여 콜레스테롤/추가된 초기 콜레스테롤) Х 100].
바실러스 코아귤런스 MTCC 5856의 성장기 세포, 휴지기 세포 및 가열-살균된 (사멸된) 세포에 의한 콜레스테롤 제거/동화
바실러스 코아귤런스 MTCC 5856의 휴지기 세포 및 가열-살균된 (사멸된) 세포와 같은 비-성장기 세포에 의한 콜레스테롤을 동화/제거하는 능력을 측정했고, 성장기 세포와 비교했다. 휴지기 세포를 바실러스 코아귤런스 MTCC 5856을 MRS 배지 중에서 밤새 성장시켜 제조한 후에, 원심분리시켜(8,000 rpm, 4°C에서, 10분 동안), 세포 덩어리를 수득하였다. 이 세포 덩어리를 0.3% (w/v)의 우담즙 및 100 μg/ml의 수-가용성 콜레스테롤을 함유하는 멸균 포스페이트 버퍼(0.05 M, pH 6.5) 중에 추가로 현탁시킨 후에, 37 °C에서 24시간 동안 배양시켰다. 바실러스 코아귤런스 MTCC 5856을 MRS 배지 중에서 밤새 성장시켜 제조한 후에, 121 °C에서 15분 동안 고압 멸균시킴으로써, 가열-살균된 (사멸된) 세포를 제조하였다. 고압 멸균 후에, 세포를 원심분리에 의해 수집하였고(8,000 rpm, 4°C에서, 10분 동안), 0.3% (w/v)의 우담즙산(oxbile acid) 및 100 μg/ml의 수-가용성 콜레스테롤이 보충된 MRS 브로쓰 중에서 무균적으로(aseptically) 현탁시킨 후에, 24시간 동안 37 °C에서 배양시켰다. 성장기 세포를 바실러스 코아귤런스 MTCC 5856을 MRS 배지 중에서 밤새 성장시킴으로써 제조한 후에, 1 ml의 이 배양액을 0.3% (w/v)의 우담즙산 및 100 μg/ml의 수-가용성 콜레스테롤이 보충된 MRS 브로쓰에 추가한 후에, 37°C에서 24시간 동안 배양시켰다. 배양 후에, 모든 샘플을 원심분리시켰고(8,000 rpm, 4℃, 20분 동안), 상등액 중 콜레스테롤 농도를 상기 기재된 대로 분광 광도계를 이용한 비색법(Colorimetric method)에 따라서 측정했다. 모든 실험을 트리플리케이트로 수행했고, 2회 검정했다.
위 스트레스(gastric stress)하에서 바실러스 코아귤런스 MTCC 5856에 의한 상이한 음식 공급원으로부터 콜레스테롤의 동화
일부 변형을 수반하는, de Palencia PF, Lopez P,
Figure pct00001
Figure pct00002
Requena T. Probiotic strains: survival under simulated gastrointestinal conditions, in vitro adhesion to Caco-2 cells and effect on cytokine secretion. Eur Food Res Technol 2008; 227: 1475- 1484; 및 Ritter P, Kohler C, von Ah U. Evaluation of the passage of Lactobacillus gasseri K7 and Bifidobacteria from the stomach to intestine using a single reactor model. BMC Microbiol 2009; 9: 87-95에 의해 이전에 기재된 방법에 의해, 콜레스테롤이 풍부한 음식 공급원에 대한 바실러스 코아귤런스 MTCC 5856에 의한 콜레스테롤 동화의 효과를 조사했다. 알려진 중량의 난황, 버터 (우유 지방) 및 손질 및 가공된 닭의 간을 멸균 비커에 넣었다. 닭의 간을 물로 세척했고, 70% 에탄올에 30분 동안 침지시켰으며(soaking), 멸균 증류수로 린싱(rinsing)한 후에, 0.2 M 포스페이트 버퍼(pH 7.0)를 추가하여 균질화시켰다. 생체내 조건을 모방하기 위해, 모든 샘플을 10 ml의 멸균 전해질 용액(6.2 g/L NaCl, 2.2 g/L KCl, 0.22 g/L CaCl2 및 1.2 g/L NaHCO3) 및 리소자임(0.01%, Sigma-Aldrich) 및 펩신(0.3%, Sigma-Aldrich)에 추가했다. 1.0 mol/L의 HCl을 추가하여 샘플의 pH를 1.5로 감소시켰다. 바실러스 코아귤런스 MTCC 5856을 각 그룹에 추가했고, 37°C에서 약하게 진탕시키며(100 rpm) 3시간 동안 배양시켰다. 배양 후에, 각 샘플의 pH를 멸균 소듐 바이카보네이트 포화 용액(sterile sodium bicarbonate saturated solution) (8%, w/v)을 이용하여 7.0으로 무균적으로 조정했다. 산소 환원 효소인 옥시라제 (Oxyrase® for Broth, 미국, 오하이오주 소재의 Oxyrase Inc)를 각 플라스크에 추가하여 혐기성 환경(anaerobic environment)을 유도했다. 또한, 멸균 담즙염 (0.3%, w/v, Sigma Aldrich) 및 돼지(porcine)로부터의 판크레아틴(pancreatin)(0.1%, w/v, Sigma Aldrich)을 각 그룹에 추가했다. 0.45% 담즙염 및 0.1% 판크레아틴 (최종농도, 모두 Sigma Aldrich로부터 구입)을 함유하는 멸균 전해질 용액을 모든 샘플에 추가했다. 모든 샘플을 37°C에서 약하게 진탕시키며(100 rpm) 24시간 동안 배양시켰다. 배양 후에, 샘플을 원심분리시켰고 (8,000 rpm, 4°C에서, 10분 동안), 상기에 기재된 방법에 의해 콜레스테롤 함량을 상등액에서 평가했다.
