CN110205268B - 一株微杆菌及其在转化芦苇秸秆水解物制备微生物絮凝剂中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株微杆菌及其在转化芦苇秸秆水解物制备微生物絮凝剂中的应用，该微杆菌分类命名为解单端孢菌素微杆菌Microbacterium trichothecenolyticum BWL1091，保藏编号为CGMCC No.14436。制备微生物絮凝剂的步骤是：将菌株接种于种子液培养基中，37℃摇床培养制备种子液；将种子液按1％比例转接至以650mL/L芦苇秸秆水解物为唯一碳源的发酵培养基中，30℃恒温摇床培养；发酵液离心，收集上清液用作液体微生物絮凝剂；向液体微生物絮凝剂中加入2倍体积预冷的无水乙醇，离心收集沉淀物，冷冻干燥得到固体微生物絮凝剂。本发明的微杆菌可以耐受高浓度的芦苇秸秆水解物，同时可以利用芦苇秸秆水解物中丰富的还原糖作为唯一碳源发酵生产微生物絮凝剂，产量最高可以达到7.53g/L，生产工艺简单，成本低。

Description

一株微杆菌及其在转化芦苇秸秆水解物制备微生物絮凝剂中 的应用

技术领域

本发明涉及微生物絮凝剂领域，具体涉及一株微杆菌及其在转化芦苇秸秆水解物制备微生物絮凝剂中的应用。

背景技术

我国在农业生产过程中，产生的农业废弃物的量巨大，每年产生的各类秸秆等农业废弃物约6-7亿吨，主要用作农业废弃物还田，农村生活燃料，或作为动物饲料和造纸工业的原材料等，其余大部分多作为农业废弃物堆放在田间，造成严重的环境污染和生物质资源的浪费。这些农业废弃物中含有丰富的木质纤维素类物质，可以通过热酸水解获得还原糖，进而作为微生物的发酵碳源生产高附加值微生物代谢产品，变废为宝。

絮凝法是利用絮凝剂与水体中悬浮颗粒间发生理化作用，使不易沉降的细微颗粒凝集沉降，从而达到固液快速分离的目的。絮凝剂主要分为无机絮凝剂，如硫酸铝、聚合硫酸铁等；有机高分子絮凝剂，例如聚乙烯亚胺、聚丙烯酰胺等，以及天然高分子絮凝剂，如壳聚糖和微生物产生的微生物絮凝剂等。微生物絮凝剂是新型的第三代絮凝剂，是由微生物在生长过程中产生的具有絮凝活性的生物大分子物质，如多糖、蛋白质等，具有絮凝活性高，可生物降解，无二次污染，对pH波动不明感等优点。尤其是在安全性要求较高的领域具有独特的优势，如微藻采收和发酵工业的后处理等领域。然而目前微生物絮凝剂所占的市场份额还较低，主要是因为微生物絮凝剂需要发酵生产获得，由于纯糖等发酵碳源显著增加了微生物絮凝剂的生产成本，降低了微生物絮凝剂的市场竞争力，因此如何降低微生物产絮凝剂的生产成本成为目前急需解决的问题。

为了降低微生物絮凝剂的生产成本，寻找廉价的替代碳源成为研究的热点工作，例如利用含有高浓度有机物的废水作为培养基等。农业废弃物中含有丰富的木质纤维素类物质，可以在热酸条件下水解为还原糖，从而作为微生物发酵的廉价碳源生产微生物絮凝剂，例如，2013年，Wang等人利用230mL/L的水稻壳的热酸水解物作为菌株Ochrobactiumciceri W2的发酵碳源(Bioresource technology,2013,145:259-263)，产量达到2.4g/L；2016年，Liu等人利用300mL/L的花生壳的热酸水解物作为Pseudomonas veronii L918的培养基生产微生物絮凝剂(Bioresource technology,2016,218:318-325)，产量达到3.39g/L。然而农业废弃物的秸秆在热酸水解过程中会产生有毒副产物，如羟甲基糠醛，呋喃，阿魏酸和葡萄糖醛酸等物质，这些有毒副产物的产生会破坏细胞膜的稳定性，导致细胞结构元丢失，破坏了细胞体内pH稳定，抑制糖的摄取等，严重破坏了细胞的生长，干扰了微生物的代谢，最终抑制微生物絮凝剂的产生。因此为了降低对功能微生物的毒性，已有报道中所用的农业秸秆水解物的添加量都小300mL/L。