결과:
바실러스 코아귤런스 MTCC 5856의 담즙염 가수분해효소 활성
바실러스 코아귤런스 MTCC 5856 성장을 우담즙 및 칼슘 카보네이트를 함유한 한천 플레이트 상에서 관찰했는데, 이는 담즙염 가수분해효소 활성이 존재하는 경우에 우담즙에 대한 이의 내성을 나타냈다. 연한천 플레이트에 18 mm의 투명환(clear zone)이 존재했는데(도 1), 이는 담즙염 가수분해효소의 존재를 나타냈다. 또한, 담즙염 가수분해효소 활성을, 민감도(sensitivity) 및 수용성(acceptability)을 더 갖는 TLC법에 의해 확인했다. 바실러스 코아귤런스 MTCC 5856에 의한 소듐 타우로데옥시콜레이트의 가수분해 및 데옥시콜산의 형성은 담즙염 가수분해효소의 생성을 명확히 제시한다. 표준 데옥시콜레이트에 대한 Rf 값은 0.89였는데, 이는 바실러스 코아귤런스 MTCC 5856과 함께 배양되는 경우에, 소듐 타우로데옥시콜레이트로부터 유리된 데옥시콜레이트의 Rf 값과 일치했다.
바실러스 코아귤런스 MTCC 5856에 의한 콜레스테롤의 동화/제거
바실러스 코아귤런스 MTCC 5856에 의한 콜레스테롤의 시간 의존적(time dependant) 동화/제거가 존재했다(도 2). 배양 24시간째에서, 콜레스테롤의 최대 제거를 관찰했고, 또한 최대 성장을 24시간째에서 관찰했다. 이는 바실러스 코아 귤런스 MTCC 5856의 성장/콜로니화(colonization)가 콜레스테롤의 동화/제거에 대한 원인이라는 것을 나타냈다. 또한, 상이한 농도의 콜레스테롤을 배지에 추가하여, 바실러스 코아귤런스 MTCC 5856과 함께 24시간 동안 우담즙(담즙염)의 존재하에 배양시켰다. 콜레스테롤의 시간 의존적 동화/제거가 인지되었다 (표 1). 그러나, 콜레스테롤의 최소 농도 (25 μg/ml) 또는 최대 농도 (200 μg/ml)와 관계없이 동화는 거의 동일했고, 콜레스테롤의 최대 동화/제거는 배양 24시간째에서 인지되었다 (표 1).
[표 1: 우담즙이 존재하는 경우에 콜레스테롤의 감소에 대한 바실러스 코아귤런스 MTCC 5856의 효과]
Figure pct00003
바실러스 코아귤런스 MTCC 5856의 비-성장기 세포에 의한 콜레스테롤의 동화/제거
성장기 또는 비-성장기(휴기기 또는 가열-살균 사멸된 세포)의 바실러스 코 아귤런스 MTCC 5856이 콜레스테롤을 제거하는 능력을 조사했다. 콜레스테롤의 제거는 24시에서 휴지기 세포(36.46%) 및 사멸된 세포(8.5%)에 비해, 성장기 세포(48.42%)에서 현저히 변했다 (도 3). 그러나, 휴지기 세포 및 가열-살균 사멸된 세포도 또한 콜레스테롤을 제거하는 것이 가능했다. 이는 바실러스 코아귤런스 MTCC 5856이 이의 성장기 또는 비-성장기 형태(휴지기 및 가열-살균 사멸된)에서 콜레스테롤을 동화/제거하는 능력을 갖는다는 것을 나타냈다.
콜레스테롤이 풍부한 음식에서 바실러스 코아귤런스 MTCC 5856에 의한 콜레스테롤의 동화/제거
바실러스 코아귤런스 MTCC 5856의 생체내 효능을 이해하려는 목적으로, 위 스트레스(산 및 담즙산) 하에서 난황, 닭의 간 및 버터와 같은 콜레스테롤이 풍부한 음식 공급원에서 콜레스테롤을 동화/제거하는 바실러스 코아귤런스 MTCC 5856의 효과를 조사했다. 바실러스 코아귤런스 MTCC 5856의 발효 24시간 후에, 콜레스테롤의 유의한 감소/동화를 모든 콜레스테롤이 풍부한 음식 공급원에서 관찰했다 (도 4). 바실러스 코아귤런스 MTCC 5856 발효 24시간 후에, 난황, 닭의 간 및 버터 중 콜레스테롤의 감소는 각각 39.79%, 45.14% 및 49.51%였다. 연구 데이터는 바실러스 코아귤런스 MTCC 5856이 생체내 모방 조건에서 음식 중 콜레스테롤을 동화/제거하는 능력을 가진다고 결론내렸으므로, 효능이 확인된 것이다.
[ 실시예 2: 바실러스 코아귤런스 MTCC 5856의 저지질혈증 효과 - 임상적 평가]
윤리(ETHICS)
기관 윤리 위원회(Institutional Ethics Committee)
연구 개시 전에, 모든 관련 연구 문서들은 방갈로르(Bangalore) 소재, 라이프 케어 호스피탈(Life Care Hospital)의 기관 윤리 위원회(Institutional Ethics Committee, IEC)에 의해 검토되었고, 호의적인 의견을 받았다. 이 IEC는 새미랩스 리미티드 또는 크린월드 프라이빗 리미티드(ClinWorld Private Limited) (CRO)와 독립적으로 기능하고, 운영은 연방 규정집 (Code of Federal Regulation, CFR)의 타이틀 21의 파트 56 및 국제 조화 위원회 (International Conference on Harmonization, ICH) 가이드라인을 준수한다. 상기 언급된 윤리 위원회는 CDSCO 하에 관보 공고번호(Gazette Notification Number) F.28-10/45-H(1)에 따라 1945년 12월 21일자로 등록되었고, 최종 수정되었다. 2012년 2월 08일자 공보번호 G.S.R. 76(E)을 참고.
연구의 윤리적 수행
본 연구는 인도의 1940년 의약품 및 화장품법(Drugs and Cosmetics Act); 인도의 1945년 의약품 및 화장품 규칙(Drugs and Cosmetics Rule); 인도 의학연구 위원회 (Indian Council of Medical Research, ICMR)의 2006년 인간 참여자에 관한 생물의학적 연구에 대한 윤리 가이드라인; 헬싱키 선언 (Declaration of Helsinki)에서 선언된 원칙 (2000년, 에든버러 소재); 및 ICH - 임상시험 실시기준 (Good Clinical Practice, GCP)에 관한 조화 3자 가이드라인 (harmonized tripartite guideline);에 의해 확립된 임상 연구 가이드라인에 따라서 수행되었다.
대상체 정보 및 동의(consent)
연구 지원자가 용이하게 이해 가능한 표현으로 기재된 연구에 대한 서면 및 구두 정보를 제공했다. 각 지원자는 스크리닝 전에 가능한 위험 및 이점을 비롯한 임상시험의 목적을 연구원에 의해 통지받았고, 통지된 동의 과정이 환자의 파일에 문서화되었다. 연구에 등록하기 전에 또는 임의의 연구에 관련된 절차의 개시 전에, 환자는 IEC 승인된, 통지된 동의 서식을 읽었고, 서명했으며, 날짜를 기입했다. 연구 참여 여부를 결정하기 위해, 각 대상체에 충분한 시간이 제공되었고, 환자가 만족하도록, 연구원은 연구에 대한 모든 질문 및 설명을 명백히 했다. 또한, 동의한 사람은 최종 동의 서식 페이지에 서명했고 날짜를 기입했다. 대상체의 연구에 대한 자발적인 참여는 연구자에 의해 근거노트(source note)로 문서화되었다. 원본의, 서명된 통지된 동의 서식은 연구의 목적, 수행될 절차, 및 필요한 경우에 잠재적 위험에 대해서 비-기술적인 용어로 요약되었다.