我国芦苇资源丰富，全国范围内有14个芦苇主产区，种植面积达到1.3×10⁶hm²，芦苇秸秆废弃物目前还没有得到有效利用，大多被用作畜禽饲料或者直接丢弃，造成资源浪费和环境污染。目前还没有关于利用芦苇秸秆水解物发酵生产微生物絮凝剂的报道。

发明内容

本发明的目的之一是提供一株微杆菌，可以用于转化高浓度芦苇秸秆水解物制备微生物絮凝剂。

本发明的目的之二是提供上述微杆菌在转化芦苇秸秆水解物制备微生物絮凝剂中的应用。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：一株微杆菌，分类命名为解单端孢菌素微杆菌Microbacterium trichothecenolyticum BWL1091，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2017年7月17日，保藏编号为CGMCC No.14436。

该菌株Microbacterium trichothecenolyticum BWL1091筛选自黑龙江省讷河市讷谟尔河的水体底泥中，其16S rRNA如SEQ ID No.1所示，序列长度为1346bp。

本发明还提供上述微杆菌在转化芦苇秸秆水解物制备微生物絮凝剂中的应用，具体步骤如下：

步骤1、将芦苇秸秆粉碎，用60目的网筛筛选后，按100g/L的浓度将芦苇秸秆粉加入到1.7％(W/W)的H₂SO₄溶液中，在121℃条件下水解120min，冷却后，离心，收集上清液，并用Ca(OH)₂调节pH至7.0，再次离心，收集上清液，得到芦苇秸秆水解物用作后续发酵培养基的碳源；

步骤2、将菌种Microbacterium trichothecenolyticum BWL1091接种到种子液培养基中，180rpm，37℃摇床培养18-20h，制备种子液；

步骤3、将步骤2获得的种子液按1％的比例转接到以芦苇秸秆水解物作为唯一碳源的发酵培养基中，180rpm，30℃恒温摇床培养48h，获得发酵液；

步骤4、将步骤3获得的发酵液在4℃的条件下离心，收集上清液获得液体微生物絮凝剂；

步骤5、向步骤4中获得的液体微生物絮凝剂中加入2倍体积预冷的无水乙醇，在4℃的条件下离心，收集沉淀，75％乙醇洗涤沉淀，并冷冻干燥得到固体微生物絮凝剂。

其中步骤2中所述的种子液培养基的组成成分为葡萄糖4g/L，酵母粉2g/L，七水硫酸镁0.2g/L，磷酸氢二钾1.2g/L，胰蛋白胨2g/L，淀粉2g/L，酸水解酪蛋白2g/L。

其中步骤3中所述的发酵培养基为芦苇秸杆水解物650mL/L、七水硫酸镁0.1g/L、磷酸氢二钾0.6g/L，胰蛋白胨3g/L，碳酸钠2g/L。

优选的，步骤1、步骤4和步骤5的离心转速为8000-10000rpm，离心10min。

本发明提供的菌株解单端孢菌素微杆菌Microbacterium trichothecenolyticumBWL1091生长速度快，发酵周期短；菌株Microbacterium trichothecenolyticum BWL1091可以耐受高浓度的芦苇秸秆水解物，同时可以利用芦苇秸秆水解物中丰富的还原糖作为唯一碳源发酵生产微生物絮凝剂，微生物絮凝剂产量高，产量最高可以达到7.53g/L，远高于同类的发酵工艺，从而资源化利用芦苇秸秆废弃物。除此之外，生产工艺相对简单，有利于进一步降低微生物絮凝剂生产成本，适于大规模生产及工业化应用，具有很好的应用前景。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步详细说明。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规的分子生物学方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1菌株的筛选、鉴定

从黑龙江省讷河市讷谟尔河的底泥采集样品，装至无菌自封袋中密封，带回实验室及时进行菌种分离。利用富集培养法和梯度稀释法分离筛选功能菌株，所述的富集培养基成分为：500mL/L稻壳水解物，酵母粉2g/L，七水硫酸镁0.2g/L，磷酸氢二钾1.2g/L，胰蛋白胨2g/L，酸水解酪蛋白2g/L。所述的分离纯化培养基为：葡萄糖4g/L，淀粉2g/L，酵母粉2g/L，七水硫酸镁0.2g/L，磷酸氢二钾1.2g/L，胰蛋白胨2g/L，酸水解酪蛋白2g/L。