연구의 이론적 근거(STUDY RATIONALE)
지금의 임상 연구는 이상지질혈증을 앓고 있는 환자(n=30)에서 바실러스 코 아귤런스 MTCC 5856 (2 Х 109 cfu)의 효능 및 안정성을 평가하기 위해 계획되었다.
연구 목적
일차 목적
주요 목적은 이상지질혈증을 앓고 있는 환자에서 바실러스 코아귤런스 MTCC 5856의 효능을 평가하는 것이었다.
효능 결과
Figure pct00004
지질 프로필의 변화
Figure pct00005
삶의 질의 변화
이차 목적
이차 목적은 이상지질혈증을 앓고 있는 환자에서 바실러스 코아귤런스 MTCC 5856 (2 Х109 cfu)의 안정성을 평가하는 것이었다.
안정성 결과
Figure pct00006
이상반응(adverse event) 또는 심각한 이상반응에 대한 임의의 보고
Figure pct00007
비정상적 활력징후 & 연구실 파라미터(lab parameter)
연구 집단의 선택
모든 선정기준(inclusion criteria)에 대해서 "예"이고, 모든 제외기준(exclusion criteria)에 대해서 "아니오"라고 표시한 경우에, 대상체를 연구에 포함했다.
선정기준
선정기준은 다음을 포함했다:
1. 이상지질혈증을 앓고 있는 환자;
2. 30세 내지 65세의 연령;
3. 모집 전, 지난 2개월 동안 임의의 프로바이오틱을 섭취한 적 없음; 및
4. 연구 프로토콜을 준수하는 능력.
제외기준
제외기준은 다음을 포함했다:
1. 임신한 여성, 수유부(nursing mother) 또는 연구에서 피임에 할당되는 것을 동의하지 않은 대상체;
2. 급성 또는 만성 질병(예를 들어, 암 또는 류마티스 관절염)의 병력;
3. 모집 및 개입단계(intervention phase) 동안에 장 미생물의 생존도(viability)에 영향을 끼칠 수도 있는 스테로이드 또는 항생제와 같은 임의의 약제의 이용;
4. 지난 90일 동안 임상시험에 참여;
5. 혈액 샘플링에 대한 임의의 금기(contraindication); 및
6. 일일 식사에 요거트를 이용하는 환자.
치료 계획(TREATMENT LINE)
용량 투여 및 치료 요법
대상체는 90일의 기간 동안에 1일 1회 경구로, 2 Х 109 cfu를 함유하는 바실러스 코아귤런스 MTCC 5856의 캡슐 1개를 투여받았다.
사전요법(prior therapy) 및 병행요법(concomitant therapy)
임의의 약제가 이용된 이력을 도출하여 문서화했다. 또한, 연구 지속 동안에 이용된 임의의 기타 약제도 문서화했다. 대상체는 주기적으로 추적 관찰되었고, 스크리닝 시점으로부터 추적 관찰방문의 모든 병행투약을 캡쳐 및 기록하였고, 동반-이환(co-morbid) 및 병행 약제를 연구에서 캡쳐했다.
치료 준수
연구 약제의 준수를 각 방문마다 검토했다. 이 과제는 환자 질의(inquiry) 및 반환된 약제의 조사에 의해 수행되었다. 모든 의무 기록(accountability record)을 연구자의 연구 파일에 포함시켰다.
효능 및 안정성 변수의 평가에 대한 방법론
스크리닝으로부터 90일의 실험실 파라미터의 변화를 관찰했다. 스크리닝 시점에서 혈액 샘플(12.0 ml)이 원심분리 튜브에 수집될 것이다. 수집, 샘플 수송 및 처리는 연구실 메뉴얼에서 권고 및 명시된 대로 수행될 것이다.
다음을 평가했다:
혈액학(Hematology) [헤모글로빈, 농축세포 용적(Packed cell volume), 백혈구세포 계수(White blood cell count)-백혈구 감별 계수(differential leukocyte count), 평균 세포 용적, 평균 적혈구 색소량(Mean corpuscular hemoglobin), 평균 적혈구 헤모글로빈 농도(Mean corpuscular hemoglobin concentration), 평균 혈소판 용적(Mean platelet volume)];
완전한 지질 프로필 [저밀도 지질 단백질, 초저밀도 지질 단백질(Very low density lipoprotein), 고밀도 지질 단백질, 전체 콜레스테롤, 트리글리세리드]; 및
소변 임신 테스트(Urine Pregnancy test) - 폐경(menopause)에 이르지 않은 모든 여성들은 임신 테스트를 받을 것이다.
통계학적 방법
로 데이터(raw data); 및 기초선(baseline) 내지 연구 종료의 변화를 나타내는 기초선 값으로부터의 변화;의 요약 통계(summary statistics)를 제시함으로써 실험실 데이터를 요약했다. 연구에서 이용 및 수행된 통계학적 도구는 통계학적 분석 계획에서 상술될 것이고; 분석은 이를 따를 것이다. 나이와 같은 연속적 데이터(continuous data)의 경우, 기술 통계학(descriptive statistics) 평균, 최빈값(Mode), 중앙값(Median), Q1, Q3, IQR, 수염(Whisker), 95% CI 평균 및 95% CI가 제시되었다. 백분율, 빈도, 및 성별과 같은 범주형 데이터(categorical data)가 제시되었다. 간 프로필(liver profile), 항-산화 효소(바이오마커), 혈액학, 지질 프로필 및 삶의 질과 같은 모든 파라미터에 대해서, 질문지가 스크리닝 내지 4번째 방문에서 산출되었다. p 값을 스크리닝 내지 4번째 방문에서, QOL 분야에 대해서 측정했다. MINITAB에서 레벤 스케일 검정(Levene's scale Test)을 이용하여 p 값을 분석했다. 이들 점수를 평균 변화의 레벤 스케일에 대한 귀무가설(null hypothesis)의 방법을 이용한 다중 비교(multiple comparison) 및 2 표본 t-검정(two sample t-test)을 이용하여 획득했다. 제품의 효능의 분석은 지질 및 당뇨병 프로필에 대해서 추정되었으며, 이는 ANOVA 및 다중비교 t-검정 및 귀무가설의 방법을 통해 수행되었다. 평균 P-값 변화를 이러한 효능 파라미터에 대해서, 1번째 방문 내지 4번째 방문 - 프로토콜에서 0일째 내지 90일째로 권고됨 - 동안 관찰 및 계산하였다. 0일 내지 90일째의 혈액학 프로필과 같은 안전성 파라미터에 대해서, 평균 평균값 및 P 값을 t-검정 및 ANOVA를 통해 95% CI 평균으로 계산하였다. 인구학적 프로필 (demographic profile)의 경우, 평균 및 범위를 단순한 통계학적 방법에 의해 획득하였다.
안정성 평가
안정성에 대한 평가는 주로, 대상체에 의한 이상반응의 보고에 기초했다. 다른 안정성 데이터 (예, 활력징후, 실험실 테스트)를 숫자를 제시함으로써 요약했고, 이상반응은 발생하지 않았다. 연구실 데이터를 로 데이터; 스크리닝 값으로부터의 변화; 및 보통의 기준 한계(reference limit)에 상대적인 실험실 값의 스크리닝 내지 연구 종료의 변화를 나타내는 변화표(shift table);의 요약 통계를 제시함으로써 요약했다.
이상반응의 분석: 90일째에 임상 현장(clinical site)에 나타났고, 15일째까지 전화상으로 추적-관찰(telephonic follow-up)한 환자에 의해 보고된 이상반응은 존재하지 않았다.
죽음, 기타 심각한 이상반응, 및 기타 유의한 이상반응: 본 연구에서 인지된 심각한 이상반응 또는 유의한 이상반응은 존재하지 않았다.
결과
선정기준 및 제외기준에 대한 엄격한 구분을 준수하며, 총 30명의 대상체를 등록시켰다. 책임 연구원(Principal Investigator)과 연구팀은 프로토콜을 엄격히 따랐다. 연구의 전반적인 안정성 및 효능 파라미터를 평균값 변화 및 p 값에 기초하여 계산하였다. 연구의 효능 파라미터는 지질 프로필에 대해서 추정되었고, 안정성 파라미터는 혈액학 및 인구학적 프로필(demographic profile)과 같은 혈액 연구였다. 결과는 효능 파라미터에 대한 스크리닝 내지 90일 사이의 평균 변화로 정의되었다. 하기의 표는 환자의 스크리닝 방문 시 인구학적 데이터를 보고한다.
[표 3: 인구학적 데이터 - 스크리닝 방문]
Figure pct00008
Figure pct00009
안정성 평가
노출의 범위: 90일
이상반응의 간단한 요약
안정성 평가에 대해서, 본 연구에서 고려된 파라미터는 신체검사(physical examination), 활력징후, 즉, 혈압, 심박수, 맥박수 및 호흡수였다.