菌株形态学鉴定：将菌种接种至LB固体平板上，30度培养24小时后，观察菌落形态，菌落呈圆形、湿润，菌体呈短杆状，革兰氏阳性；

16S rRNA基因测序分析：用LB液体培养基将菌体培养至对数生长期，取50μL菌液加入EP管中，10000rpm离心1min，弃上清；收集菌体加入50μL无菌水；将菌悬液沸水浴煮沸3min；然后再冰浴2min，再次沸水浴3min，冰浴2min；然后10000rpm离心1min，取1μL上清液作为扩增模板，制成50μL的PCR体系，引物分别为27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'(SEQID No.2)和1492R：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'(SEQ ID No.3)。PCR扩增条件为95℃1min；95℃10s，55℃30s，72℃1min，30个循环；72℃10min。扩增后得到的16S rRNA产物，经1％琼脂糖凝胶电泳检测后送至测序公司测序，测序结果如SEQ ID No.1所示，序列长度为1346bp。

将测得的16S rRNA序列在NCBI中进行BLAST比对分析，确定本发明所用菌种为微杆菌(Microbacterium trichothecenolyticum)，并将其命名为解单端孢菌素微杆菌Microbacterium trichothecenolyticum BWL1091，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.14436。

实施例2菌株Microbacterium trichothecenolyticum BWL1091在转化芦苇秸秆水解物制备微生物絮凝剂中的应用

具体步骤如下：

步骤1、将芦苇秸秆粉碎，用60目的网筛筛选后，按100g/L的浓度将芦苇秸秆粉加入到1.7％(W/W)的H₂SO₄溶液中，在121℃条件下水解120min，冷却后，8000-10000rpm离心10min，收集上清液，并用Ca(OH)₂调节pH至7.0，再次8000-10000rpm离心10min，收集上清液，得到芦苇秸秆水解物用作后续发酵培养基的碳源；

步骤2、将菌种Microbacterium trichothecenolyticum BWL1091接种到种子液培养基中，180rpm，37℃摇床培养18-20h，制备种子液；所述种子液培养基组分如下：葡萄糖4g/L，酵母粉2g/L，七水硫酸镁0.2g/L，磷酸氢二钾1.2g/L，胰蛋白胨2g/L，淀粉2g/L，酸水解酪蛋白2g/L；

步骤3、将步骤2获得的种子液按1％的比例转接到以芦苇秸秆水解物作为唯一碳源的发酵培养基中，180rpm，30℃恒温摇床培养48h，获得发酵液；所述发酵培养基为芦苇秸杆水解物650mL/L、七水硫酸镁0.1g/L、磷酸氢二钾0.6g/L，胰蛋白胨3g/L，碳酸钠2g/L；

步骤4、为了去除发酵液中的细胞和固体残留物，将步骤3获得的发酵液在8000-10000rpm，4℃的条件下，离心10min，收集上清液获得液体微生物絮凝剂；

步骤5、向步骤4中获得的液体微生物絮凝剂中加入2倍体积预冷的无水乙醇，8000-10000rpm，4℃的条件下，离心10min收集沉淀，75％乙醇洗涤沉淀，并冷冻干燥得到固体微生物絮凝剂。

产量最高可以达到7.53g/L，远高于同类的利用秸秆热酸水解物发酵生产生物絮凝剂的工艺。

絮凝活性测定：配制5g/L高岭土悬液60mL，向高岭土悬液中加入100μL液体微生物絮凝剂；快速搅拌2min，然后缓慢搅拌1min，静置1min。以加入100μL蒸馏水作为对照。收集上清液，用722型分光光度计测量上清液的OD₅₅₀值。絮凝率表示絮凝活性，絮凝率＝(A-B)/A×100％，其中A代表加蒸馏水时上清液的OD₅₅₀值，B代表加液体微生物絮凝剂时上清液的OD₅₅₀值。

经测量得到絮凝率达到95％以上，说明所获得的微生物絮凝剂对高岭土悬浊液具有明显的絮凝效果。

序列表

<110> 江苏师范大学

<120> 一株微杆菌及其在转化芦苇秸秆水解物制备微生物絮凝剂中的应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1346

<212> DNA

<213> 解单端孢菌素微杆菌(Microbacterium trichothecenolyticum)