이상반응의 분석
스크리닝 내지 본 연구 종료의 생체, 실험실 파라미터 및 임상적 발견에 대해서, 통계학적으로 유의한 변화는 관찰되지 않았다.
환자 및 각각의 비정상적인 실험실 값에 의한 개별적인 실험실 측정의 목록
비정상적인 실험실 값은 관찰되지 않았다.
죽음, 기타 심각한 이상반응 및 기타 유의한 이상반응
본 연구에 등록된 환자들 중 그 누구도 임의의 심각하거나 또는 유의한 이상반응을 가지지 않았다. 본 연구에서 보고된 죽음은 없었다.
안정성 결론
스크리닝 방문 및 본 연구의 전 과정 동안에, 활력징후는 정상이었다. 통계학적으로 유의한 변화는 관찰되지 않았다. 안정성에 대한 임상적 유의성은 스크리닝 내지 연구 종료의 실험실 파라미터에 대해서 관찰되지 않았다.
표 4와 표 5는 스크리닝과 최종 방문에 대한 안정성 파라미터를 보고한다.
[표 4: 스크리닝 방문에 대한 안정성 파라미터 (혈액학)]
Figure pct00010
[표 5: 최종 방문에 대한 안정성 파라미터 (혈액학)]
Figure pct00011
효능 평가
총 콜레스테롤, LDL, TG 및 삶의 질과 같은 효능 파라미터에 대해서, 바실러 스 코아귤런스 MTCC 5856에 대한 평균 p 값 변화를 p≤0.05로 수득하였는데, 이는 바실러스 코아귤런스 MTCC 5856이 0일 내지 90일의 총 콜레스테롤, LDL, TG 및 삶의 질에 대한 통계학적으로 유의한 효과를 나타냈다는 것을 의미한다.
[표 6: 지질 프로필의 평균 변화]
Figure pct00012
[ 실시예 3: 바실러스 코아귤런스 를 함유하는 콜레스테롤 저하 조성물/제형]
표 7, 표 8, 및 표 9는 콜레스테롤을 낮추기 위한 바실러스 코아귤런스를 함유하는 음식 제형의 실례가 되는 예시를 제시한다.
[표 7: 뉴트리시리얼 프리믹스 ( NutriCereal Premix) (바닐라향)]
Figure pct00013
[표 8: 뉴트리시리얼 프리믹스 (딸기향)]
Figure pct00014
[표 9: 즉석 유제품 디저트 프리믹스 ]
Figure pct00015
표 10, 표 11, 및 표 12는 콜레스테롤을 낮추기 위한 바실러스 코아귤런스를 함유하는 영양의학적 제형의 실례적인 예시를 제시한다.
[표 10: 바실러스 코아귤런스 츄어블 정제 (콜레스테롤을 낮추기 위함)]
Figure pct00016
[표 11: 바실러스 코아귤런스 정제 (콜레스테롤을 낮추기 위함)]
Figure pct00017
[표 12: 바실러스 코아귤런스 캡슐제 (콜레스테롤을 낮추기 위함)]
Figure pct00018
상기에 기재된 제형은 단지 실례적인 예시이고, 상기 목적을 위해 의도된, 상기에 기재된 활성 성분을 함유하는 임의의 제형이 등가로 고려될 것이다.
본 발명이 바람직한 양태를 참고하여 기재되었으나, 통상의 기술자는 본 발명이 이에 한정되는 것이 아님을 명백히 이해할 것이다. 오히려, 본 발명의 범위는 첨부된 청구범위와 연계되어서만 해석되는 것이다.

Claims (41)

  1. 프로바이오틱 박테리아인 바실러스 코아귤런스(Bacillus coagulans)에 의해 콜레스테롤을 동화(assimilation), 흡수 및 제거하는 방법으로서, 상기 방법은 상기 프로바이오틱 박테리아를 함유하는 조성물의 유효용량 요법(effective dose regimen)을 포유동물에 투여하여, 상기 박테리아에 의해 상기 포유동물에서 콜레스테롤 제거/감소의 효과를 초래하는 단계를 포함하는 것인, 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    바실러스 코아귤런스 균주는 바실러스 코아귤런스 MTCC 5856인 것인, 방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 바실러스 코아귤런스는 영양세포(vegetative cell) 또는 포자의 형태로 투여되는 것인, 방법.
  4. 제1항에 있어서,
    포자는 바실러스 코아귤런스의 생포자(viable spore) 또는 가열-살균된 포자(heat-killed spore) 또는 사멸된 포자(dead spore)를 포함하는 것인, 방법.
  5. 제1항에 있어서,
    영양세포는 바실러스 코아귤런스의 생포자(viable spore) 또는 가열-살균된 포자(heat-killed spore) 또는 사멸된 포자(dead spore)를 포함하는 것인, 방법.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 바실러스 코아귤런스는 정제, 캡슐제, 시럽제, 거미제(gummies), 파우더제, 현탁제, 에멀젼제, 츄어블제(chewables), 캔디제 및 식료품제(eatables)의 형태로 경구투여되는 것인, 방법.
  7. 제1항에 있어서,
    바실러스 코아귤런스의 유효용량은 약 1Х106　내지 1Х1014 cfu인 것인, 방법.
  8. 제1항에 있어서,
    바실러스 코아귤런스의 유효용량은 바람직하게는, 2Х109　cfu인 것인, 방법.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 포유동물은 바람직하게는, 인간인 것인, 방법.
  10. 프로바이오틱 박테리아인 바실러스 코아귤런스를 이용해, 담즙염 가수분해효소(bile salt hydrolase)를 생성하고 담즙염을 탈포합하는(deconjugating) 방법으로서, 상기 방법은 상기 프로바이오틱 박테리아를 함유하는 조성물의 유효용량 요법을 포유동물에 투여하여, 담즙염 가수분해효소 생성 및 담즙염 탈포합의 목적하는 효과를 초래하는 단계를 포함하는 것인, 방법.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 프로바이오틱 박테리아인 바실러스 코아귤런스에 의한 담즙염 가수분해효소의 생성 및 담즙염의 탈포합은 포유동물에서 효과적인 콜레스테롤 감소를 야기하는 것인, 방법.
  12. 제10항에 있어서,
    바실러스 코아귤런스 균주는 바실러스 코아귤런스 MTCC 5856인 것인, 방법.
  13. 제10항에 있어서,
    투여된 바실러스 코아귤런스는 영양세포 또는 포자인 것인, 방법.
  14. 제10항에 있어서,
    포자는 바실러스 코아귤런스의 생포자 또는 가열-살균된 포자 또는 사멸된 포자를 포함하는 것인, 방법.
  15. 제10항에 있어서,
    영양세포는 바실러스 코아귤런스의 생세포 또는 가열-살균된 세포 또는 사멸된 세포를 포함하는 것인, 방법.
  16. 제10항에 있어서,
    상기 바실러스 코아귤런스는 정제, 캡슐제, 시럽제, 거미제(gummies), 파우더제, 현탁제, 에멀젼제, 츄어블제(chewables), 캔디제 및 식료품제(eatables)의 형태로 경구투여되는 것인, 방법.
  17. 제10항에 있어서,
    바실러스 코아귤런스의 유효용량은 약 1Х106　내지 1Х1014 cfu인 것인, 방법.
  18. 제10항에 있어서,
    바실러스 코아귤런스의 유효용량은 바람직하게는, 2X109 cfu인 것인, 방법.
  19. 제10항에 있어서,
    상기 포유동물은 바람직하게는, 인간인 것인, 방법.
  20. 프로바이오틱 박테리아인 바실러스 코아귤런스를 이용하여 포유동물에서 고콜레스테롤 혈증(hypercholesterolemia)을 예방 또는 치료하는 방법으로서, 상기 방법은 상기 프로바이오틱 박테리아를 함유하는 조성물의 유효용량 요법을 상기 포유동물에 투여하여, 상기 포유동물의 혈중 순환 콜레스테롤(circulating cholesterol in blood)의 수준을 저하시키는 효과를 초래하는 단계를 포함하는 것인, 방법.
  21. 제20항에 있어서,
    바실러스 코아귤런스 균주는 바실러스 코아귤런스 MTCC 5856인 것인, 방법.
  22. 제20항에 있어서,
    상기 바실러스 코아귤런스는 영양세포 또는 포자의 형태로 투여되는 것인, 방법.
  23. 제20항에 있어서,
    포자는 바실러스 코아귤런스의 생포자 또는 가열-살균된 포자 또는 사멸된 포자를 포함하는 것인, 방법.
  24. 제20항에 있어서,
    영양세포는 바실러스 코아귤런스의 생세포 또는 가열-살균된 세포 또는 사멸된 세포를 포함하는 것인, 방법.