<400> 1

gcttgcctct ggggatcagt ggcgaacggg tgagtaacac gtgagcaacc tgccccgatc 60

tctgggataa gcgctggaaa cggcgtctaa taccggatat gagcttccat cgcatggtgg 120

gggttggaaa gatttttcgg ttcgggatgg gctcgcggcc tatcagcttg ttggtgaggt 180

aatggctcac caaggcgtcg acgggtagcc ggcctgagag ggtgaccggc cacactggga 240

ctgagacacg gcccagactc ctacgggagg cagcagtggg gaatattgca caatgggcgc 300

aagcctgatg cagcaacgcc gcgtgaggga tgacggcctt cgggttgtaa acctctttta 360

gcagggaaga agcgatagtg acggtacctg cagaaaaagc gccggctaac tacgtgccag 420

cagccgcggt aatacgtagg gcgcaagcgt tatccggaat tattgggcgt aaagagctcg 480

taggcggttt gtcgcgtctg ctgtgaaaac ccgaggctca acctcgggcc tgcagtgggt 540

acgggcagac tagagtgcgg taggggagat tggaattcct ggtgtagcgg tggaatgcgc 600

agatatcagg aggaacaccg atggcgaagg cagatctctg ggccgtaact gacgctgagg 660

agcgaaaggg tggggagcaa acaggcttag ataccctggt agtccacccc gtaaacgttg 720

ggaactagtt gtggggtcct ttccacggat tccgtgacgc agctaacgca ttaagttccc 780

cgcctgggga gtacggccgc aaggctaaaa ctcaaaggaa ttgacgggga cccgcacaag 840

cggcggagca tgcggattaa ttcgatgcaa cgcgaagaac cttaccaagg cttgacatac 900

acgagaacac cctggaaaca ggggactctt tggacactcg tgaacaggtg gtgcatggtt 960

gtcgtcagct cgtgtcgtga gatgttgggt taagtcccgc aacgagcgca accctcgttc 1020

tatgttgcca gcacgtaatg gtgggaactc atgggatact gccggggtca actcggagga 1080

aggtggggat gacgtcaaat catcatgccc cttatgtctt gggcttcacg catgctacaa 1140

tggccggtac aaagggctgc aataccgtga ggtggagcga atcccaaaaa gccggtccca 1200

gttcggattg aggtctgcaa ctcgacctca tgaagtcgga gtcgctagta atcgcagatc 1260

agcaacgctg cggtgaatac gttcccgggt cttgtacaca ccgcccgtca agtcatgaaa 1320

gtcggtaaca cctgaagccg gtggcc 1346

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

agagtttgat cctggctcag 20

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ggttaccttg ttacgactt 19

Claims (5)

1.保藏编号为CGMCC No.14436的微杆菌Microbacterium trichothecenolyticumBWL1091在转化芦苇秸秆水解物制备微生物絮凝剂中的应用。

2.根据权利要求1所述的微杆菌在转化芦苇秸秆水解物制备微生物絮凝剂中的应用，其特征在于，具体步骤如下：

步骤1、将芦苇秸秆粉碎，用60目的网筛筛选后，按100 g/L的浓度将芦苇秸秆粉加入到1.7%（W/W）的H₂SO₄溶液中，在121℃条件下水解120 min，冷却后，离心，收集上清液，并用Ca(OH)₂调节pH至7.0，再次离心，收集上清液，得到芦苇秸秆水解物用作后续发酵培养基的碳源；

步骤2、将菌种Microbacterium trichothecenolyticum BWL1091接种到种子液培养基中，180 rpm，37℃摇床培养18-20 h，制备种子液；

步骤3、将步骤2获得的种子液按1%的比例转接到以芦苇秸秆水解物作为唯一碳源的发酵培养基中，180 rpm，30℃恒温摇床培养48 h，获得发酵液；

步骤4、将步骤3获得的发酵液在4℃的条件下离心，收集上清液获得液体微生物絮凝剂；

步骤5、向步骤4中获得的液体微生物絮凝剂中加入2倍体积预冷的无水乙醇，在4℃的条件下离心，收集沉淀，75%乙醇洗涤沉淀，并冷冻干燥得到固体微生物絮凝剂。

3.根据权利要求2所述的微杆菌在转化芦苇秸秆水解物制备微生物絮凝剂中的应用，其特征在于，步骤2中所述的种子液培养基的组成成分为葡萄糖4 g/L，酵母粉2 g/L，七水硫酸镁0.2 g/L，磷酸氢二钾1.2 g/L，胰蛋白胨2 g/L，淀粉2 g/L，酸水解酪蛋白2 g/L。

4.根据权利要求2所述的微杆菌在转化芦苇秸秆水解物制备微生物絮凝剂中的应用，其特征在于，步骤3中所述的发酵培养基为芦苇秸杆水解物650 mL/L、七水硫酸镁0.1 g/L、磷酸氢二钾0.6 g/L，胰蛋白胨3 g/L，碳酸钠2 g/L。

5.根据权利要求2所述的微杆菌在转化芦苇秸秆水解物制备微生物絮凝剂中的应用，其特征在于，步骤1、步骤4和步骤5的离心转速为8000-10000 rpm，离心10 min。