  25. 제20항에 있어서,
    상기 바실러스 코아귤런스는 정제, 캡슐제, 시럽제, 거미제(gummies), 파우더제, 현탁제, 에멀젼제, 츄어블제(chewables), 캔디제 및 식료품제(eatables)의 형태로 경구투여되는 것인, 방법.
  26. 제20항에 있어서,
    바실러스 코아귤런스의 유효용량은 약 1Х106　내지 1Х1014 cfu인 것인, 방법.
  27. 제20항에 있어서,
    바실러스 코아귤런스의 유효용량은 바람직하게는, 2Х109　cfu인 것인, 방법.
  28. 제20항에 있어서,
    상기 포유동물은 바람직하게는, 인간인 것인, 방법.
  29. 프로바이오틱 박테리아인 바실러스 코아귤런스를 이용하여 포유동물에서 이상지질혈증(dyslipidemia)을 치료학적으로 관리하는 방법으로서, 상기 방법은 상기 프로바이오틱 박테리아를 함유하는 조성물의 유효용량 요법을 상기 포유동물에 투여하여, 혈중 순환 콜레스테롤의 수준을 저하시키고, 저밀도 지질 단백질(Low density lipoprotein) 및 저밀도 지질 단백질-콜레스테롤(Low density lipoprotein-cholesterol)의 농도를 감소시키며, 혈중 순환 트리글리세리드(circulating triglyceride in blood)의 수준을 저하시키는 효과를 초래하는 단계를 포함하는 것인, 방법.
  30. 제29항에 있어서,
    바실러스 코아귤런스 균주는 바실러스 코아귤런스 MTCC 5856인 것인, 방법.
  31. 제29항에 있어서,
    상기 바실러스 코아귤런스는 영양세포 또는 포자의 형태로 투여되는 것인, 방법.
  32. 제29항에 있어서,
    포자는 바실러스 코아귤런스의 생포자 또는 가열-살균된 포자 또는 사멸된 포자를 포함하는 것인, 방법.
  33. 제29항에 있어서,
    영양세포는 바실러스 코아귤런스의 생세포 또는 가열-살균된 세포 또는 사멸된 세포를 포함하는 것인, 방법.
  34. 제29항에 있어서,
    상기 바실러스 코아귤런스는 정제, 캡슐제, 시럽제, 거미제(gummies), 파우더제, 현탁제, 에멀젼제, 츄어블제(chewables), 캔디제 및 식료품제(eatables)의 형태로 경구투여되는 것인, 방법.
  35. 제29항에 있어서,
    바실러스 코아귤런스의 유효용량은 약 1Х106　내지 1Х1014 cfu인 것인, 방법.
  36. 제29항에 있어서,
    바실러스 코아귤런스의 유효용량은 바람직하게는, 2Х109　cfu인 것인, 방법.
  37. 제29항에 있어서,
    이상지질혈증의 치료학적 관리는, 고콜레스테롤에 의해 유도된 죽상경화증(atherosclerosis), 관상동맥 질병(coronary artery disease), 간 지방증(hepatic steatosis) 및 관련된 비-알코올성 지방간 질병(associated non-alcoholic fatty liver disease), 당뇨병(diabetes mellitus) 및 비만(obesity)으로 이루어진 군으로부터 선택된 질병상태의 발병 전에 이를 예방하기 위해 수행되는 것인, 방법.
  38. 제29항에 있어서,
    상기 포유동물은 바람직하게는, 인간인 것인, 방법.
  39. 프로바이오틱 박테리아인 바실러스 코아귤런스에 의해 식품 중 콜레스테롤 함량을 감소시키는 방법으로서, 상기 방법은 프리바이오틱 박테리아를 담즙염 및 담즙산과 함께, 콜레스테롤이 풍부한 음식과 접촉시켜, 상기 프로바이오틱 박테리아에 의해 상기 식품으로부터 콜레스테롤의 감소 및 동화를 초래하는 단계를 포함하는 것인, 방법.
  40. 제39항에 있어서,
    바실러스 코아귤런스 균주는 바실러스 코아귤런스 MTCC 5856인 것인, 방법.
  41. 제39항에 있어서,
    상기 콜레스테롤이 풍부한 음식은 닭의 간(liver), 난황(egg yolk), 어류 및 어유(fish oil), 패스트 푸드, 동물성 지방 및 기름, 해산물, 가공육, 적색육(red meat), 치즈, 유지방, 버터, 및 과자류(confectionery)로 이루어진 군으로부터 선택되나 이에 한정되지 않는 것인, 방법.
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